Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh giống rau Sắng (Melientha suavis) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi rau Sắng.. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năn

NGUYỄN VIỆT ĐỨC

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG RAU SẮNG (Melientha suavis) CHẤT LƯỢNG CAO BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Giảng viên hướng dẫn: 1 ThS Vi Đại Lâm

Khoa CNSH - CNTP, Trường ĐHNL Thái Nguyên

2 ThS Đào Duy Hưng

Viện Khoa học Sự Sống - Trường ĐHNL Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khoa luận tốt nghiệp em xin chân thành cảm ơn Ban

giám hiệu nhà trường Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ

nhiệm khoa CNSH và CNTP cùng các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ

tế bào đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo ThS Vi Đại Lâm và

ThS Đào Duy Hưng đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực

hiện đề tài

Em xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, đến những người thân đã

luôn động viên và giúp đỡ tạo điều kiện cho em về cả vật chất lẫn tinh thần

trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên còn nhiều thiếu sót, em rất

mong nhận được sự đóng góp ý kiến chân thành từ các thầy cô và các bạn để

đề tài được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

MS : Murashige & Skoog (1962)

MT : Môi trường W/v : Khối lượng/ thể tích V/v : Thể tích/thể tích

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung

dịch H2O2 nồng độ 5% đến khả năng vô trùng mẫu 31 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng viên

khử trùng Johnson (2,5 mg/l) đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy 33 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung

dịch HgCl2 nồng độ 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu 34 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh

chồi rau Sắng 36 Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi

rau Sắng 38 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa kinetinvà IAA

đến hiệu quả tái sinh chồi 40 Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa kinetin và IBA

đến hiệu quả tái sinh chồi 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 4.1 Ảnh hưởng của dung dịch H2O2 (5%) đến khả năng vô trùng mẫu

rau Sắng 32 Hình 4.2 Ảnh hưởng của viên khử trùng johnson (2,5 mg/l) đến khả năng vô

trùng mẫu rau Sắng 33 Hình 4.3 Ảnh hưởng của dung dịch HgCl2 nồng độ 0,1% đến khả năng vô

trùng mẫu rau Sắng 35 Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ kinetin đến khả năng tái

sinh chồi rau Sắng (sau 60 ngày nuôi cấy) 37 Hình 4.5 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh

chồi rau Sắng (sau 60 ngày nuôi cấy) 39 Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của sự kết hợp giữa nồng độ kinetin và

IAA đến hiệu quả tái sinh chồi rau Sắng (sau 60 ngày nuôi cấy) 41 Hình 4.7 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của sự kết hợp giữa nồng độ kinetin và

IBA đến hiệu quả tái sinh chồi rau Sắng (sau 60 ngày nuôi cấy) 43

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

MỤC LỤC v

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 3

1.3 Yêu cầu đề tài 3

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiến của đề tài 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về cây rau Sắng 4

2.1.1 Đặc điểm của cây rau Sắng 4

2.1.2 Phân bố 4

2.1.3 Phân loại 5

2.1.4 Giá trị của cây rau Sắng 5

2.1.4.1 Giá trị dinh dưỡng 5

2.1.4.2 Giá trị kinh tế 6

2.1.4.3 Giá trị dược liệu 6

2.2 Tình hình nghiên cứu cây rau Sắng ở trong nước và trên thế giới 7

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 7

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 7

2.3 Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

2.3.1 Khái niệm 8

2.3.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.3.2.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật 9

2.3.2.2 Sự phân hóa tế bào 9

2.3.2.3 Sự phản phân hóa tế bào 9

2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

2.4.1 Vật liệu nuôi cấy 10

2.4.2 Điều kiện vô trùng 11

2.4.3 Môi trường hóa học 12

2.4.4 Môi trường vật lý 22

2.5 Những vấn đề trong nhân giống in vitro 23

2.5.1 Tính bất định về mặt di truyền 23

2.5.2 Sự nhiễm mẫu 23

2.5.3 Sự hoá thuỷ tinh thể 24

2.5.4 Kiểu gen 24

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 25

3.2 Hóa chất 25

3.3 Thiết bị 25

3.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

3.4.1 Địa điểm nghiên cứu 25

3.4.2 Thời gian nghiên cứu 26

3.5 Nội dung nghiên cứu 26

3.6 Phương pháp nghiên cứu 26

3.6.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô trùng mẫu rau Sắng 26

3.6.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh

trưởng đến khả năng tái sinh chồi rau Sắng 28

3.7 Xử lý số liệu 30

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô trùng mẫu rau Sắng 31

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi rau Sắng 36

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I Tài liệu tiếng việt

II Tài liệu tiếng Anh

PHỤ LỤC

rũ xuống, mềm, dễ nứt, có vị ngọt của mì chính Cây mọc nhiều trong các khu rừng thưa, thung lũng, chân và đất núi đá vôi, có khi ven các con suối Ở Việt Nam rau Sắng mọc nhiều ở Lài Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn (Hữu Lũng), Quảng Ninh, Bắc Thái, Hà Bắc, Vĩnh Phú, Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Ninh Bình (Cúc Phương), Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Nam-Đà Nẵng, Kontum, Gia Lai, Lâm Đồng, Sông Bé, Bà Rịa Vũng Tàu (núi Đinh Gân Bà Rịa (Sách đỏ Việt nam, 2007) [18]

Rau Sắng có nhiều công dụng: Giải nhiệt, giải độc, lợi tiểu, nhuận tràng, bổ huyết… Lá, chồi non của cây Sắng có hàm lượng protit và acid amin cao hơn hẳn các loại rau khác Trong 100g rau Sắng có khoảng 6,5 - 8,2g protit, 0,23g lysin, 0,19g methionin, 0,08g tryptophan, 0,25g phenylanalin, 0,45g treonin, 0,22g valin, 0,26g leucin và 0,23g isoleucin, 11,5 mg vitamin C, 0,6mg caroten, gấp nhiều lần rau ngót thường và đậu ván Bởi vậy, đây là loại rau nấu canh ăn rất ngọt nước Vì dinh dưỡng rất cao, ngon ngọt đậm đà, rau Sắng ăn rất bổ cho những phụ nữ mới sinh và người mới ốm dậy, nó còn được coi là một vị thuốc chữa bệnh đường ruột rất tốt vì trong rau Sắng có chứa rất nhiều chất xơ ngăn ngừa táo bón, tăng khẳ năng hấp thụ chất béo và thải ra ngoài giúp đào thải mỡ thừa, giúp bạn

giảm cân hiệu quả lại an toàn cho sức khỏe, đặc biệt phụ nữ cho con bú (Đỗ Tất Lợi, 2004) [6]

