* Đánh giá chung về kết quả định lượng
Định lượng oxostephanin bằng HPLC trong các mẫu củ và lá bánh tẻ cho kết quả lần lượt là 0.065% và 0.873% [19]. Kết quả định lượng bằng HPTLC với mẫu củ dao động từ 0.05 đến 0.34%, mẫu thân lá bánh tẻ là khoảng 0.8%. Như vậy, nếu so sánh với phương pháp HPLC, kết quả định lượng bằng HPTLC không có sự khác biệt quá lớn. Ngoài ra, 2 phương pháp được tiến hành trên các đối tượng nghiên cứu khác nhau, quy trình chiết xuất và xử lý mẫu cũng không đồng nhất. Do đó, để kết luận chính xác nhất về sai số của kết quả định lượng bằng HPTLC, cần tiến hành
song song trên cùng đối tượng nghiên cứu và tất cả các bước trong quy trình định lượng.
*Sự thay đổi hàm lượng oxostephanin giữa các bộ phận khác nhau của cây
Hàm lượng oxostephanin trong các mẫu thân lá cao hơn hẳn các mẫu củ, đặc biệt là các mẫu thân lá non có thể gấp tới 5 lần mẫu củ. Như vậy, ngoài nguồn nguyên liệu củ vẫn đang được sử dụng, phần thân lá cũng là nguồn nguyên liệu rất đáng chú ý. Khai thác thân lá có nhiều ưu điểm so với củ vì có thể thu hái được quanh năm, đồng thời khi thu hái lá, cây vẫn sống, không mất cả cây như khi thu hái củ. Tuy nhiên, sinh khối của thân lá thấp hơn so với sinh khối củ, do đó, dù hàm lượng oxostephanin trong mẫu thân lá cao hơn, nhưng chưa thể kết luận chính xác tổng lượng oxostephanin thu được từ lá có cao hơn tổng lượng oxostephanin thu được từ củ hay không.
Thân lá non cho hàm lượng cao nhất, do đó có thể thu hái thân lá ngay từ giai đoạn thân non. Tuy nhiên sinh khối thân lá non thấp và nếu thu ngay từ giai đoạn non thì có thể ảnh hưởng không tốt tới sự phát triển của cây. Như vậy, cần có sự cân nhắc giai đoạn thu hái phù hợp để vừa đạt được mục tiêu hàm lượng, vừa đạt được năng suất cao.
*Sự thay đổi hàm lượng oxostephanin giữa các năm tuổi.
Hàm lượng oxostephanin trong các mẫu củ của cây trồng từ hom 1 và 2 tuổi lần lượt là 0.1625% và 0.3077%, nhưng đến tuổi trưởng thành thì hàm lượng này có sự giảm nhẹ, còn 0.2829%. Quy luật này tương đối giống với khả năng tích lũy alkaloid toàn phần và rotundin trong các mẫu củ của loài [11]. Như vậy, có thể ở độ tuổi 2 năm, củ có mức hàm lượng gần ổn định và không tiếp tục tăng. Cần nghiên cứu định lượng thêm mẫu 3 tuổi để so sánh hàm lượng oxostephanin và xác định thời điểm thu hái phù hợp.
Đối với các cây trồng từ hạt, hàm lượng oxostephanin lại có chiều hướng giảm dần ở các năm. Để có kết luận chính xác nhất về biến động hàm lượng oxostephanin trong các mẫu củ theo thời gian, cần tiếp tục nghiên cứu trên lượng mẫu lớn hơn
cũng như thêm các mẫu ở độ tuổi lớn hơn để xác định chính xác nhất quy luật tích lũy hoạt chất trong cây.
*Sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây trồng từ hạt và cây trồng từ hom.
Oxostephanin tích lũy trong các cây từ hạt cao hơn so với các mẫu cây từ hom. Đồng thời, việc trồng cây từ hạt là tuân theo sự phát triển của tự nhiên, cây trồng khỏe mạnh, khả năng thích nghi cao. Như vậy, trồng cây từ hạt có nhiều ưu thế về hàm lượng oxostephanin và sự phát triển ổn định của cây.
