Tính toán và xử lý thống kê kết quả hàm lượng các mẫu bằng Excel và phần mềm R (phần mềm sử dụng cho phân tích thống kê và vẽ biểu đồ) với 2 phân tích thống kê là phân tích phương sai ANOVA và phân tích hậu định Tukey [25]. Một số công thức sử dụng trong tính toán thống kê:
Bậc tự do
Giá trị trung bình
Tổng bình phương (Sum of square)
Bình phương trung bình (Mean of square)
Trị số F F – value =
Trong đó:
MSB: tổng bình phương giữa các nhóm MSW: tổng bình phương trong các nhóm.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
3.1.1. Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPTLC
3.1.1.1. Xử lý mẫu thử:
Thực hiện xử lý mẫu thử như ở phần 2.2.2.1 thu được kết quả như sau: *Lựa chọn độ pha loãng phù hợp cho dung dịch thử:
Hình 3.1. Sắc ký đồ tại độ pha loãng 50 lần
Hình 3.2. Sắc ký đồ tại độ pha loãng 100 lần
Chú ý:
Oxo: chuẩn oxostephanin
Củ: mẫu củ cây 1 tuổi trồng từ hạt TL1: mẫu thân lá non cây 1 tuổi từ hạt TL2: mẫu thân lá bánh tẻ cây 1 tuổi từ hạt TL3: mẫu thân lá già cây 1 tuổi từ hạt.
Tại độ pha loãng 50 lần, vết oxostephanin khá to, bị kéo và vết ở vị trí chấm chưa được kéo lên hết. Độ pha loãng 100 lần cho vết oxostephanin gọn, đều hơn, không còn vết ở vị trí chấm mẫu. Vì vậy lựa chọn độ pha loãng 100 lần để pha các mẫu thử là phù hợp.
3.1.1.2. Lựa chọn khoảng nồng độ của dãy dung dịch oxostephanin chuẩn
Xây dựng đường chuẩn định lượng từ 3 dãy dung dịch đã chuẩn bị ở mục 2.2.2.1, thu được kết quả như sau:
Hình 3.3. Đường chuẩn xây dựng được từ dãy chuẩn 1
Hình 3.4. Đường chuẩn xây dựng được từ dãy chuẩn 2
Đường chuẩn định lượng của dãy chuẩn thứ nhất và thứ hai vẫn còn các điểm nồng độ nằm ngoài khoảng giới hạn. Đường chuẩn thứ ba có tất cả các điểm nồng độ nằm trong khoảng giới hạn. Vì vậy chúng tôi lựa chọn dãy nồng độ thứ ba với các nồng độ 0.01, 0.03, 0.09, 0.135, 0.18, 0.27 mg/ml để xây dựng đường chuẩn định lượng các mẫu thử.
3.1.1.3. Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC
* Hệ dung môi khai triển:
Triển khai sắc ký trên 5 hệ dung môi đã trình bày (phụ lục 2), kết quả như sau:
Hệ thứ 1, 2, 3, 4: các vết tách không rõ, bị kéo vết.
Hệ thứ 5: vết tách tròn gọn, không bị kéo vết, vết oxostephanin phát quang rõ dưới ánh sáng tử ngoại 366 nm.
Vì vậy lựa chọn hệ dung môi thứ 5 (Cloroform : Methanol (9:1)) để tiến hành triển khai HPTLC.
* Điều kiện chạy HPTLC:
- Điều kiện môi trường: nhiệt độ 26˚C; độ ẩm tương đối 65%. - Thể tích dung môi bão hòa: 25ml; dung môi khai triển: 10ml. - Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút.
- Thời gian bão hòa bản mỏng: 5 phút. - Thời gian sấy khô bản mỏng: 5 phút.
- Khoảng cách dịch chuyển của pha động: 80 mm.
3.1.1.4. Thẩm định phương pháp định lượng
*Độ đặc hiệu
Triển khai sắc ký trên 3 mẫu trắng, thử, chuẩn thu được kết quả như sau: - Sắc ký đồ của mẫu thử cho vết oxostephanin có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị Rf (0.53) với vết oxostephanin trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
- Sắc ký đồ các mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với vết oxostephanin trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
Hình 3.6. Kết quả chồng pic của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy phương pháp phân tích có tính đặc hiệu với chất chuẩn oxostephanin.