Trước kia cây rau Sắng chỉ mọc hoang dã và bị người dân khai thác kiểu tận thu mà không có bảo tồn, chăm sóc, phát triển nên là một trong những loại cây có nguy cơ tuyệt chủng cao, được đưa vào Sách đỏ Việt Nam Để khôi phục và phát triển cây rau Sắng, năm 2011, Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Hà Nội đã phê duyệt dự án "Khôi phục, cải tạo và phát triển một

số cây đặc sản quý hiếm, đặc hữu tại rừng đặc dụng Hương Sơn" trong đó có cây rau Sắng, được triển khai trong ba năm (Sách đỏ Việt Nam, 2007) [18]

Do đặc thù cây thân gỗ nên thời gian sinh trưởng và phát triển của cây rau Sắng khá dài và chậm Với cách làm nhân giống thông thường là sử dụng hạt đã chín đem ươm nảy mầm ra bầu và xuống đất sẽ mất thời gian khá lâu Không những thế ta cần phải chờ và thu hạt chín, đồng thời mỗi hạt chỉ cho 1 cây Mặt khác, cây con khi lên sẽ không đảm bảo được tính đồng đều Vì vậy muốn có một số lượng cây con nhiều trong thời gian ngắn bằng phương pháp ươm truyền thống là rất khó Bên cạnh đó hiện nay nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô đang rất thành công, cho kết quả cao cả về số lượng, chất lượng và hiệu quả kinh tế, làm sạch bệnh virut để phục tráng những giống thoái hóa và góp phần làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn tạo giống Sản phẩm cho ra những cây giống khỏe mạnh, đồng đều về chất lượng

và mang nhưng đặc tính mong muốn (Trần Thị Lệ và cs, 2008) [4] Qua phân tích và đánh giá từ thực tế để đáp ứng nhu cầu từ thị trường chúng tôi tiến

hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh giống rau Sắng (Melientha suavis) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro”

1.2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô trùng

mẫu và tái sinh cây rau Sắng chất lượng cao bằng kĩ thuật in vitro

1.3 Yêu cầu đề tài

- Xác định ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô trùng mẫu rau Sắng

- Xác định được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả

năng tái sinh chồi rau Sắng

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiến của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Quá trình nghiên cứu sẽ đưa ra được một số kĩ thuật góp phần xây dựng

và hoàn thiện tái sinh giống rau Sắng bằng kĩ thuật in vitro Từ đó đánh giá

được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến kĩ thuật tái sinh

giống rau Sắng bằng phương pháp in vitro

Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển việc nghiên cứu kĩ thuật nhân

giống in vitro cây dược liệu nói chung

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Từ các kết quả nghiên cứu bổ sung nguồn tài liệu tham khảo phục vụ cho các nghiên cứu, giảng dạy và kĩ thuật tái sinh giống rau Sắng có chất lượng

cao bằng phương pháp in vitro

Góp phần bảo tồn và nhân giống rau Sắng, tạo ra một số lượng cây giống lớn, đồng đều có chất lượng cao cung cấp cho sản xuất và thị trường tiêu dùng

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây rau Sắng

2.1.1 Đặc điểm của cây rau Sắng

Rau Sắng thuộc loại cây gỗ nhỏ, cao 4 - 8 m, nhẵn ở tất cả các phần Vỏ cây dày, màu xám nhạt và hoá bẩn, mềm, nứt dọc thành những răng sâu Gỗ trắng cành và lá non màu lục, rũ xuống, mềm, dễ nứt, có vị ngọt cuả mì chính

Lá có phiến hình mác, nhẵn bóng, dày, dài 7 - 12cm, rộng 3-6 cm; gốc và đầu

lá tù, gân bậc hai có 4 - 5 đôi không rõ ở hai mặt, mép lá nguyên, cuống lá dài 1 - 2mm Cụm hoa chùy hoặc bông kép, dài 13cm, mọc dày đặc trên thân và cành già Hoa hình cầu, cao 2mm, tạp tính, rất thơm, dài nhỏ, hơi nạc, không có thùy

rõ ràng (Sách đỏ Việt Nam, 2007) [18], (Trần Minh Hợi và cs, 2008) [1]

Tràng gồm 4 - 5 phiến hình mác, hợp với nửa dưới Nhị 4 - 5, mọc đối với thùy tràng và ngắn hơn Chỉ nhị rất ngắn, đính trên sống tràng Bao phân hình bầu dục, lõm ở đầu, dài 1,5mm Đĩa của hoa đực gồm 4 - 5 tuyến, mọc xen với cánh hoa, nạc, hình nêm Nhụy lép hình trứng, không có núm rõ ràng

Ở hoa cái, tuyến đĩa hình trứng ngược, dẹt, ngắn hơn bầu Bầu 1 ô, gân hình cầu, nhỏ, không có cuống, đường kính 2mm, vòi không có núm, hình khôi nạc, hơi chia thùy, quả hạch, hóa gỗ, hình thuôn hay hình trứng, dài 2,5cm, đường 1,3-1,5cm, màu lục nhạt, nhẵn, vị ngọt, hơi ngứa Quả hình thái giống quả nhót, khi còn non và xanh quả có màu xanh bạc, khi chính quả có màu vàng tươi Hạt 1 có xơ trắng Hoa nở tập trung vào tháng 3-4 sau đó kết quả

và chín vào tháng 6-8 hằng năm (Trần Minh Hợi và cs, 2008) [1]

như Hà tây (chùa Hương-Mỹ đức), Cao Bằng, Hoà Bình, Phú Thọ (vườn Quốc Gia Xuân Sơn) Tên thường gọi là cây rau Sắng hoặc cây Mì chính, Tắc Sắng (Sách đỏ Việt Nam, 2007) [18]

2.1.3 Phân loại

- Rau Sắng có tên khoa học Melientha suavis thuộc bộ Đàm Hương là một trong hai loài duy nhất của chi Melientha chia thành 2 loại: Thân gỗ và thân dây leo

Giới(regnum): Thực vật

Ngành: Thực vật có hoa

Lớp: Thực vật hai lá mầm

Bộ(ordo): Đàn Hương Họ(familia): họ rau Sắng

Chi(genus): Melientha

Loài(species): M suavis

Họ rau Sắng có 29 chi với khoảng 600-900 loài khác nhau (Hoàng Thị Sản, 2006) [8]