Tuy nhiên việc nhân giống vô tính có nhiều ưu điểm hơn so với nhân giống hữu tính, nguồn nguyên liệu tạo giống ban đầu là thân có thể thu hoạch quanh năm, không phụ thuộc vào thời gian và năng suất cho quả của cây. Đồng thời khi theo dõi ở cây 1 tuổi, các mẫu củ của cây từ hom lại phát triển nhanh hơn các mẫu củ của cây từ hạt. Vì vậy, tuy khả năng tích lũy oxostephanin trong các mẫu cây từ hom là thấp hơn so với cây trồng từ hạt nhưng phát triển theo phương pháp nhân giống vô tính có tính khả thi cao.
*Sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây theo các mùa khác nhau
Hàm lượng oxostephanin trong các mẫu củ theo mùa cao ở mùa thu và mùa đông, giảm xuống gần 5 lần ở mùa xuân và mùa hè. Điều này có thể có liên hệ với điều kiện thực tế là mùa xuân và mùa hè là thời điểm ra hoa, kết quả của cây, cây phải tập trung dinh dưỡng cho phát triển các bộ phận này. Như vậy, để vừa có thể thu hái quả và hạt, vừa muốn đạt mục tiêu năng suất, nên thu hái củ vào mùa đông và mùa thu. Tuy nhiên, nghiên cứu chỉ mới tiến hành khảo sát sự thay đổi hàm lượng oxostephanin ở những mẫu trưởng thành và theo 4 tháng trong năm. Cần tiến hành nghiên cứu thêm ở các tháng trong năm với các cây cùng độ tuổi.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
*Đã xây dựng và thẩm định quy trình định lượng oxostephanin bằng HPTLC, cụ thể như sau:
- Hệ dung môi chiết xuất nguyên liệu là MeOH, phương pháp chiết ngấm kiệt.
- Hệ dung môi triển khai bản mỏng là CHCl3 : MeOH (9:1).
- Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC và chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn, khoảng nồng độ tuyến tính của mẫu chuẩn là từ 0.01 đến 0.27 mg/ml.
- Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ đặc hiệu và độ thích hợp, độ đúng của phương pháp đạt yêu cầu theo quy định.
*Đã định lượng và so sánh được hàm lượng oxostephanin trong các mẫu nghiên cứu:
- Các mẫu thân lá có hàm lượng cao hơn mẫu củ, mẫu thân lá non có hàm lượng cao nhất, từ 0.7 đến 1.7%, thấp nhất là các mẫu củ, khoảng 0.1 đến 0.34%.
- Hàm lượng trong các mẫu củ của cây từ hom cao nhất ở cây 2 tuổi (0.3077%); trong các cây từ hạt thì hàm lượng giảm 1.5 lần từ 1 tuổi đến 2 tuổi, giảm xuống thấp nhất ở cây trưởng thành.
- Hàm lượng trong các mẫu củ mùa đông (0.3392%) và mùa thu (0.2773%) cao hơn các mẫu mùa xuân (0.0573%) và mùa hè (0.0671%).
- Hàm lượng oxostephanin tích lũy trong các mẫu cây trồng từ hạt lớn hơn trong cây trồng từ hom. Kết quả so sánh các cặp mẫu cho trị số p < 0.05.
KIẾN NGHỊ
Trên đây là các kết quả bước đầu mà chúng tôi đạt được trong điều kiện, thời gian và khả năng cho phép. Để tiếp tục thực hiện đề tài, chúng tôi kiến nghị:
-Tiến hành nghiên cứu trên lượng mẫu lớn hơn để tăng độ tin cậy của kết quả.
-Tiếp tục theo dõi sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong các mẫu cây theo số năm tuổi lớn hơn.
-Nghiên cứu sâu hơn về sự thay đổi hàm lượng oxostephanin theo các tháng trong năm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, tập 2.
2. Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang và nhận biết các họ thực vật hạt kín ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, tr.10-15.
3. Đỗ Huy Bích (1995), Thuốc từ cây cỏ và động vật, NXB Y học, tr.40.