*Tính tuyến tính:
Triển khai sắc ký với các nồng độ từ 0.01 đến 0.27 mg/ml thu được các vết có diện tích pic tương ứng như bảng sau:
Bảng 3.1. Nồng độ oxostephanin chuẩn và diện tích pic đáp ứng
STT Mẫu Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic
1 C1 0.010 108732 2 C2 0.030 350525 3 C3 0.090 1081233 4 C4 0.135 1464915 5 C5 0.180 1845857 6 C6 0.270 2429633 Hệ số tương quan r 0.9905
Hình 3.7. Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic
Phương trình đường chuẩn theo diện tích pic: y: diện tích pic.
x: nồng độ chuẩn oxostephanin.
Hệ số tương quan r= 0.9905 (tương ứng với giá trị r2
= 0.9811).
Nhận xét: với giá trị r > 0.90, nhận thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ oxostephanin và diện tích pic sắc ký.
*Độ thích hợp của hệ thống:
Từ 6 lần tiêm mẫu khác nhau thu được giá trị Rf và diện tích pic như sau:
Bảng 3.2. Giá trị Rf và diện tích pic của các vết
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6
Giá trị Rf 0.482 0.474 0.486 0.482 0.489 0.499 Diện tích 51308.4 51261.4 51523.4 51137.0 52723.6 53285.6 RSD giữa các giá trị Rf và diện tích pic lần lượt là 1.73% và 1.74%.
Nhận xét: Giá trị RSD tính theo diện tích pic hay Rf đều nằm trong giới hạn chấp nhận được, hệ thống HPTLC có hiệu năng phù hợp với quy trình phân tích trong quá trình tiến hành thực nghiệm.
*Độ đúng:
Từ các thông số diện tích pic đo được, tính toán hàm lượng oxostephanin trong các mẫu sau khi thêm chuẩn như sau:
Bảng 3.3 . Kết quả khảo sát độ đúng STT Đã có (mg) Thêm chuẩn (mg) Tổng lượng tìm lại (mg) Tỉ lệ thu hồi (%) 1 0.0425 0.0515 0.0536 104.08 2 0.0389 0.0479 0.0465 97.02 3 0.0182 0.0272 0.0322 118.38 TB 106.49 RSD (%) 10.219 4 0.0425 0.0575 0.0596 103.60 5 0.0389 0.0539 0.0532 98.65 6 0.0182 0.0332 0.0397 119.58 TB 107.28 RSD (%) 10.197 7 0.0425 0.0650 0.0702 107.95 8 0.0389 0.0614 0.0637 103.74 9 0.0182 0.0407 0.0397 97.54 TB 103.08 RSD (%) 5.080 Trung bình chung 105.62 RSD trung bình (%) 8.499
Nhận xét: Giá trị RSD trung bình của độ đúng là 8.499%, nằm trong giới hạn cho phép đối với phân tích dược liệu.