2.1.4 Giá trị của cây rau Sắng

2.1.4.1 Giá trị dinh dưỡng

- Rau Sắng có nhiều công dụng: Giải nhiệt, giải độc, lợi tiểu, nhuận tràng, bổ huyết… Lá, chồi non của cây Sắng trông xanh thẫm, óng ả, mỡ màng, có hàm lượng protit và acid amin cao hơn hẳn các loại rau khác Trong 100g rau Sắng có khoảng 6,5 - 8,2g protit, 0,23g lysin, 0,19g methionin, 0,08g tryptophan, 0,25g phenylanalin, 0,45g treonin, 0,22g valin, 0,26g leucin

và 0,23g isoleucin, 11,5 mg vitamin C, 0,6 mg caroten v.v…gấp nhiều lần rau ngót thường và đậu ván Bởi vậy, đây là loại rau nấu canh ăn rất ngọt nước

Vì dinh dưỡng rất cao, ngon ngọt đậm đà, rau Sắng ăn rất bổ cho những phụ

nữ mới sinh và người mới ốm dậy (Đỗ Tát Lợi, 2004) [6]

2.1.4.2 Giá trị kinh tế

Rau Sắng có giá trị dinh dưỡng cao với thời gian trồng và thu hoạch nhanh Đặc biệt có thể trồng một lần mà thu hoạch cả đời Thời gian bắt đầu được thu hoạch là từ 2-3 năm từ khi trồng, tập trung vào tháng 3,4 hàng năm, đến tháng 6 thụ hoạch quả chín (Vũ Văn Trung, 2013) [13]

Giá rau Sắng trên thị trường bây giờ có giá vào khoảng 200.000 đồng/kg (đối với cây thân gỗ) và 70.000 đồng/kg (đối với cây thân leo) và luôn trong tình trạng cung không đủ cầu (Trần Minh Hợi và cs, 2008) [1]

Trồng cây rau Sắng không yêu cầu quá cao về mặt kĩ thuật và ít công chăm sóc do cây thuộc giống tự nhiên vì thế sẽ tiết kiệm chi phí tăng hiệu quả kinh tế tối đa

Theo tính toán, 1ha rau Sắng thân leo sau năm thứ 2 cho thu hoạch bình quân khoảng 61 triệu đồng/ha; sau 5 năm đối với cây thân gỗ cho thu nhập khoảng 80 triệu đồng/ ha (Trần Minh Hợi và cs, 2008) [1]

2.1.4.3 Giá trị dược liệu

- Rau Sắng được coi là một vị thuốc chữa bệnh đường ruột rất tốt vì trong rau Sắng có chứa rất nhiều chất xơ ngăn ngừa táo bón, tăng khẳ năng hấp thụ chất béo và thải ra ngoài giúp đào thải mỡ thừa, giúp bạn giảm cân hiệu quả lại an toàn cho sức khỏe, đặc biệt phụ nữ cho con bú (Đỗ Tất Lợi, 2004) [6]

- Ngoài ra nó còn chứa một lượng lớn các axit amin không thể thay thế,

có vai trò rất lớn trong quá trình sinh tổng hợp protein của cơ thể như: Lisin, methyonin, triptophan, phenilalanin, treonin, valin, leuxin, iso leuxin…

Rễ được sử dụng chữa sán (Đỗ Tất Lợi, 2004) [6]

2.2 Tình hình nghiên cứu cây rau Sắng ở trong nước và trên thế giới

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trước kia cây sắng chỉ mọc hoang dã và bị người dân khai thác kiểu tận thu mà không có bảo tồn, chăm sóc, phát triển nên là một trong những loại cây có nguy cơ tuyệt chủng cao, được đưa vào Sách đỏ Việt Nam Nếu không

có biện pháp bảo tồn thì khó có thể giữ được giống cây quý hiếm này Để khôi phục và phát triển cây rau sắng, năm 2011, Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Hà Nội đã phê duyệt dự án "Khôi phục, cải tạo và phát triển một

số cây đặc sản quý hiếm, đặc hữu tại rừng đặc dụng Hương Sơn" trong đó có cây rau Sắng, được triển khai trong ba năm Sau hơn 3 năm triển khai thực hiện, đến nay, dự án đã xây dựng thành công các quy trình kỹ thuật nhân giống và quy trình kỹ thuật trồng cây rau Sắng thương phẩm thân gỗ và thân leo Mô hình trồng cây rau Sắng được triển khai tại thị trấn Ba Sao, huyện Kim Bảng và xã Thanh Nghị, huyện Thanh Liêm với tổng diện tích 45.180m2, trong đó cây rau Sắng thân leo là 14.800 m2

, thân gỗ là 30.380m2 Hiện nay,

cả cây thân gỗ và thân leo đang sinh trưởng phát triển rất tốt và bắt đầu cho thu hái (Sách đỏ Việt Nam, 2007) [18]

Ngoài ra còn có luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp của Vũ Văn Trung nghiên cứu phát triển cây rau Sắng thân leo tại Kim Bảng, tỉnh Hà Nam Luận văn đã đưa ra được kết luận cây rau Sắng nhân giống bằng hom xử lí chất kích thích GA3 hoàn toàn có thể nhân giống tốt bằng phương pháp vô tính với mức tỉ xuất vườn 73,67% ở mức nồng độ GA3 100 ppm (Vũ Văn Trung, 2013) [13]

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới có rất ít nghiên cứu về cây rau Sắng, chỉ có một vài tài liệu

đề cập đến phân loại thực vật trong chi Aspidopterys (Ramesh B R, 2011) [24], (Foot and Agriculture Organization , 1996) [21] Một số dữ liệu thực vật của Vân Nam, Trung Quốc, Ấn Độ, dữ liệu thực vật Hoa Kì, vườn thực vật

Hoàng gia Anh cũng chỉ cho biết loài này phân loại theo Merrill E.D Năm

1940, địa điểm phát hiện trong rừng trên đường đi từ Hà Nội đến Hòa Bình và được phân bố ở khu rừng rậm nhiệt đới Châu Á Cây này thuộc cây hai lá mầm có hoa, thuộc họ Malpighiaceae (Ramesh B R, 2011) [24], (Brummitt , 1991) [19] Duy nhất trong kết quả nghiên cứu của Naomi Walston và David Ashwell (2008), rau Sắng thân leo có tiềm năng thương mại bởi đây là loại rau đặc sản bản địa có thành phần dinh dưỡng cao Theo hướng nghiên cứu tác dụng làm chế phẩm đã chỉ ra các hợp chất Flavonoid có trong rễ cây rau Sắng thân leo khi nhuộm vào sợi coton sẽ giữ được độ bền với chất tẩy rửa và bền màu hơn với ánh sáng mặt trời Kết quả nghiên cứu là một phát hiện mới

về cây rau Sắng Qua đó ta thấy tác dụng của cây rau Sắng khá đa dạng và hữu ích có thể khai thác phục vị lợi ích con người (Montra chairat, 2009) [22]

