- Xử lý mẫu thử:
+ Quy trình chiết xuất dược liệu [4], [5], [8]: Cân chính xác khoảng 2.0 g bột dược liệu, ngâm trong dung môi chiết xuất MeOH, bề mặt dung môi chiết cách bề
mặt dược liệu khoảng 2-3 cm. Sau 24h, cho toàn bộ hỗn hợp trên vào bình chiết ngấm kiệt. Liên tục bổ sung dung môi và rút dịch chiết với cùng tốc độ 20 giọt/phút.
+ Lựa chọn độ pha loãng phù hợp cho dung dịch thử:
Dịch chiết thu được đem cô đến cắn. Hòa tan cắn trong chính xác 50ml, 100 ml MeOH để được các dung dịch chấm mẫu. Tiến hành triển khai sắc ký để so sánh vết chấm về kích thước, độ đậm và độ kéo vết.
- Lựa chọn khoảng nồng độ của dãy dung dịch oxostephanin chuẩn: Pha các dãy dung dịch chuẩn oxostephanin có các giới hạn nồng độ khác nhau như bảng sau:
Bảng 2.2. Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml)
Nồng độ OXO1 OXO2 OXO3 OXO4 OXO5 OXO6
Dãy 1 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
Dãy 2 0.02 0.05 0.08 0.1 0.12 0.15
Dãy 3 0.01 0.03 0.09 0.135 0.18 0.27
Triển khai sắc ký lớp mỏng các mẫu thử và mẫu chuẩn trên cùng một bản mỏng. Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa trên mối liên hệ giữa nồng độ oxostephanin và diện tích pic đáp ứng. Từ đường chuẩn định lượng, khảo sát khoảng nồng độ oxostephanin trong các mẫu thử, từ đó lựa chọn được dãy nồng độ chất chuẩn phù hợp.
- Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC [30], [36]:
+ Bản mỏng: Bản mỏng HPTLC silica gel 60 F254 (Merck) hoạt hóa ở 110˚C trong 30 phút. Kích thước bản mỏng 20 × 10 cm.
+ Đưa mẫu lên bản mỏng: Mẫu được phun lên bản mỏng bằng máy chấm mẫu Linomat 5. Vị trí chấm mẫu cách mép dưới bản mỏng là 1.5 cm, cách mép dung môi từ 0.8 – 1 cm. Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng là 1.5 cm. Độ dài băng chấm 6 mm và thể tích chấm mỗi vết là 2 µl. Mỗi bản mỏng kích thước 20 × 10 cm chấm tối đa 15 vết.
+ Hệ dung môi khai triển [11], [26], [39]:
1)n-Butanol : Acid acetic đặc : H2O (60:20:20). 2)MeOH : NH4OH đậm đặc (95:5).
3)CHCl3 : Aceton : MeOH : NH4OH (20:20:3:1).
4)Toluen : Ethylacetat : MeOH : NH4OH 28% (10:10:5:0.3). 5)Chloroform : MeOH (9:1).
Lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực phù hợp, cho hiệu năng tách tốt, đồng thời vết tách lên gọn, tròn, không bị kéo, không bị lẫn vết phụ.
- Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa trên diện tích pic và nồng độ oxostephanin của các mẫu chuẩn. Xác định nồng độ oxostephnin trong các mẫu thử. Từ đó tính hàm lượng oxostephanin trong dược liệu theo công thức sau :
% oxostephanin =
Trong đó : C là nồng độ dung dịch thử (% g/mL) m là khối lượng bột dược liệu (g)
a là 100 lần độ ẩm của bột dược liệu (%) - Thẩm định phương pháp định lượng
+ Độ đặc hiệu:
Khái niệm: Độ đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các chất khác có trong mẫu thử [16].
Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu sau: 1)Mẫu trắng: dung dịch MeOH.
2)Mẫu thử: dịch chiết MeOH của mẫu củ cây 2 tuổi trồng từ hạt. 3)Mẫu chuẩn oxostephanin hòa tan trong MeOH.