4. Bộ môn Dược liệu (ĐH Dược Hà Nội) (2004), Bài giảng dược liệu, NXB Y học, tập 2.
5. Bộ môn Dược liệu (ĐH Y Dược TP.Hồ Chí Minh) (T9/2006), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, NXB Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
6. Bộ môn Thực vật Dược (2007), Thực vật học, NXB Y học.
7. Bộ môn Thực vật Dược (ĐH Dược Hà Nội) (1997), Thực vật Dược – phân loại thực vật, NXB Y học.
8. Bộ Y tế (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, NXB Y học, tập 1.
9. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr. 95- 97, 326-327, 385-386, 388-389, 895-896, 1439.
10. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tập II, tr. 2334-2340.
11. Nguyễn Linh Chi (2010), Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học và thăm dò khả năng tái sinh, phát triển của loài Stephania dielsiana Y.C.Wu, khóa luận tốt nghiệp thạc sĩ khóa 2009 – 2010, Trường ĐH Dược Hà Nội.
12. Nguyễn Chiều (1982), “Nghiên cứu xác định tên cây củ dòm”, Dược học, số 1, tr. 15-17.
13. Nguyễn Chiều, Ngô Văn Trại (1986), “Nghiên cứu cây bình vôi ở Việt Nam”,
Dược học, số 4, tr 10-12.
14. Chương trình phát triển nguồn nhân lực y tế (2014), Ứng dụng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao trong phân tích dược liệu, ĐH Dược Hà Nội.
15. Nguyễn Thị Thu Hằng (2012), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền và định lượng Berberin của một số loài thuộc chi Berberin L. ở Việt Nam, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 2007 – 2012, Trường ĐH Dược Hà Nội.
16. Đặng Văn Hòa, Vĩnh Định (2011), Kiểm nghiệm thuốc, NXB Giáo dục Việt Nam.
17. Nguyễn Quốc Huy (2010), Nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học, một số tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi Stephania Lour. ở Việt Nam,
luận án tiến sĩ dược học, ĐH Dược Hà Nội.
18. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học. 19. Nguyễn Vũ Minh, Nguyễn Quốc Huy, Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Đức Toàn,
oxostephanin trong củ dòm (Stephania dielsiana Y. C. Wu) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Tạp chí dược học, số 457, tr.54.
20. Nguyễn Vũ Minh, Nguyễn Quốc Huy, Phạm Thanh Kỳ, Trương Đức Mạnh, Ngô Văn Tuyên, Hoàng Văn Thủy, Trần Việt Hùng (2014), “Nghiên cứu thiết lập chất đối chiếu oxostephanin dùng trong kiểm nghiệm và nghiên cứu dược liệu củ dòm (Stephanina dielsiana Y. C. Wu)”, Tạp chí dược học, số 456, tr.63-66.
21. Nguyễn Vũ Minh, Nguyễn Quốc Huy, Phạm Thanh Kỳ, Trần Việt Hùng (2014), “Phân lập và xác định cấu trúc Thailandine từ thân và lá loài bình vôi
Stephania dielsiana Y. C. Wu”, Tạp chí dược học, số 454, tr. 26-29.
22. Lã Đình Mỡi, Trần Minh Hợi,Dương Đức Huyến, Trần Huy Thái, Ninh Khắc Bản (2005), "Chi Bình vôi - Stephania Lour. 1790", Tài nguyên thực vật Việt Nam (Những cây chứa các hoạt chất có hoạt tính sinh học), tập I, tr. 58-82. 23. Lã Đình Mỡi (Chủ nhiệm đề tài) (2002), Nghiên cứu các cơ sở khoa học và
công nghệ để bảo vệ, gây trồng, phát triển, khai thác, chế biến và sử dụng lâu bền các loài bình vôi theo hướng sản xuất hàng hoá ở nước ta, Đề tài NCKH - Công nghệ cấp Trung tâm, Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia - Viện tài nguyên sinh vật, Hà Nội.
24. Sách đỏ Việt Nam (2007), NXB. Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Phần II. 25. Nguyễn Văn Tuấn (2007), Phân tích số liệu và tạo biểu đồ bằng R: Hướng
dẫn thực hành, NXB Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh.
26. Viện dược liệu (1973), Sắc ký lớp mỏng ứng dụng trong phân tích hóa thực vật, NXB Y học.
27. Viện dược liệu (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, NXB KH và KT, Hà Nội, tr. 82-91.
28. Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2012), Khóa đào tạo thẩm định quy trình phân tích SKLM và HPLC trong thuốc đông dược.