2.3 Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.1 Khái niệm

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình nuôi cấy in vitro các nguyên

liệu như đoạn thân , đoạn rễ, vảy củ hay mẫu mô, cánh hoa có kích thước phù hợp được nuôi cấy trong ống nghiệm với điều kiện vô trùng và môi trường thích hợp có thể kiểm soát về thành phần chất khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, các chất hữu cơ cung cấp cho cây, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm để tạo thành mô hay cây hoàn chỉnh tùy theo mục đích của người nuôi cấy (Vũ Văn

Vụ và cs, 2009) [15]

Ưu điểm của phương pháp này là: Cho hệ số nhân giống cao nên có thể

tạo ra số lượng cây lớn trong thời gian ngắn Thực hiện quanh năm không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên Tạo ra cá thể mới giữ được đặc tính của cây ban đầu Làm sạch bệnh virut để phục tráng những giống thoái hóa Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006)

[5], (Trần Thị Lệ và cs, 2008) [4]

2.3.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.2.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Gottlieb Haberlandt (1902) nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Ông đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời” Theo ông mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể đó và có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi (Nguyễn Như Khanh và cs, 2011) [3]

2.3.2.2 Sự phân hóa tế bào

Sự sinh trưởng của tế bào gồm hai giai đoạn: Giai đoạn phân chia tế bào

và giai đoạn dãn của tế bào Trong hai giai đoạn này tế bào chưa có những đặc trưng riêng về cấu trúc và chức năng

Sau đó, các tế bào bắt đầu phân hóa thành các mô chuyên hóa để đảm nhận các chức năng khác nhau, các tế bào trong giai đoạn này có các đặc trưng riêng về cấu trúc và chức năng

Có thể nói rằng sự phân hóa tế bào là sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa (Nguyễn Như Khanh và cs, 2011) [3], (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006) [5]

2.3.2.3 Sự phản phân hóa tế bào

Sự phản phân hóa tế bào là quá trình ngược lại với sự phân hóa tế bào Các tế bào đã biệt hóa trong các mô chức năng không mất đi khả năng phân chia, trong những điều kiện nhất định chúng có thể quay lại đóng vai trò như các mô phân sinh và có khả năng phân chia để tạo ra các tế bào mới (Vũ Văn

Vụ và cs, 2006) [16]

Phân hóa tế bào

Phản phân hóa tế bào

2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.4.1 Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật

Vật liệu nuôi cấy ảnh hưởng khá lớn tới kết quả nuôi cấy Về nguyên tắc mỗi tế bào của mô chuyên hóa như thân, rễ, lá, chồi… trên cơ thể sinh vật đều

có khả năng làm vật liệu nuôi cấy Tuy nhiên, thực tế tùy từng loại tế bào và các loại mô khác nhau mà kết quả phát sinh hình thái khác nhau, với khả năng tạo chồi rễ hay mô sẹo

Vì vậy việc chọn mẫu cấy cho phù hợp phải căn cứ vào: Trạng thái sinh

lý hay tuổi của mẫu, mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trường nhanh, dễ tái sinh Ngoài ra mô non mới được hình thành sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn Khi lấy mẫu làm thí nghiệm nuôi cấy cần chú ý đến các yếu tố như mùa vụ lấy vật liệu, kích thước vật liệu, tuổi cây

mẹ, vị trí lấy mẫu trên cây mẹ và dòng cây mẹ (Nguyễn Đức Thành, 2000) [11]

- Mùa vụ lấy vật liệu: Thường lấy mẫu ở thời điểm cây sinh trưởng và phát triển mạnh nhất: Mùa xuân hay đầu mùa hè Các mùa khác lấy mẫu sinh trưởng kém hơn, đồng thời mang nhiều mầm bệnh

Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào chuyên hóa

- Kích thước và vị trí mẫu cấy: Kích thước của mẫu cấy ảnh hưởng trực tiếp đến phản ứng của mô với môi trường nuôi cấy Mẫu có kích thước càng nhỏ càng khó nuôi cấy Thường trên cây, mẫu ở vị trí cao sẽ ít mầm bệnh hơn, các mô, cơ quan tiếp xúc với nước, đất như rễ, củ, thân ngầm có lượng vi sinh vật rất cao và khó loại bỏ hoàn toàn chúng ra khỏi nguồn mẫu (Viện dược liệu, 2013) [17]

- Chất lượng cây cho mẫu: Lấy từ những cây có đặc điểm ưu việt mà ta quan tâm: Sinh trưởng và phát triển mạnh, chống chịu tốt với điều kiện bất lợi hoặc sâu bệnh, cho sản lượng và chất lượng ngon của củ, quả…

- Mục đích và khả năng nuôi cấy: Để phục vụ cho nhân giống vô tính thường chọn chồi ngọn, chồi bên (chồi muộn) Nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy phôi: có thể sử dụng là mầm, trụ lá mầm, thân, lá, phôi… Để thu cây đơn bội phục vụ cho lai tạo giống dùng bao phấn và hạt phấn cho nuôi cấy

- Phụ thuộc vào mẫu có nuôi cấy thành công hay không? Nếu nuôi cấy

mô sẹo hay nuôi cấy phôi không thể thực hiện với một đối tượng nào đó thì phải chuyển sang chọn đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy và ngược lại (Viện Dược Liệu, 2013) [17]

2.4.2 Điều kiện vô trùng

Điều kiện vô trùng là yêu cầu quan trọng nhất quyết định trước tiên đến

sự thành bại của việc nuôi cấy Toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần đảm

bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối Vô trùng bao gồm: Vô trùng phòng nuôi cấy,

vô trùng dụng cụ và môi trường, vô trùng mẫu cấy (Nguyễn Đức Lượng và cs, 2002) [7]

Dụng cụ khử trùng cơ bản gồm:

- Nồi hấp tiệt trùng: Sử dụng cho việc khử trùng môi trường nuôi cấy, dụng

cụ nuôi cấy bằng hơi nước có áp suất và nhiệt độ cao (1,2- 1,5 atm; 120- 130o

C)