3.1.2. Định lượng oxostephanin trong các bộ phận cây trồng loài S.dielsiana
Từ phương pháp định lượng ở trên, ghi nhận giá trị diện tích pic của các vết và thu được nồng độ oxostephanin trong các mẫu thử (phụ lục 1). Hàm lượng
Bảng 3.4. Kết quả định lượng oxostephanin bằng HPTLC
STT Mẫu lượng Khối Hàm ẩm
(%) Hàm lượng (%) Hàm lượng trung bình (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 A1 2.0071 8.17 0.3548 0.3281 0.3328 0.3386 2 A2 2.0020 6.13 1.4620 1.5761 1.5283 1.5221 3 A3 2.0006 5.89 0.8633 0.8610 0.8493 0.8579 4 A4 2.0011 5.98 0.4251 0.3897 0.4130 0.4093 5 B1 2.0035 8.50 0.1645 0.1509 0.1720 0.1625 6 B2 2.0137 6.03 1.3206 1.3539 1.3579 1.3441 7 B3 2.0071 5.78 0.7617 0.7353 0.7758 0.7576 8 B4 2.0038 6.29 0.4785 0.4012 0.4615 0.4471 9 C1 2.0038 9.04 0.2151 0.2087 0.1818 0.2019 10 C2 2.0147 6.35 0.8658 0.8320 0.8146 0.8375 11 C3 2.0071 5.67 0.8085 0.7887 0.7631 0.7868 12 C4 2.0233 6.05 0.3509 0.3212 0.3049 0.3257 13 D1 2.0045 8.78 0.3260 0.3064 0.2906 0.3077 14 D2 2.0135 5.81 0.7933 0.8008 0.7734 0.7892 15 D3 2.0017 6.68 0.7530 0.7386 0.7611 0.7509 16 D4 2.0039 5.58 0.5434 0.5220 0.5091 0.5248 17 E1 2.0589 9.15 0.1132 0.1060 0.0733 0.0975 18 E2 2.0080 6.05 1.1052 1.1297 1.1705 1.1351 19 E3 2.0009 5.51 0.4644 0.4701 0.4153 0.4499 20 E4 2.0047 6.59 0.4130 0.4332 0.4011 0.4158 21 F1 2.0100 9.06 0.2851 0.2918 0.2717 0.2829 22 F2 2.0076 6.93 1.8230 1.7052 1.7579 1.7620 23 F3 2.0213 5.94 0.7493 0.7565 0.7052 0.7370 24 F4 2.0098 6.17 0.5917 0.6016 0.5215 0.5716 25 K1 2.0012 8.99 0.1043 0.0274 0.0403 0.0573 26 K2 2.0070 10.06 0.0784 0.0564 0.0664 0.0671 27 K3 2.0161 8.09 0.3533 0.2347 0.2439 0.2773 28 K4 2.0049 9.04 0.3387 0.3341 0.3443 0.3392
3.1.3. Đánh giá hàm lượng oxstephanin của cây trồng loài S.dielsiana
3.1.3.1. Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin trong các bộ phận khác nhau của cùng 1 cây cùng 1 cây
Bảng 3.5. Kết quả phân tích phương sai
Nhóm Df Sum Sq Mean Sq F value Pr (>F)
1 tuổi Group 7 5.040 0.7200 889.8 < 2× 10 -16 Residuals 16 0.013 0.0008 2 tuổi Group 7 1.396 0.1994 532.2 < 2 × 10 -16 Residuals 16 0.006 0.0004 Trưởng thành Group 7 6.038 0.8626 768.7 < 2 × 10-16 Residuals 16 0.018 0.0011 Ghi chú: Df (degrees of freedom): bậc tự do
Sum Sq: tổng bình phương (sum of squares) Mean Sq: trung bình bình phương (mean square) Group: sự khác nhau trong các nhóm
Residuals: sự khác nhau giữa các nhóm F value: giá trị F
Pr(>F): trị số P liên quan đến kiểm định F. Giá trị P < 0.05 là khác biệt có ý nghĩa thống kê.
Nhận xét:
- So sánh các nhóm dữ liệu của các mẫu cho thấy trị số P đều nhỏ hơn 0.05, như vậy có thể kết luận các bộ phận khác nhau của cây có sự tích lũy hàm lượng oxostephanin khác nhau.
- Tất cả các mẫu cây ở cả 3 độ tuổi, hàm lượng oxostephanin tích lũy trong các mẫu thân lá non là cao nhất và các mẫu củ là nhỏ nhất. Theo phân tích thống kê, sự khác biệt này là có ý nghĩa.
- Trong 1 cây, thứ tự sắp xếp độ giảm dần hàm lượng oxostephanin trong các bộ phận là: thân lá non, thân lá bánh tẻ, thân lá già, củ.
3.1.3.2. Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin trong các mẫu theo các độ tuổi khác nhau : khác nhau :
Cây trồng từ hạt :
Kết quả hàm lượng oxostephanin trung bình trong các mẫu cây trồng từ hạt theo năm tuổi được thể hiện ở biểu đồ 3.8 dưới đây :
Hình 3.8. Biểu đồ hàm lượng oxostephanin trung bình trong các mẫu của cây trồng từ hạt
Nhận xét:
- Hàm lượng oxostephanin trong thân lá non có sự biến đổi lớn nhất giữa các độ tuổi: cao nhất ở cây 1 tuổi, giảm gần 2 lần ở cây 2 tuổi và tăng lên ở cây trưởng thành, nhưng vẫn thấp hơn ở cây 1 tuổi.