Tài liệu tiếng Anh
29. Harish C.Andola, R.S.Rawal, M.S.M.Rawal (2010), “Analysis of Berberin Content using HPTLC fingerprinting of Root and Bark of three Himalayan Berberin Species”, Asian Journal of Biotechnology, pp 240 - 243.
30. Camag laboratory (2009), General methodology for HPTLC, version 4.
31. Grundon M. F., Crout D. H. G. (1977), A Specialist Periodical Report, Alkaloids, Chemical society Burlington House, Lon Don, vol. 7.
32. Guinaudeu et al (1994), Journal of Natural products, vol. 57, No.8, pp. 1053- 1135.
33. Blanchfield Joanne T., Sands Donald P. A., Kennard Colin H. L., Byriel Karl A., (2003), "Characterisation of alkaloids from some Australian Stephania species (Menispermaceae)", Phytochemistry, vol. 63, pp. 711-720.
34. Bartley John P., Baker Luke T. and Carvalho Chis F. (1994), “Alcaloid of
Stephania bancroftii" , Phytochemistry, vol. 36, No.5, pp. 1327-1331.
35. Wirasathien Latila, Boonarkart Chompunuch, Pengsuparp Thitime, and Suttisri Rutt (2006), "Biological activities of alcaloid from Pseudovaria setosa", Pharmaceutical Biology, vol. 44, No.4, pp. 274-278.
36. Gerda Morlock , Workshop Planar Chromatography, Institute of Food Chemistry University of Hohenheim Stuttgart, Germany, Part I, II.
37. Pyne Stephen G., and Dikic Branko (1990), "Diastereoselective Additions of (R)-(+)- Methyl p-Tolyl Sulfoxide Anion to Imines. Asymmetric Synthesis of (R)-(+)- Tetrahydropalmatine", J. Org. Chem., 55, pp. 1932-1936.
38. Tanahashi T., Su Y., Nagakura N., and Nayeshiro H. (2000), "Quaternary Isoquinoline alkaloids from Stephania cepharantha", Chem. Pharm. Bull., 48, pp. 370-373.
Tài liệu trên Internet
39. http://www.camag.com/en/home.cfm
40. http://www.hup.edu.vn/cacbomon/bmtv/noidung/Documents/Xay_dung_De_a n_Vuon_cay_thuoc_quoc_gia_Yen_Tu.pdf
PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: DANH SÁCH MẪU THỬ
PHỤ LỤC 2: SẮC KÝ ĐỒ Ở BƯỚC SÓNG 366NM CỦA MẪU CHUẨN VÀ
MẪU THỬ TẠI CÁC HỆ DUNG MÔI KHÁC NHAU
PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU CHUẨN OXOSTEPHANIN
VÀ CÁC MẪU 1 TUỔI, 2 TUỔI, TRƯỞNG THÀNH VÀ THEO MÙA Ở BƯỚC SÓNG 366 NM
PHỤ LỤC 4: NỒNG ĐỘ MẪU THỬ (mg/ml) PHỤ LỤC 5: PIC SẮC KÝ CỦA CÁC MẪU
PHỤ LỤC 6: BIỂU SO SÁNH VÀ KHOẢNG TIN CẬY 95% XỬ LÝ SỐ LIỆU BẰNG PHẦN MỀM R
PHỤ LỤC 1: DANH SÁCH MẪU THỬ STT Ký hiệu Mẫu 1 A1 1 tuổi Từ hạt Củ 2 A2 Thân lá non 3 A3 Thân lá bánh tẻ 4 A4 Thân lá già 5 B1 Từ hom Củ 6 B2 Thân lá non 7 B3 Thân lá bánh tẻ 8 B4 Thân lá già 9 C1 2 tuổi Từ hạt Củ 10 C2 Thân lá non 11 C3 Thân lá bánh tẻ 12 C4 Thân lá già 13 D1 Từ hom Củ 14 D2 Thân lá non 15 D3 Thân lá bánh tẻ 16 D4 Thân lá già 17 E1 Trưởng Từ hạt Củ