- Tủ sấy (60-600oC): Để sấy khô các dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ cấy

- Dung dịch khử trùng: Để khử trùng vật liệu đưa vào nuôi cấy người ta thường sử dụng các dung dịch như: HgCl2, NaClO (hypoclorit natri); Ca(OCl)2 (hypoclorit canxi); H2O2 (oxy già), cồn dùng để khử trùng mẫu sơ

bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy

- Màng lọc: Dùng để loại bỏ các tác nhân lây nhiễm có kích thước

0,025-10 µm khỏi môi trường nuôi cấy, nước cất…Đây là phương pháp phù hợp với những môi trường mà thành phần của chúng bị phân hủy bởi nhiệt độ cao Những môi trường đó được lọc vô trùng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm qua các màng có lỗ siêu nhỏ Có hai loại màng phổ biến: Màng lọc bằng thép không rỉ (màng Swinney), màng lọc bằng polypropylene (màng Swinex), đây là loại màng chỉ dùng một lần rồi bỏ (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [15]

- Buồng cấy và box cấy vô trùng:

+ Buồng vô trùng: Nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo sạch sẽ Buồng phải được tiệt trùng liên tục trước và sau khi làm việc

+ Box cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng box cấy Laminair Flow box, thiết bị này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng và thổi không khí vô trùng về phía người ngồi thao tác

- Buồng nuôi cấy: Là buồng đặt các mẫu nuôi cấy Buồng này cần đảm bảo các điều kiện: Nhiệt độ 25-30o

C, ánh sáng đạt 2000- 3000 lux, sạch sẽ và tránh tiếp xúc với bên ngoài (Phan Hữu Tôn, 2005) [9]

2.4.3 Môi trường hóa học

Môi trường hóa học cung cấp chất dinh dưỡng cơ bản cần thiết cho sự

sinh trưởng và phân hóa của mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro Thành

phần của môi trường hóa học thay đổi theo loài cây, bộ phận cây, mục đích nuôi cấy nhưng thường có các nhóm chất sau (Nguyễn Văn Uyển và cs, 1993) [14]

- Nhóm nguyên tố khoáng đa lượng

Nguyên tố đa lượng là những nguyên tố muối khoáng như: N, P, K, Mg,

Ca, Na, S, được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm Các nguyên tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trường và xây dựng nên thành tế bào, môi trường nhiều nito thích hợp cho việc hình thành chồi , với môi trường nhiều kali sẽ giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ (Trần Thị Lệ và cs, 2008) [4]

- Nito vô cơ: Được sử dụng ở dạng NO3- (nitrat) và NH4+ (amoni) riêng

rẽ hoặc phối hợp với nhau, trong đó việc hấp thụ NO3

- Hai dạng photpho thường dùng là: NaHPO4.7H2O và KH2PO4

- Kali được cung cấp cho môi trường dưới dạng Kali nitrat (KNO3), Kali Clorua (KCl), KaliDehidro Photphat (KH2PO4)

- Nguồn canxi trong môi trường cung cấp dưới dạng muối Canxi Nitrat: Ca(NO3)2.4H2O, CaCl2 6H2O, CaCl2.2H2O

- Nguồn Mg và S được cung cấp dưới dạng MgSO4.7H2O hoặc (NH4)2SO4 (Roberta H Smith, 2000) [26]

- Các Ion Na+ và Cl- cần ở nồng độ thấp và được đưa vào môi trường cùng các muối khoáng khi điều chỉnh pH môi trường

- Nhóm các nguyên tố vi lượng

Nguyên tố vi lượng là những nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ dưới 30 ppm gồm có Fe, Bo, Mn, Mo, Cu, Zn, Ni… tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi trường nuôi cấy nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của mô Hàm lượng của các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào từng môi trường nuôi cấy và từng đối tượng nuôi cấy (Lê Văn Tri, 1997) [12]

- Sắt (Fe): Thiếu Fe tế bào giảm khả năng phân chia, thiếu Fe làm giảm lượng ARN và sinh tổng hợp Protein nhưng làm tăng lượng ADN và Axit amin tự do dẫn đến giảm phân bào Fe trong môi trường thường được đưa dưới dạng muối FeSO4.7H2O, Fe(SO4)3…nhưng chúng sẽ bị kết tủa và mẫu cấy khó hấp thụ các loại muối này Do đó phải cho thêm vào môi trường nuôi cấy NaFeEDTA (Sodium ethylenediamine tetraacetate), để tạo muối phức NaFeEDTA (dạng selat) có chứa Na, Fe và mô nuôi cấy hấp thụ dễ dàng

- Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các axit amin tự do

và ADN tăng lên, nhưng ARN và sinh tổng hợp Protein giảm dần đến kém phân bào

- Bo (B): Thiếu B trong môi trường gây nên biểu hiện như thừa auxin vì thực tế B làm cho các chất ức chế Auxin Oxydase trong tế bảo giảm Mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hoá mạnh, nhưng thường là mô sẹo xốp, mọng nước, kém tái sinh (Vũ Văn Vụ và cs, 2006) [16]

- Molypden (Mo): Tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi chất trong tế bào thực vật

- Nguồn các bon

Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng rất yếu vì vậy phải

bổ sung thêm nguồn các bon để mẫu cấy có thể tổng hợp được các chất hữu

cơ giúp tế bào phân chia Thông thường nguồn các bon bổ sung là đường saccharose và glucose với liều lượng 20-30 g/l dung dịch Trường hợp cần

thiết có thể sử dụng các loại đường khác như: Maltose, Lactose và Glactose Hàm lượng đường thấp sử dụng trong nuôi cấy tế bào trần do hàm lượng cao của đường sẽ làm mất nước trong tế bào do hiện tượng thẩm thấu, ngược lại các hàm lượng cao hơn có thể dùng cho nuôi cấy hạt phấn… (Trần Thị Lệ và

cs, 2008) [4]

- Các Vitamin

Theo Czocowoki (1952) thì mô tế bào thực vật khi nuôi cấy in vitro vẫn

có khả năng tổng hợp vitamin nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu của chúng

Vì vậy phải bổ sung các vitamin cần thiết vào môi trường nuôi cấy để góp phần tạo các coenzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa trong tế bào (Vũ Văn

Vụ và cs, 2009) [18] Các vitamin thường được sử dụng như: B1 (thiamin), B2 (Ribofravin), B3 (Axit panthotenic), B5 (axit nicotinic), B6 (piridoxin) với nồng độ phổ biến là 1mg/l (Lê Văn Tri, 1997) [12]