- Thân lá cây bánh tẻ có hàm lượng oxostephanin khá ổn định từ năm 1 đến năm 2, tuy nhiên đến năm trưởng thành, hàm lượng giảm 1 nửa.
- Thân lá già: sự thay đổi có quy luật giống với mẫu thân lá non.
- Củ: cao nhất ở cây 1 tuổi và giảm dần ở các độ tuổi tiếp theo. Hàm lượng trong cây 1 tuổi gấp hơn 3 lần hàm lượng trong cây trưởng thành.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
Cây 1 tuổi Cây 2 tuổi Cây trưởng thành
Củ
Thân lá non Thân lá bánh tẻ Thân lá già
Cây trồng từ hom:
Kết quả hàm lượng oxostephanin trung bình trong các mẫu cây trồng từ hom theo năm tuổi được thể hiện ở biểu đồ 3.9 dưới đây:
Hình 3.9. Biểu đồ hàm lượng oxostephanin trung bình trong các mẫu của cây trồng từ hom
Nhận xét:
- Thân lá non: hàm lượng oxostephanin trong cây 2 tuổi là thấp nhất, bằng 2/3 cây 1 tuổi và ½ cây trưởng thành.
- Thân lá bánh tẻ và thân lá già: hàm lượng oxostephanin ở các độ tuổi khác nhau không có ý nghĩa thống kê.
- Củ: hàm lượng oxostephanin tăng mạnh (gần 2 lần) từ cây 1 tuổi lên 2 tuổi, tuy nhiên giữa cây 2 tuổi và cây trưởng thành lại có sự giảm nhẹ hàm lượng.
3.1.3.3. Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin tích lũy trong mẫu cây trồng từ hạt và cây trồng từ hom hạt và cây trồng từ hom
So sánh số liệu các mẫu cây trồng từ hom và cây trồng từ hạt bằng phân tích hậu định Tukey được kết quả như bảng 3.6.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
Cây 1 tuổi Cây 2 tuổi Cây trưởng thành
Củ
Thân lá non Thân lá bánh tẻ Thân lá già
Bảng 3.6. So sánh hàm lượng oxostephanin theo các cặp mẫu cây trồng từ hạt và cây trồng từ hom
Nhóm diff lwr upr p adj
A1-B1 - 0.1761 - 0.2565 - 0.0957 0.0000244 A2-B2 - 0.1780 - 0.2584 - 0.0976 0.0000213 A3-B3 - 0.1003 - 0.1807 - 0.0198 0.0096475 A4-B4 0.0378 - 0.0426 0.1182 0.7288384 D1-C1 0.1058 0.0511 0.1605 0.0001107 D2-C2 - 0.0483 - 0.1030 0.0064 0.1048254 D3-C3 - 0.0359 - 0.0906 0.0188 0.3650005 D4-C4 0.1992 0.1445 0.2539 0.0000000 F1-E1 0.1854 0.0907 0.2800 0.0000958 F2-E2 0.6269 0.5322 0.7216 0.0000000 F3-E3 0.2871 0.1924 0.3818 0.0000003 F4-E4 0.1558 0.0611 0.2505 0.0006776 Ghi chú:
Diff : hiệu số giữa 2 nhóm kết quả
lwr, upr : khoảng tin cậy 95%. Khác biệt có ý nghĩa thống kê nếu cả 2 trị số này cùng lớn hoặc cùng nhỏ hơn 0 và trị số p<0.05.
Nhận xét:
Hàm lượng oxostephanin trong các mẫu cây từ hạt có sự khác biệt so với các mẫu cây từ hom. Ở cây 1 và 2 tuổi, các mẫu từ hạt cho hàm lượng cao hơn các mẫu từ hom. Tuy nhiên, các mẫu cây trưởng thành thì cây từ hom cho hàm lượng lớn hơn cây từ hạt.
3.1.3.4. Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin trong mẫu củ trưởng thành theo các mùa khác nhau theo các mùa khác nhau
So sánh hàm lượng oxostephanin trong các mẫu củ theo mùa bằng phân tích kiểm định Tukey thu được kết quả ở biểu đồ 3.10:
Hình 3.10. Biểu đồ so sánh hàm lượng oxostephanin theo mùa
Chú ý: Các đường gạch cùng nằm 1 phía so với trị số 0 biểu hiện khác biệt có ý nghĩa thống kê.
Nhận xét:
Hàm lượng oxostephanin trong các mẫu mùa xuân và mùa hạ thấp hơn hẳn so với các mẫu mùa đông và mùa thu.
3.2. BÀN LUẬN
3.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng
Định lượng oxostephanin bằng HPTLC là một phương pháp mới, tiến hành được trên số lượng mẫu lớn, có ưu điểm là khá đơn giản, có độ nhạy cao, tính kinh tế và phù hợp với nghiên cứu so sánh hàm lượng.
Nghiên cứu đã tiến hành thẩm định phương pháp phân tích dựa trên một số tiêu chuẩn. Kết quả cho thấy phương pháp có khả năng phân tích đặc hiệu với chuẩn oxostephanin, có độ tương quan tốt giữa nồng độ chất chuẩn và diện tích pic đáp ứng. Độ lặp lại của hệ thống cũng cho thấy tính tương thích phù hợp trong ngày tiến hành sắc ký. Tuy độ đúng của phương pháp cho giá trị RSD tương đối cao (8.499%), nhưng đối với phân tích dược liệu, do tiến hành trên dịch chiết tổng có lẫn nhiều tạp chất, và sai số có thể sinh ra trong quá trình chiết tách phức tạp nên giá trị trên vẫn nằm trong khoảng chấp nhận được.
HPTLC là phương pháp bán tự động, các yếu tố về điều kiện môi trường như độ ẩm, nhiệt độ…có ảnh hưởng lớn tới hình ảnh và độ gọn của vết oxostephanin chuẩn. Do được tiến hành trên các bản mỏng nên các chú ý khi chuẩn bị bản mỏng là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng lớn tới độ lặp lại của kết quả phân tích hàm lượng oxostephanin. Bên cạnh đó, nguyên tắc định lượng chủ yếu dựa trên cường độ màu vết oxostephanin ở bước sóng 366 nm. Với các lý do như trên, định lượng bằng HPTLC có nhiều khả năng xảy ra sai số, kết quả định lượng oxostephanin chủ yếu mang tính định hướng nhằm xác định bộ phận, thời điểm thu hái phù hợp, đạt mục tiêu hàm lượng.
Bên cạnh đó, hình ảnh sắc ký đồ trên bản mỏng có thể cung cấp thêm thông tin về định tính dược liệu, góp phần sơ bộ vào phân loại và xác định nhanh các loài, đặc biệt rất phù hợp trong phân biệt các loài trong chi Bình vôi.
3.2.2. Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây
* Đánh giá chung về kết quả định lượng
Định lượng oxostephanin bằng HPLC trong các mẫu củ và lá bánh tẻ cho kết quả lần lượt là 0.065% và 0.873% [19]. Kết quả định lượng bằng HPTLC với mẫu củ dao động từ 0.05 đến 0.34%, mẫu thân lá bánh tẻ là khoảng 0.8%. Như vậy, nếu so sánh với phương pháp HPLC, kết quả định lượng bằng HPTLC không có sự khác biệt quá lớn. Ngoài ra, 2 phương pháp được tiến hành trên các đối tượng nghiên cứu khác nhau, quy trình chiết xuất và xử lý mẫu cũng không đồng nhất. Do đó, để kết luận chính xác nhất về sai số của kết quả định lượng bằng HPTLC, cần tiến hành
song song trên cùng đối tượng nghiên cứu và tất cả các bước trong quy trình định lượng.
*Sự thay đổi hàm lượng oxostephanin giữa các bộ phận khác nhau của cây