Triển khai sắc ký với mẫu bằng hệ dung môi khai triển được lựa chọn ở trên. Soi và chụp ảnh bản mỏng tại bước sóng 366 nm, quan sát số lượng vết, hình dáng các vết và so sánh giá trị RSD của Rf [28].
Phương pháp HPTLC được coi là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu: (i) Sắc ký đồ của mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị Rf với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn; (ii) Sắc ký đồ các mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
Giá trị đề nghị chấp nhận khi so sánh trị số Rf: Độ lệch chuẩn tương đối của giá trị Rf các vết trên sắc ký đồ dung dịch thử không quá 5%. Độ lệch giá trị Rf trên vết mẫu thử so với vết mẫu chuẩn không quá 5% [28]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Tính tuyến tính:
Khái niệm: Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân tích thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử [16].
Cách tiến hành: Chuẩn bị dãy mẫu chuẩn với nồng độ: 0.01; 0.03; 0.09; 0.135; 0.18; 0.27 (mg/ml). Tiến hành triển khai HPTLC với dãy dung dịch chuẩn trên. Xây dựng phương trình biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu [28].
Đánh giá: Dựa vào hệ số tương quan r của đường chuẩn để đánh giá độ tuyến tính. Thông thường với giá trị r > 0.90 có thể kết luận phương pháp có tương quan tuyến tính tốt [16].
+ Độ thích hợp của hệ thống:
Khái niệm: Độ thích hợp của hệ thống là khái niệm chỉ sự tương thích giữa thiết bị, dụng cụ điện tử, sự vận hành của hệ thống và mẫu phân tích. Độ thích hợp của hệ thống cho biết hiệu năng của thiết bị HPTLC và hệ thống sắc ký trong ngày tiến hành thử nghiệm [16].
Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu chuẩn oxostephanin có nồng độ 0.03 mg/ml. Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn, triển khai HPTLC [28].
Đánh giá: Tính RSD của diện tích pic, chiều cao pic. Giá trị RSD của diện tích (chiều cao) pic giữa các lần tiêm mẫu (n > 5) nên nhỏ hơn 2.0% [28].
+ Độ đúng [28]:
Khái niệm: Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết.
Cách tiến hành: Độ đúng của phương pháp HPTLC đối với định lượng hoạt chất trong dược liệu được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn.
Chuẩn bị các mẫu thử từ thân lá bánh tẻ của cây trưởng thành trồng từ hạt, thân lá già của cây trưởng thành trồng từ hạt, củ của cây trưởng thành trồng từ hạt theo quy trình như trên.
Mẫu thử 1: thêm chính xác 0.5 ml mẫu chuẩn có nồng độ 0.018 mg/ml vào các ống đã có sẵn 0.5 ml mẫu thử ở trên.
Mẫu thử 2: thêm chính xác 0.5 ml mẫu chuẩn có nồng độ 0.03 mg/ml vào các ống đã có sẵn 0.5 ml mẫu thử ở trên.
Mẫu thử 3: thêm chính xác 0.5 ml mẫu chuẩn có nồng độ 0.045 mg/ml vào các ống đã có sẵn 0.5 ml mẫu thử ở trên.
Chuẩn bị dãy mẫu chuẩn có nồng độ 0.01, 0.03, 0.09, 0.135, 0.18, 0.27 (mg/ml). Tiêm lần lượt các mẫu theo quy trình định lượng thông thường, xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất của phương pháp theo công thức:
Đánh giá: độ đúng của phương pháp dựa vào tỷ lệ thu hồi và các giá trị RSD của tỷ lệ thu hồi. Không có các giới hạn cụ thể mà độ đúng của một phương pháp phải đạt được, giới hạn độ đúng của phương pháp còn phụ thuộc vào tỷ lệ % và/hoặc khối lượng chất cần phân tích có trong mẫu thử. Nói chung, đối với phương pháp định lượng hàm lượng dược chất trong dược liệu, độ đúng của phương pháp có thể được chấp nhận với khoảng sai số rộng hơn do nền mẫu lớn và quá trình chiết
tách phức tạp, giới hạn RSD có thể dao động từ ± 2.0% đến ± 10.0% hoặc hơn, tuy nhiên cần có biện giải về giới hạn này.