- Thiamin (B1): Cần cho trao đổi chất hydratcacbon và sinh tổng hợp một số aminoacid, hàm lượng sử dụng 0,1-5,0 mg/l

- Acid nicitimic (vitamin B3, PP, niacin): Tham gia tạo coemzym của chuỗi hô hấp, sử dụng với hàm lượng 0,1-5,0 mg/l

- Pyridoxin (B6): Là một coenzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất, sử dụng với hàm lượng 0,1-1,0 mg/l (Nguyễn Đức Lượng và cs, 2002) [7]

Ngoài ra môi trường nuôi cấy còn bổ sung một số vitamin khác:

- Biotin (H): Là coenzym của các enzyme như hexokinaza, cacboxilaza

và nhiều enzyme khác tham gia trao đổi glixit, lipit và protein Chúng có vai trò điều chỉnh sự sinh trưởng của sinh vật Được sử dụng với hàm lượng 0,1-5,0 mg/l

- Acid foclic (B9, M): Cần thiết cho sự phân bào, thường sử dụng với hàm lượng 0,1-5,0 mg/l (Nguyễn Văn Uyển và cs, 1993) [14]

- Riboflavin (B2): Nó là coenzyme của các enzym thuộc hệ oxi hóa khử khác nhau, nhất là flavin oxidaza Hàm lượng sử dụng 0,1-10,0 mg/l

- Acid ascorbic (C): Có mặt trong nhiều loại quả, các loại củ như củ cải, khoai tây, hành Nó là thành phần quan trọng của các phản ứng oxi hóa khử Hàm lượng sử dụng 1,0-100,0 mg/l

- Acid pantothetic (B3): Có tác dụng trong sự phân giải cacbonhydrat, ngoài ra nó còn có tác dụng cường hóa vitamin C Hàm lượng sử dụng 0,5-2,5 mg/l (Nguyễn Đức Lượng và cs, 2002) [7]

- Tocopherol (E): Hàm lượng sử dụng 1,0-50,0 mg/l

Myo – Inositol: Là một loại đường rượu liên quan đến quá trình tổng hợp phospholipit, pectin của thành tế bào và hệ thống màng trong tế bào, tham gia vào dinh dưỡng khoáng, vận chuyển đường, trao đổi hydratcacbon Ngoài ra, Myo – Inositol còn tham gia tích trữ, vận chuyển, giải phóng auxin Hàm lượng sử dụng 20-1000mg/l môi trường (Edwin F.George Ph.D, 1993) [20] Myo-Inosito có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng và phát triển giống như các vitamin và trong nhiều trường hợp có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy (Lê Văn Tri, 1997) [12]

- Các chất phụ gia hữu cơ

Các chất phụ gia được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan khác như: Nước dừa, khoai tây , chuối, dịch chiết nấm men Trong thành phần của nước dừa chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, Myo – inositol và các chất có hoạt tính auxin, các gluxit của Cytokinin Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng hay được sử dụng, vì trong thành phần của chúng có chứa một số vitamin và các kích thích tố có tác dụng tích cực đến sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy Các amino acid và amit:

có vai trò quan trọng đối với sự phát sinh hình thái Các amino acid dạng L dễ dàng được mô nuôi cấy hấp thụ (Nguyễn Đức Lượng và cs, 2002) [7]

- L-arginin dùng cho nuôi cấy rễ

- L-tyrolin dùng cho nuôi cấy chồi

- L-serin dùng cho nuôi cấy hạt phấn

Hàm lượng sử dụng mỗi loại: 10-100 mg/l

- Glycin là dạng aminoacid đơn giản nhất, nhưng là nguồn tổng hợp ra Purin, một thành phần cấu trúc của vòng pophyrin trong các phân tử clorophin (Nguyễn Văn Uyển, 1993) [14]

- Các dạng amit dùng trong nuôi cấy là L-glutamin, L-asparagin… Một

số trường hợp tham gia vào cảm ứng và duy trì trong quá trình phát sinh phôi

vô tính Ngoài ra amino acid và amit còn là nguồn cung cấp nito hữu cơ cho

mô nuôi cấy

Các thành phần hữu cơ phức hợp:

- Cazein thủy phân (CH, casein hydrolysate) có chức nhiều amino acid Czein thủy phân có chứa khoảng 18-20 aminoaxit Hàm lượng sử dụng là 0,05-0,1% (W/v)

- Dịch chiết nấm men (YE, Yeast extract) có chứa hàm lượng khá cao của nhiều vitamin nhóm B, hàm lượng sử dụng 0,025-0,2% (W/v)

- Dịch chiết malt (malt extract): 0,05-0,1 (W/v)

Các loại nước ép hoa quả, củ:

quả thuộc cùng độ tuổi Vì vậy, nước dừa cũng là thành phần phức hợp không xác định, hàm lượng sử dụng của nước dừa: 10-20% (V/v) (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [15]

- Các chất làm đông cứng môi trường, chất phụ gia (giá thể)

Một số chất được sử dụng để làm môi trường nuôi cấy đông đặc lại để tạo thành giá thể cho mẫu phát triển như agar: Đây là một loại polysaccharid làm từ rong biển và có khả năng ngậm nước cao có chứa một số thành phần như Cu, Fe, Mg, Cl…và một số thành phần hữu cơ: acid béo chuỗi dài, acid hữu

cơ, ở 800

C agar ngậm nước và tồn tại ở trạng thái lỏng, còn ở dưới 400C nó tồn tại

ở trạng thái rắn Trong môi trường có tính axit cao, khả năng đông đặc của agar giảm Nồng độ thường sử dụng 5-8g/l (Đặng Văn Hùng, 2009) [2]

- Than hoạt tính (Activated charcoal, AC)

Được dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp… trong trường hợp những chất đó có tác dụng gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu

Than hoạt tính hút các chất hữu cơ như phytohoocmon, vitamin, sắt chelat… (Nguyễn Đức Thành, 2000) [10] Hàm lượng sử dụng là 0,2-0,3 (W/v) Than hoạt tính làm giảm hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng Làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có than hoạt tính, có thể kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ

Một số trường hợp, thúc đẩy phát sinh phôi vô tính và kích thích sinh trưởng, phát sinh cơ quan ở các loài cây gỗ (Trigiano.R.N, Gray.D.J, 1999) [22] Chât chống oxi hóa: Than hoạt tính là một trong những chất chống oxi hóa tốt, ngoài ra có thể đưa vào môi trường nuôi cấy một số chất chống oxi hóa khác như: acid xitric, thiourea, poliviny pyrrolidon (PVP, 250-1000 mg/l), acid ascorbic (Phan Hữu Tôn, 2005) [9], (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [15]