STT Ký hiệu Mẫu 18 E2 thành Thân lá non 19 E3 Thân lá bánh tẻ 20 E4 Thân lá già 21 F1 Từ hom Củ 22 F2 Thân lá non 23 F3 Thân lá bánh tẻ 24 F4 Thân lá già 25 K1 Củ từ cây trồng từ hạt theo mùa T2/14 26 K2 T6/2013 27 K3 T8/2013 28 K4 T11/2013
PHỤ LỤC 2:
SẮC KÝ ĐỒ Ở BƯỚC SÓNG 366NM CỦA MẪU CHUẨN VÀ MẪU THỬ TẠI CÁC HỆ DUNG MÔI KHÁC NHAU
PHỤ LỤC 3:
HÌNH ẢNH SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU CHUẨN OXOSTEPHANIN VÀ CÁC MẪU 1 TUỔI, 2 TUỔI, TRƯỞNG THÀNH VÀ THEO MÙA Ở BƯỚC SÓNG 366 NM
PHỤ LỤC 4:
NỒNG ĐỘ MẪU THỬ (mg/ml)
STT Mẫu lượng(g) Khối ẩm(%) Hàm Nồng độ (mg/ml)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 A1 2,0071 8,17 0,065 0,061 0,061 2 A2 2,0020 6,13 0,275 0,296 0,287 3 A3 2,0006 5,89 0,163 0,162 0,160 4 A4 2,0011 5,98 0,080 0,073 0,078 5 B1 2,0035 8,50 0,030 0,028 0,032 6 B2 2,0137 6,03 0,250 0,256 0,257 7 B3 2,0071 5,78 0,144 0,139 0,147 8 B4 2,0038 6,29 0,090 0,075 0,087 9 C1 2,0038 9,04 0,039 0,038 0,033 10 C2 2,0147 6,35 0,163 0,157 0,154 11 C3 2,0071 5,67 0,153 0,149 0,144 12 C4 2,0233 6,05 0,067 0,061 0,058 13 D1 2,0045 8,78 0,059 0,056 0,053 14 D2 2,0135 5,81 0,150 0,152 0,147 15 D3 2,0017 6,68 0,141 0,138 0,142 16 D4 2,0039 5,58 0,103 0,099 0,033 17 E1 2,0589 9,15 0,021 0,020 0,033 18 E2 2,0080 6,05 0,208 0,213 0,154 19 E3 2,0009 5,51 0,088 0,089 0,144 20 E4 2,0047 6,59 0,077 0,081 0,058 21 F1 2,0100 9,06 0,052 0,053 0,053 22 F2 2,0076 6,93 0,341 0,319 0,147 23 F3 2,0213 5,94 0,142 0,144 0,142 24 F4 2,0098 6,17 0,112 0,113 0,096 25 K1 2,0012 8,99 0,007 0,019 0,005 26 K2 2,0070 10,06 0,012 0,014 0,010 27 K3 2,0161 8,09 0,045 0,065 0,043 28 K4 2,0049 9,04 0,063 0,064 0,061
PHỤ LỤC 5:
PIC SẮC KÝ CỦA CÁC MẪU
STT Mẫu 1 Chuẩn oxostephanin 0.01 mg/ml 2 Chuẩn oxostephanin 0.03 mg/ml 3 Chuẩn oxostephanin 0.09 mg/ml 4 Chuẩn oxostephanin 0.135 mg/ml 5 Chuẩn oxostephanin 0.18 mg/ml 6 Chuẩn oxostephanin 0.27 mg/ml 7 1 tuổi Từ hạt Củ 8 Thân lá non 9 Thân lá bánh tẻ 10 Thân lá già 11 Từ hom Củ 12 Thân lá non 13 Thân lá bánh tẻ 14 Thân lá già 15 2 tuổi Từ hạt Củ 16 Thân lá non 17 Thân lá bánh tẻ 18 Thân lá già
STT Mẫu 19 Từ hom Củ 20 Thân lá non 21 Thân lá bánh tẻ 22 Thân lá già 23 Trưởng thành Từ hạt Củ 24 Thân lá non 25 Thân lá bánh tẻ 26 Thân lá già 27 Từ hom Củ 28 Thân lá non 29 Thân lá bánh tẻ 30 Thân lá già 31 Củ từ cây trồng từ hạt theo mùa