- pH của môi trường

Là yếu tố quan trọng, nó ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường vào mẫu cấy Thực tế đã chứng minh khi pH thấp (pH < 4,5) hoặc cao hơn (pH > 7) đều gây ra ức chế sinh trưởng, phát triển của mô và tế bào nuôi cấy Nếu pH của môi trường giảm mạnh mẽ sẽ làm rối loạn quá trình trao đổi Fe, làm giảm hay ngừng hẳn quá trình sinh trưởng của mẫu cấy, thường pH dao động trong khoảng từ 5,5 – 6,5 trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Đối với mô sẹo của nhiều loài cây, pH ban đầu thường là 5,5- 6,0 và sau 4 tuần nuôi cấy đạt được 6,0- 6,5 Đặc biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc axit cao như acid amin, vitamin thì nhất định phải dùng NaOH để làm tăng hoặc dùng HCl loãng để làm giảm pH môi trường về 5,5- 6,5 (Trần Thị Lệ và cs, 2008) [4]

- Các chất điều hòa sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hòa sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy (Vũ Văn Vụ và

cs, 2009) [15]

Dựa vào hoạt tính sinh lý phân chia chất điều hòa sinh trưởng thành 2 nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm chất ức chế sinh trưởng Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng (Nguyễn Kim Thanh và cs, 2005) [10]

- Nhóm Auxin: Được phát hiện lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con

trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch Sau

đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn hoa Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng

và phát triển trên cơ thể thực vật Cụ thể như sau: Auxin có tác dụng kích thích kích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ quan, kiểu tác động của

nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hóa màng tế bào Các auxin được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và dãn nở tế bào, tăng cường quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách) Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích thích sự phân chia của tế bào trụ bì nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ và biểu

bì Ngoài ra, auxin còn có tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụng lá (Nguyễn Như Khanh và cs, 2011) [3], (Lê Văn Tri,1997) [12]

- Các auxin thường được sử dụng là NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA (auxin tự nhiên) Hoạt tính của các chất này được xếp theo thứ tự

từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4D IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân hủy trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy mô NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus Nồng độ auxin dùng trong nuôi cấy dao động tuỳ từng chất và đối tượng nuôi cấy nhưng thường trong khoảng 0,001-10 mg/l (Trần Thị Lệ và cs, 2008) [4]

- Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX,

chất đầu tiên là kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích Tiếp đó, đến Zeatin tách từ nội nhũ của hạt ngô non Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim Zeatin có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một

số vi khuẩn Trong thực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi

chất Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu thế đỉnh Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin Ngoài ra, cytokinin còn làm chậm sự già hóa (Nguyễn Như Khanh, 2011) [3] Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng phổ biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin với tỷ lệ thích hợp có khả năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền với nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea (Trần Thị Lệ và cs, 2008) [4]

Theo những nghiên cứu của Miller và Skoog cho thấy trong môi trường nuôi cấy nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo rễ, nếu thấp mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo chồi, còn nếu tỷ lệ này gần bằng 1 thì mẫu nuôi cấy sẽ biệt hoá theo hướng tạo mô sẹo (Nguyễn Đức Thành, 2000) [11] Theo Das (1958) và Nistach (1968) cho rằng chỉ khi có tác dụng đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN dẫn đến quá trình phân chia tế bào Hàm lượng cytokinin sử dụng dao động từ 0,5-5mg/l

- Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm

bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938 Gibberellin được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển Gibberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích thước của chồi nuôi cấy GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất (Trâng Thị Lệ và cs, 2008) [4]

Ngoài các chất có tác dụng kích thích trên còn có các chất có tác dụng ức chế sinh trưởng, phát triển khác như ABA, Etylen cũng gây ảnh hưởng khá rõ

tới sự phát sinh hình thái của một số cây trồng trong nuôi cấy in vitro

2.4.4 Môi trường vật lý

Nhiệt độ

Là yếu tố vật lý quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất trong mô cấy, đồng thời nó ảnh hưởng tới sự hoạt động của auxin Nhiệt độ nuôi cấy cần được giữ ổn định ở 25±20c (Vũ Văn

Vụ và cs, 2006) [16], (Nguyễn Như Khanh và cs, 2011) [3]

Ánh sáng

Các nghiên cứu đã cho thấy ánh sáng rất cần cho sự phát sinh phát triển hình thái của mẫu cấy Các loại mẫu cấy khác nhau có nhu cầu về thời gian chiếu sáng, cường độ và ánh sáng khác nhau Thời gian chiếu sáng thường biến động từ 12-18h/ngày (Nguyễn Đức Thành, 2000) [11], (Vũ Văn Vụ, 2006) [16]

- Cường độ ánh sáng: Là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, với những cường độ ánh sáng khác nhau

- Loại ánh sáng: Có thể sử dụng ánh sáng tự nhiên cho những loại mô tế bào cần cường độ ánh sáng thấp, ánh sáng đỏ kích thích kéo dài chồi, thân so với ánh sáng trắng

- Do vậy trong các phòng thí nghiệm, sử dụng nguồn năng lượng ánh sáng là các đèn huỳnh quang, đặt cách trên các bình nuôi cấy khoảng 20-25

cm, sẽ cho cường độ ánh sáng đạt tiêu chuẩn 2000-3000 lux (Nguyễn Như Khanh và cs, 2011) [3]

Độ ẩm

Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn 100% nên không cần quan tâm nhiều đến độ ẩm nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng và cs, 2002) [7]

2.5 Những vấn đề trong nhân giống in vitro

2.5.1 Tính bất định về mặt di truyền

Tính bất định về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinh trưởng, tần số biến dị thường khác nhau và không lặp lại Việc nuôi cấy

mô sẹo, tế bào đơn thường có tần số biến dị cao hơn so với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Tần số biến dị xảy ra còn phụ thuộc vào các yếu tố:

+ Kiểu di truyền hay giống cây nuôi cấy

+ Loại mô cấy

+ Số lần cấy chuyển nhiều hay ít, trong đó loại biến dị về nhiễm sắc thể sẽ xuất hiện cao khi thời gian nuôi cấy kéo dài, số lần cấy chuyển ít và thời gian cấy chuyển giữa 2 lần ngắn sẽ làm giảm khả năng gây biến dị (Nguyễn Đức Lượng, 2002) [7], (Nguyễn Đức Thành, 2000) [11]

2.5.2 Sự nhiễm mẫu

Môi trường hoá học nuôi cấy mẫu rất giàu các chất hữu cơ và vô cơ nên cũng rất thuận lợi cho nấm bệnh và vi khuẩn phát triển, nếu không được vô trùng hoặc môi trường nuôi cấy bị nhiễm mầm bệnh, vi sinh vật sinh trưởng nhanh hơn mẫu nuôi cấy, sử dụng các chất của môi trường đồng thời tiết ra các chất làm chết mẫu cấy

Mẫu cấy được sống trong điều kiện môi trường tự nhiên nên có rất nhiều mầm bệnh, nguồn bệnh có thể tiềm ẩn ngay trong mẫu cấy, trong bình cấy, ống nghiệm, môi trường nuôi và dụng cụ cấy Mặc dù trước khi cấy mẫu được khử trùng nhưng chỉ tiêu diệt được các vi sinh vật nấm, còn mẫu cấy bị nhiễm virus thì rất khó loại trừ Vì vậy khi sử dụng mô phân sinh đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy do vùng này chưa bị virus xâm nhiễm cũng như chưa phân hoá mô dẫn truyền nên mẫu cấy vừa sạch virus và vi khuẩn (Phan Hữu Tôn, 2005) [9]

Có thể sử dụng một số chất kháng sinh để diệt vi khuẩn và nấm, song cũng chính các chất này có thể gây hại cho mẫu cấy

2.5.3 Sự hoá thuỷ tinh thể

Hiện tượng thuỷ tinh thể là một bệnh lý của cây, cây sẽ bị mất nước khi

chuyển cây từ môi trường in vitro ra môi trường ngoài (Nguyễn Kim Thanh

và cs, 2005) [10]

Nguyên nhân là do cây in vitro có lớp sáp bên ngoài biểu bì mỏng, tế bào

chứa nhiều phân tử có cực dễ dàng nhận các phân tử nước Về cấu tạo khí khổng của cây thường có hình tròn thay vì hình elíp như cây trong tự nhiên, khí khổng mở suốt trong quá trình nuôi cấy và mật độ khí khổng cao Ngoài

ra nhu mô thịt lá và lớp mô bảo vệ mặt ngoài của lá kém phát triển, tế bào chất kém đậm đặc, diệp lục ít so với cây bình thường Có một số phương pháp

giúp hạn chế quá trình hoá thuỷ tinh thể như sau:

+ Giảm sự hút nước của cây trong in vitro bằng cách tăng nồng độ

đường trong nuôi cấy hoặc dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao Tuy nhiên điều này có thể làm giảm sự tổng hợp của diệp lục tố và ức chế sự hình thành chồi (Trần Thị Lệ và cs, 2008) [4]

+ Tránh gây thương tổn trên mẫu cấy khi khử trùng và tiếp xúc với môi trường cấy ít nhất

+ Giảm nồng độ đạm trong môi trường cấy

+ Giảm C2H2 trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt, tăng cường ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy (Nguyễn Đức Lượng và cs, 2002) [7]

2.5.4 Kiểu gen

Kiểu gen đóng vai trò quan trọng trong nuôi cấy mô thành công, có những dòng tốt nhưng rất khó tái tạo thành cây, phải tìm điều kiện tối ưu cho từng kiểu gen (Nguyễn Kim Thanh và cs, 2005) [10]

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Giống cây rau Sắng được thu thập từ tỉnh Thái Nguyên

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng

đến khả năng vô trùng mẫu rau Sắng và ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi rau Sắng

3.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.4.1.Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nhiệm nuôi cấy mô của Bộ môn Công Nghệ Tế Bào của Viện Khoa học Sự Sống thuộc trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

3.4.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 1/12/2014 đến tháng 31/05/2015

3.5 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô trùng mẫu rau Sắng

- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng

đến khả năng tái sinh chồi rau Sắng

3.6 Phương pháp nghiên cứu

3.6.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô trùng mẫu rau Sắng

- Vật liệu vô trùng: Mẫu lấy là các mầm ngủ của thân, cành cây rau Sắng

- Phương pháp xử lý mẫu:

 Cành cây rau Sắng non lấy về thì cắt bỏ lá

 Rửa sạch bằng xà phòng dưới vòi nước chảy

 Xịt cồn và đưa mẫu vào tủ cấy vô trùng

 Cắt thành từng đoạn ngắn mỗi đoạn chứa môt mắt ngủ

 Đoạn cắt đươc lắc qua cồn 70oC trong vòng 30 giây đến 1 phút

 Tráng mẫu từ 1 đến 2 lần bằng nước cất vô trùng

 Lắc mẫu nuôi cấy trong hóa chất khử trùng theo nội dung từng công thức một

 Tráng sạch mẫu bằng nước cất vô trùng từ 4-5 lần

 Cấy mẫu đã khử trùng vào môi trường nuôi cấy

- Hóa chất khử trùng: H2O2 nồng độ 20%, viên khử trùng Johnson (2,5 mg/l) và HgCl2 nồng độ 0,1%

- Phương pháp bố trí thí nghiệm:

Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 20 mẫu:

 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch H2O2 nồng độ 5% đến khả năng vô trùng mẫu

- Kết quả: Đánh giá và thu thập số liệu sau 20 ngày nuôi cấy

 Tỷ lệ mẫu nhiễm:

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm × 100%

Tổng số mẫu nuôi cấy

 Tỷ lệ mẫu sạch:

Tỷ lệ mẫu sạch (%) = Tổng số mẫu sạch × 100%

Tổng số mẫu nuôi cấy

 Tỷ lệ mẫu chết do hóa chất

Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng số mẫu chết do hóa chất × 100%

Tổng số mẫu nuôi cấy

3.6.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi rau Sắng

Mẫu nuôi cấy được sử dụng là các mắt ngủ của đỉnh sinh trưởng rau Sắng đã được vô trùng thành công ở nội dung 1 Cấy các chồi này vào trong môi trường tái sinh có môi trường cơ sở là môi trường MS bổ sung thêm agar 6,0 g/l; 0,1 g myo-inositon/l; pH =5,6-5,8; đường saccharose 30 g/l và bổ sung thêm một số chất điều tiết sinh trưởng là kinetin, BAP,IAA và IBA Các công thức trong thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 15 mẫu:

 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi