Nghiên cứu môi trường nhân giống lan Phi Điệp bằng kĩ thuật nuôi vấy mô tế bào

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM  PHẠM THỊ THẢO NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG LAN PHI ĐIỆP Dendrobium anosmum BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO KHÓA LUẬN TỐT N

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM



PHẠM THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG

LAN PHI ĐIỆP (Dendrobium anosmum) BẰNG

KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM



PHẠM THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG

LAN PHI ĐIỆP (Dendrobium anosmum) BẰNG

KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH: SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Tâm

Thái Nguyên, năm 2014

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện khóa luận, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đếnPGS TS Nguyễn Thị Tâm là giáo viên hướng dẫn, cô đã hướng dẫn tận tình và tạomọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cô Trần Thị Hồng – kĩ thuật viên phòng Côngnghệ tế bào – Vi sinh và toàn thể các thầy cô trong khoa Sinh – KTNN đã giúp đỡtôi rất nhiều trong suốt thời gian làm đề tài

Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, đã luôn

ở bên cạnh động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài

Trong qua trình thực hiện khóa luận, khó tránh khỏi những sai sót Vì vậy,tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp từ thầy cô và bạn bè

Xin cảm ơn thầy cô và các bạn!

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2014

Sinh viên

Phạm Thị Thảo

MỤC LỤC

Trang

Trang bìa phụ i

LỜI CẢM ƠN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Một vài nét giới thiệu về chi Dendrobium và lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 3

1.1.1 Giới thiệu về chi Dendrobium 3

1.1.2 Lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 4

1.2 Kĩ thuật nuôi cấy mô – tế bào trong công nghệ tế bào thực vật 5

1.2.1 Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy mô - tế bào 5

1.2.2 Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính 6

1.2.3 Quy trình nhân giống in vitro 7

1.2.4 Một số thành tựu của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào trong lĩnh vực nhân giống cây trồng 9

1.3 Hiện trạng canh tác hoa lan ở Việt Nam 11

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU 13

2.1 Vật liệu thực vật 13

2.2 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Phương pháp pha môi trường nuôi cấy 14

2.3.2 Thăm dò môi trường nuôi cấy 15

2.4 Tính toán kết quả 16

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

3.1 Ảnh hưởng của BAP tới sự sinh trưởng và phát triển của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 18

3.2 Ảnh hưởng của kinetin lên sự phát sinh chồi của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 21

3.3 Ảnh hưởng của α- NAA đến sự phát sinh rễ của lan Phi Điệp 26

(Dendrobium anosmum) 26

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của môi trường PM 13

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của BAP tới tỷ lệ tạo chồi và tạo protocorm ở lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 19

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP tới sự phát triển chồi của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 20

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của kinetin tới tỷ lệ tạo chồi và tạo protocorm của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 23

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát triển chồi của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 24

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ α- NAA đến sự ra rễ ở lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 27

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và α-NAA tới sự ra rễ của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 29

CT 29

Số rễ/ chồi 30

Chiều dài rễ 30

(cm) 30

Màu sắc lá 30

Sau 4 tuần 30

1,88±0,15 30

1,33±0,09 30

2,65±0,12 30

1,95±0,05 30

2,36±0,04 30

1,84±0,17 30

2,27±0,08 30

1,71±0,03 30

Sau 6 tuần 30

1,95±0,06 30

1,46±0,11 30

2,88±0,07 30

2,45±0,04 30

2,52±0,06 30

1,96±0,08 30

2,48±0,15 30

1,87±0,09 30

Sau 8 tuần 30

2,11±0,03 30

1,58±0,07 30

3,15±0,04 30

2,76±0,05 30

2,73±0,09 30

2,21±0,02 30

2,67±0,08 30

1,96±0,05 30

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của kinetin và α-NAA tới sự ra rễ của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 32

DANH MỤC HÌNH

TrangHình 1.1 Hình ảnh hoa lan Dendrobium anosmum 5Hình 3.1 Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) sau 8 tuần nuôi cấy 21Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) sau 8 tuần 25Hình 3.3 Ảnh hưởng của BAP 0,7 mg/l và kinetin 1mg/l lên sự sinh trưởng và phát triển của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 25Hình 3.4 Ảnh hưởng của α – NAA tới sự ra rễ của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) sau 8 tuần nuôi cấy 28Đưa cây ra ngoài vườn ươm là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi với thay đổi của nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn Đây là giai đoạn quyết định khả năng ứng dụng quy trình nhân giống in vitro Các loại giá thể gồm: than hoa, dớn, xơ dừa Theo dõi sự phát triển củacây lan trong giai đoạn đầu ngoài môi trường nuôi cấy, tôi tiến hành trồng 30 cây con trên các giá thể than hoa, dớn, xơ dừa, than củi + xơ dừa, than củi + dớn và xơ dừa + dớn Kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.10 34

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MS Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)

α – NAA α – Naphthalene acetic acid

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Hoa lan là một trong những loài hoa đẹp nhất, tinh khiết, vương giả cao sang,cùng với vẻ đẹp rực rỡ về màu sắc, quyến rũ về hình dáng, hoa lan còn có côngdụng làm thuốc chữa bệnh mà từ ngàn xưa các danh y đã dùng để cứu người Hoalan đã trở thành một mặt hàng có giá trị trong kinh doanh, xuất khẩu trên thế giới.Các nước có ngành nuôi trồng hoa lan phát triển, hàng năm kim ngạch xuất khẩulên đến hàng trăm triệu USD Vì vậy, việc ứng dụng các kĩ thuật sinh học trong việcnhân nhanh các giống hoa lan ngày càng phát triển [19]

Hiện nay, trên thế giới ngành công nghệ sinh học phát triển rất mạnh mẽ,việc ứng dụng các công nghệ cao như: hệ thống fermenter, bioreactor, quang tựdưỡng…, với mục đích nhân nhanh các giống cây trồng Việc ứng dụng kĩ thuậtnuôi cấy mô tế bào thực vật đã thu được những thành công rực rỡ trong việc nhângiống cây trồng Ở nước ta trong những năm gần đây công nghệ này đã được thựchiện ở một số phòng thí nghiệm của một số trường Đại học, Viện nghiên cứu hoặcTrung tâm Công nghệ Sinh học Những kết quả bước đầu trong nghiên cứu và ứngdụng rất khả quan trên một số đối tượng như: khoai tây, chuối, mía, hoa lan, các câythuốc… [1], [6]

Dendrobium anosmum là một giống lan thường mọc ở các quốc gia thuộc

vùng Đông Nam Á, nhưng nay phổ biến trên khắp thế giới bởi vì khá dễ trồng,nhiều hoa và hương thơm ngào ngạt [19] Ngoài giá trị làm cảnh, cây còn đượcdùng trong y học với tên gọi Thạch hộc Thạch hộc có vị ngọt nhạt, hơi mặn, khôngđộc, tính lạnh, có tác dụng tư âm bổ thận, trừ phiền chỉ khát, ích vị sinh tân, bổdưỡng thanh nhiệt, chỉ khát, sinh tân dịch chữa lao lực, gầy yếu, ho, sốt nóng,miệng khô khát, mồ hôi trộm, thiểu năng sinh dục ở nam giới, chân tay và lưng đaunhức, nóng trong, đau dạ dày, viêm ruột [24]

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, là môi trường thuận lợi cho việcnuôi trồng và phát triển hoa lan Việt Nam có tới trên 1100 loài lan, trong đó cónhiều loài lan rừng quý hiếm được thế giới biết đến Tuy nhiên, loài lan rừng đangtrong tình trạng báo động vì tình trạng khai thác bừa bãi của con người [10]

Hiện nay, ngày càng có nhiều cở sở kinh doanh hoa lan mọc lên, với nhiềuchủng loại, nhưng để có số lượng lớn cây giống, đồng đều và sạch bệnh là một vấn

đề khó Do đó, để góp phần vào việc nhân giống bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tạo rahàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền, sạch bệnh và đáp ứng giá cả, chúng tôi

chọn đề tài: “Nghiên cứu môi trường nhân giống lan Phi Điệp (Dendrobium

anosmum) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô – tế bào”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tìm được môi trường thích hợp cho việc nhân giống lan Phi Điệp

(Dendrobium anosmum) trong ống nghiệm.

Xác định được giá thể thích hợp để đưa cây lan Phi Điệp Dendrobium anosmum từ trong ống nghiệm ra môi trường tự nhiên.

3 Nội dung nghiên cứu

- Thăm dò ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm

cytokinin đến sự phát sinh chồi của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) trong

ống nghiệm

- Thăm dò ảnh hưởng của kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin đến sự ra

rễ của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) trong ống nghiệm.

- Thăm dò ảnh hưởng của tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm

auxin và nhóm cytokinin lên sự sinh trưởng của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) trong ống nghiệm

- Nghiên cứu tìm ra loại giá thể thích hợp nhất cho ra cây lan Phi Điệp (xơdừa, rong biển, than củi …)

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một vài nét giới thiệu về chi Dendrobium và lan Phi Điệp (Dendrobium

anosmum)

1.1.1 Giới thiệu về chi Dendrobium

Phong lan có vùng phân bố rộng lớn, trải dài từ đường xích đạo cho đến Bắc

cực, từ đồng bằng cho đến các vùng núi băng tuyết Họ phong lan (Orchidaceae) với 750 chi và hơn 25000 loài là họ lớn thứ hai sau họ cúc (Asteraceae) trong ngành hạt kín (Angiospermae) và cũng là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm [5].

Chi Hoàng thảo (Dendrobium) là một chi lớn trong họ Phong lan Hiện nay, chi này bao gồm hơn 1200 loài được chia thành 40 nhóm thuộc dòng Dendrobiinae Chi Dendrobium được phân bố rộng rãi nhiều ở vùng Nam Á, Đông Á và Đông

Nam Á cho đến Philippines, Borneo, Autralia, NewZealand, riêng ở Việt Nam cótrên 110 loài [21]

Về đặc điểm hình thái bên ngoài của chi Dendrobium:

Rễ chi Dendrobium thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật được bao bọc

bởi một lớp mô xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nước, muối khoáng và ngăn chặnánh sáng mặt trời gay gắt Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạpkhông bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp [5] Rễ của lan

Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị mục

nát và cây bị chết [5]

Thân lan Dendrobium thuộc loài đa thân có hệ thống nhánh nằm ngang bò

dài trên giá thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ Thân có dạng mọc thẳng hoặc

rũ xuống [5]

Giả hành là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhàylàm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khôhạn khi cây sống bám trên cao Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thểquang hợp được [8] Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng: hình cầu,thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ [6]

Lá có hình kim, trụ hay phiến mỏng Dạng lá mềm mại, mọng nước, dai, cómàu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây Phiến lá trải rộnghay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình

chữ V [5] Các loài thuộc giống Dendrobium đôi khi trút lá vào mùa khô hạn Sau

đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mưa thì cho chồi mới [2]

Dendrobium có cụm hoa mọc từ thân thành từng chùm, trên một cành hoa có

những chiếc hoa đơn xếp theo hình xoắn ốc, các hoa đơn liền cành nhờ cuống.Cuống kéo dài cho tới bầu hoa tạo ra ba lá noãn (bầu hoa được tạo thành bởi 3 láđài, 3 cánh hoa và một trụ hoa) [2]

Quả họ Orchidaceae có quả thuộc quả nang Khi hạt chín, các nang bung ra

chỉ còn dính lại với nhau ở đỉnh gốc Ở một số loài khi chín quả không nứt ra nênhạt chỉ ra khỏi quả khi bị mục nát [5]

Quả chứa 10.000 – 100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt có kích thước rất nhỏnên phôi hạt chưa phân hóa Sau 3 – 5 tháng hạt chín và phát tán nhờ gió [5]

1.1.2 Lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum)

Lan Phi Điệp có tên khoa học là Dendrobium anosmum, thuộc họ Hoàng thảo (Dendrobium) Lan Phi Điệp còn có tên gọi khác như: Giả hạc, Hoàng thảo đùi gà,

Hoàng thảo dẹt, Huỳnh thảo, Co vàng sao (Thái) Cây được dùng trong y học cổtruyền với tên thuốc là Thạch hộc hay Kẹp thảo [19] Cây thường dùng chữa miệngkhô táo khát, phổi kết hạch, đau dạ dày ợ chua, không muốn ăn, di tinh, sau khi khỏibệnh bị hư nhược, đổ mồ hôi trộm, lưng gối đau mỏi, nhiệt bệnh thương tổn đến tândịch Liều dùng 8-10g, dạng thuốc sắc Thạch hộc thường dùng trong các bệnh như

ho khan, khô cổ, háo người, dùng cho các bệnh nhân nam giới sinh hoạt không điều

độ bị đau lưng mỏi gối, bệnh nhân bị thiểu năng sinh dục Dùng riêng hoặc phốihợp với các vị thuốc khác: chữa ho thì phối hợp với Mạch môn, vỏ Quýt khô; chữađau lưng mỏi gối, gia thêm Câu kỷ, Ngưu tất [24]

Thân dài tới 1,2m buông rũ xuống Lá mọc đối cách dài 8cm – 12cm, rộng từ4cm – 7cm Hoa to tới 10cm mọc từ 1 – 3 chiếc ở các đốt đã rụng lá, nở vào mùa

xuân Dendrobium anosmum có hai màu sắc chính là tím hồng và trắng Tuy nhiên

khá nhiều biến dạng hồng nhạt, hồng thẫm hoặc cánh trắng lưỡi tím, nhưng rất dễ

nhầm lẫn với Dendrobium parishii thân ngắn chỉ chừng 30cm –40cm và hoa tím sẫm

hơn nhiều Hoa có hương thơm ngào ngạt và lâu tàn (3 – 4 tuần) Nhiều hoa trên mộtphát hoa, một cây nếu mạnh khỏe có thể ra tới 50 – 70 hoa [20] Sau khi hoa tàn,những đốt gần trên ngọn hoặc ở gần dưới gốc thường nảy sinh ra những cây con

Hình 1.1 Hình ảnh hoa lan Dendrobium anosmum

Giống lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) được trồng nhiều nhất vì nó tương

đối dễ trồng, khả năng chịu nóng, lạnh tương đối tốt Loài lan này cần nhiều ánh sáng,nuôi trồng trong điều kiện nhiệt độ là 8 – 250C, độ ẩm khoảng 60 – 70% [22]

1.2 Kĩ thuật nuôi cấy mô – tế bào trong công nghệ tế bào thực vật

1.2.1 Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy mô - tế bào

Nhân giống in vitro là một trong những ứng dụng chính của công nghệ tế bào

thực vật, sử dụng môi trường nhân tạo để nhân đỉnh sinh trưởng hoặc các mô phânsinh trong cây Theo các công trình nghiên cứu thì chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồimới đảm bảo sự ổn định về di truyền, tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thướcnhỏ, kết hợp xử lý nhiệt làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống [1]

Mục đích của kĩ thuật nhân nhanh giống, đó là: (1) Duy trì và nhân nhanhcác kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác chọn giống; (2) Duy trì và nhân nhanhcác cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các cây trồng khác nhau; (3) Nhânnhanh với điều kiện vô trùng cách li tái nhiễm kết hợp với việc làm sạch bệnh chocây; (4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài tự nhiên có đặc điểm tốt vàosản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sản xuất; (5) Bảo quản tốt tậpđoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen [1].

Ngành công nghiệp nuôi cấy mô – tế bào phát triển và mở rộng trong nhữngnăm gần đây do yêu cầu về chất lượng cây giống tăng lên nhanh chóng trên toàn thếgiới nhằm phục vụ những dự án trồng lại rừng, sản xuất lương thực, thực phẩm,thức ăn gia súc, nông nghiệp và bảo vệ môi trường

Vì vậy, nuôi cấy mô – tế bào đã mang lại hiệu quả hết sức to lớn nhờ có các

ưu thế, đó là: (1) Hệ số nhân giống cao rút ngắn thời gian đưa con giống vào sảnxuất Trong phần lớn các trường hợp công nghệ nuôi cấy mô tế bào đảm bảo tốc độnhân nhanh, từ một cây trong vòng 1 – 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây [8];(2) Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ; (3) Làm sạch bệnhcây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh; (4) Thuận tiện việc vận chuyển vàbảo quản; (5) Sản xuất quanh năm, quy trình sản xuất có thể được vận hành trongbất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm [17]

1.2.2 Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính

1.2.2.1 Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng

Khái niệm mô phân sinh chỉ đúng khi mẫu vật nuôi cấy được tách đúng từđỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của đỉnh sinhtrưởng [1] Trong thực tế, mẫu nuôi cấy được tách với kích thước đó chỉ khingười ta tiến hành nuôi cấy với mục đích làm sạch bệnh cây trồng, do đó phảikết hợp các yếu tố tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu Một đỉnh sinh trưởng nuôicấy ở điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi và các chồi sẽphát triển thành cây hoàn chỉnh

Xét về nguồn gốc của cây có ba khả năng:

- Cây phát triển từ chồi đỉnh

- Cây phát triển từ chồi nách

- Cây phát triển từ chồi mới phát sinh

Ở lan có sự phát triển qua giai đoạn dẻ hành, cùng một lúc đỉnh sinh trưởngtạo hàng loạt protocrom lại tiếp tục phân chia cho ra các protocrom mới hay cácchồi mới tạo thành cây hoàn chỉnh

1.2.2.2 Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây

Ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công,các bộ phận còn lại của một cơ thể thực vật đều có thể ứng dụng cho nuôi cấy mô –

tế bào [17] Như các đoạn thân, cuống lá, các bộ phận của hoa, nhánh củ

1.2.2.3 Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo

Trong khuôn khổ mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoànchỉnh trực tiếp từ mẫu cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây màcác cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền Tuy nhiên trong nhiều trường hợp mônuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo Tế bào mô sẹokhi cấy nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền [17]

Một phương hướng nhân giống vô tính nữa là tạo phôi soma từ tế bào mô

sẹo phương pháp này đã thành công ở hai đối tượng: Cà rốt (Daucus carota) và thuốc lá (Nicotiana tabacum).

1.2.3 Quy trình nhân giống in vitro

Theo Đỗ Năng Vịnh (2002) quy trình nhân giống mô – tế bào gồm các giaiđoạn sau [17]:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây giống

Vì trong nuôi cấy cây con sẽ mang những đặc tính và tính trạng của cây mẹban đầu nên trong giai đoạn này cần chọn lọc cây mẹ cẩn thận, cây mẹ thường làcây tốt có giá trị kinh tế cao Sau đó, chọn cơ quan để lấy mẫu thường là mô non,đoạn thân có chồi ngủ, lá non, hoa non…

Mô chọn để nuôi cấy thường có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôicấy sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý báu của cây mẹ, ít có nguy cơbiến dị, tùy theo điều kiện, giai đoạn này có thể kéo dài 3 – 6 tháng

Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng

Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy, giai đoạnnày được tiến hành theo các bước: Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các mẫunuôi cấy Tiếp theo cấy mẫu vật đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy

có sẵn môi trường nhân tạo (giai đoạn này gọi là cấy mẫu in vitro) Các mẫu nuôi

cấy nếu không bị nhiễm nấm, virut sẽ được nuôi trong phòng nuôi cấy với điều kiệnnhiệt độ, ánh sáng phù hợp Sau một thời gian nhất định từ mẫu nuôi cấy đã xuấthiện các cụm tế bào, các cơ quan hoặc các phôi vô tính Giai đoạn này yêu cầu từ 2– 12 tháng hoặc ít hơn 4 lần cấy các mảnh [17]

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn sản xuất cây nhân giống, quyết định hiệu quả của quy trìnhnuôi cấy mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy Khi mẫu cấysạch đã được tạo ra và từ đó nhân được các cụm chồi và các phôi vô tính sinhtrưởng tốt trong quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất Người ta cần tạo

ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy Thành phần và điều kiệnnuôi cấy cần tối ưu hóa nhằm đạt mục tiêu nhân nhanh Quy trình cấy chuyển đểnhân nhanh chồi thường trong khoảng 1 – 2 tháng tùy loài cây Tỉ lệ nhân nhanhkhoảng 2 – 8 lần sau mỗi lần cấy chuyển Nhìn chung giai đoạn này thường kéo dài

từ 10 – 36 tháng Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéodài quá lâu Ví dụ: từ đỉnh sinh trưởng của một cây chối chọn lọc ban đầu người tachỉ nhân lên 2000 – 3000 chồi sau 7 – 8 lần cấy chuyển để tránh biến dị soma Đốivới các cây khác như mía, hoa cúc, phong lan sau một năm có thể nhân lên1.000.000 chồi từ cây mẹ ban đầu [13]

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi được hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh,nhưng thông thường các chồi này phải chuyển sang một môi trường khác để kíchthích tạo rễ Ở một số loài khác thì các chồi tạo rễ trước khi chuyển trực tiếp ra đất,thông thường giai đoạn này cần 2 – 8 tuần [17]

Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

Đây là giai đoạn đầu cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thínghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên, giai đoạn này quyết định khả năng ứng dụng

của quy trình nhân giống mô – tế bào Đối với một số loài có thể chuyển cây ra đấtkhi chưa có rễ, nhưng với đa số các loài cây trồng thì chỉ sau khi chồi đã tạo rễ vàtạo cây hoàn chỉnh thì mới được chuyển ra ngoài vườn ươm Quá trình thích nghivới điều kiện bên ngoài của cây được yêu cầu chăm sóc đặc biệt Vì vậy đượcchuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với những điều kiện khókhăn hơn, nên vườn ươm cần đáp ứng các yêu cầu: Che cây con bằng nilon bao phủ

và có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm làm mát cây Giá thể trồng cây có thể làđất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển… giaiđoạn này thường đòi hỏi 4 đến 16 tuần [17]

1.2.4 Một số thành tựu của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào trong lĩnh vực nhân giống cây trồng

Nuôi cấy mô – tế bào là một thành tựu khoa học lớn của loài người Vào đầunhững năm 1960, kỹ nghệ nuôi cấy mô trong nhân giống phong lan trong ống

nghiệm đã được áp dụng thành công Những cây thược dược (dahlia) sạch virut

được tạo ra bằng cách dùng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy Hiện có hơn 22 chi phonglan được nhân giống phổ biến thông qua con đường nuôi cấy mô Công ty sản xuấthạt lai Mỹ - Ấn ở Bangalore (Ấn Độ) đã đầu tư trang thiết bị để nhân giống in vitro

và xuất khẩu được hàng triệu cây con sang châu Âu, đã bán hàng trăm ngàn cây

dứa, cây bạch đậu khấu (cardamon) cho nông dân Ấn Độ Năm 1989, hơn 100.000

cây cà phê con vô tính được nhân giống để cung cấp cho các nước Châu Mỹ latinh[16]

Nuôi cấy mô - tế bào thực vật đã được tiến hành trên 20 năm ở nước ta.Hiện nay trên cả nước có trên 50 phòng nuôi cây mô – tế bào nằm ở các trường Đạihọc, Viện nghiên cứu, trung tâm Công nghệ Sinh học Quy trình công nghệ nhângiống đã được nhiều viện nghiên cứu và các trường đại học nghiên cứu hoàn thiện ởnhiều giống cây trồng khác nhau như: mía, cà phê, hoa lan, cây cảnh và nhân nhanhcác giống cây ăn quả sạch bệnh như đu đủ, dâu tây… [17]

Nhân nhanh chuối (2 triệu cây/năm), nhân nhanh khoai tây sạch bệnh, nhânnhanh các giống mía nhập nội (trong vài năm đã tạo ra 5.330 ha mía giống K84-

2000 từ một ngọn mía nhập nội từ Thái Lan); nhân nhanh các giống bạch đàn chọn

lọc và keo lai đạt 3 triệu cây/năm Quy trình nhân nhanh giống chuối và giống mía

đã được Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn công nhận và áp dụng để chuyểngen kháng sâu đục thân [13]

Nước ta nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, rất thích hợp cho cây

ăn quả nhiệt đới phát triển Hiện nay nước ta có rất nhiều vùng chuyên canh cây ănquả được mở rộng, phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu, nhu cầu của côngnghiệp chế biến hoa quả bằng công nghệ nuôi cấy mô đã có nhiều công trình đượccông bố trên các đối tượng khác nhau như: đu đủ, dưa hấu, mía,…

Bùi Thị Tường Thu và cộng sự (2003) đã tiến hành vi nhân giống cây đu đủ

(Carica papaya linn), từ chồi đỉnh sinh trưởng của cây trưởng thành có kích thước

1cm – 1,5cm được khử trùng và cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung các chất

kích thích sinh trưởng Kết quả đã đưa được quy trình nuôi cấy in vitro là 30 ngày,

cây con sinh trưởng và phát triển bình thường ngoài môi trường tự nhiên [15]

Nguyễn Thái Hà và cộng sự (2003) nghiên cứu sự phát sinh củ in vitro các

giống hoa Lilium spp Trên đối tượng giống hoa Lili nhập từ Mĩ được cấy trên môi

trường cơ bản MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng đã đưa ra được quy

trình nhân giống củ in vitro các giống hoa Lilium spp [4]

Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Kim điệp (Dendrobium chrysotoxum), Nguyễn Văn Song (2011) đã tìm ra được môi trường thích hợp cho

nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS cơ bản, bổ sung saccharose 20g/l,agar 8g/l, nước dừa 15% và BAP 2,0mg/l Môi trường nhân nhanh protocorm tốtnhất là MS cơ bản, bổ sung saccharose 20g/l, agar 8,0g/l, nước dừa 15% và BAP2,0mg/l Môi trường MS cơ bản, bổ sung saccharose 30g/l, agar 8,0g/l, than hoạttính 1,0g/l, nước dừa 15%, BAP 2,0mg/l và NAA 1,0mg/l thích hợp nhất cho tái

sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro Môi trường MS cơ bản, bổ

sung saccharose 20g/l, agar 8,0g/l, nước dừa 15% và NAA 1,0mg/l là thích hợp cho

tạo rễ của chồi in vitro [11].

Nghiên cứu môi trường nhân giống in vitro giống lan Dendrobium

fimbriatum (Lan Hoàng Thảo Long nhãn), Nguyễn Thị Sơn (2011) đã khẳng định

môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là môi trường

MS, bổ sung nước dừa 100ml/l, saccharose 10g/l, agar 6,0g/l; môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là môi trường Knud, bổ sung nước dừa 100ml/l,

saccharose 10g/l, khoai tây 60g/l, agar 6,0g/l; môi trường MS, bổ sung nước dừa 100ml/l, saccharose 20g/l, chuối chín 60g/l, agar 6,0g/l là thích hợp nhất cho nhân

nhanh chồi in vitro; môi trường tạo cây hoàn chỉnh là môi trường RE (Robert

Ernst), bổ sung saccharose 10g/l, than hoạt tính 1,0g/l, agar 6,0g/l [12]

Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan Hài P hangianum perner Gurss (Hài Hằng) Kết quả nghiên cứu

cho thấy, môi trường nhân nhanh protocorm và tạo chồi là môi trường RE có bổsung nước dừa 150ml/l và chuối chín 100g/l cho hệ số nhân cao nhất (4,3 lần) Bổsung α-NAA 0,4mg/l - 0,6mg/l vào môi trường cho khả năng ra rễ tốt nhất Các kếtquả thí nghiệm ngoài vườn ươm cho thấy, cây đạt tiêu chuẩn ra vườn ươm cao 3 -4cm, có từ 3 - 4 lá, 4 - 5 rễ [3]

Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in vitro lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii), kết quả cho thấy, môi trường KC là phù hợp nhất để nhân nhanh chồi lan Kim tuyến in vitro Thể chồi 8 tuần tuổi từ

phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ 2-3cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trongmôi trường thích hợp KC, bổ sung BAP 0,5mg/l + kinetin 0,3mg/l + NAA 0,3mg/l+ nước dừa 100ml/l + dịch chiết khoai tây 100g/l + saccharose 20g/l + agar 7,0g/l+ than hoạt tính 0,5g/l [9]

1.3 Hiện trạng canh tác hoa lan ở Việt Nam

Thị trường phong lan ngày nay đã trở thành một mặt hàng lớn trên quốc

tế Ở các nước phát triển như: Anh, Mỹ, Đức, Ý, Singgapore, Hồng K ông,… đều

nhập khẩu rất nhiều phong lan, Thái Lan là nước xuất khẩu phong lan nhiều nhấtĐông Nam Á Việt Nam chúng ta cũng có nhiều triển vọng kinh doanh xuất khẩuphong lan [22]

Lan Việt Nam đẹp vẻ đẹp thanh cao lại chứa đựng thật nhiều ý nghĩa Cùngvới sự phát triển của ngành trồng lan trong thời gian qua, loài hoa cao quý nàykhông chỉ làm đẹp hơn hình ảnh Việt Nam trong con mắt của du khách đến với đấtnước xứ sở nhiệt đới này mà con mang lại hiệu quả kinh tế cao

Trước những năm 1986, nghề trồng hoa của Việt Nam chỉ tập trung ở mộtvài làng nghề ở Hà Nội, Hải Phòng, TP HCM, Đà Lạt và một vài tỉnh miền TâyNam bộ Diện tích trồng hoa của Việt Nam theo số liệu thống kê năm 1993 chỉchiếm 0,02% tổng diện tích đất nông nghiệp Trong thập niên 80, ngành trồng hoa ởViệt Nam chỉ là ngành kinh doanh nhỏ của các nhà vườn nhỏ cung cấp cho thịtrường nội địa là chính Diện tích trồng hoa của Việt Nam theo thống kê năm 1993như sau: Hà Nội 500 ha, Hải Phòng 320 ha, TP HCM 200 ha, Đà Lạt 75 ha, cáctỉnh khác 490 ha Tổng cộng diện tích trồng hoa của Việt Nam là 1.585 ha Hà Nội

có các vùng trồng hoa là: Ngọc Hà, Quang Ân, Nhật Tân, Tây Tựu và làng VĩnhTuy Hải Phòng có vùng Đặng Hải, An Hải TP HCM có quận Gò Vấp, Quận 12,

Củ Chi, Bình Chánh tập trung ở quận 11 và 12 và Đà Lạt nổi tiếng như là một thànhphố hoa Trồng hoa cho thu nhập gấp 10 – 12 lần hơn gạo nên mức sống của ngườidân ở những nơi trồng hoa thường cao hơn mức sống của vùng nông nghiệp khác[23]

Tuy nhiên, trong số các loại hoa được trồng nhiều ở Việt Nam như hoahồng, cúc, lay-ơn hoa lan chỉ chiếm xấp xỉ 10% Hầu hết hoa được trồng trênnhững mảnh vườn mở không có lưới và các phương tiện phòng chống mưa, bão, lụtrất thô sơ nên chất lượng và thời vụ thu hoạch bị ảnh hưởng rất nhiều Hoa lan tuycũng được trồng trong vườn có lưới che mát nhưng cũng không có các phương tiệnbảo vệ tránh gió mưa, bão gây hại cho hoa

Đà Lạt hiện nay đang trở thành điểm thu hút các nhà đầu tư kinh doanh hoa do sựthành công của các công ty nước ngoài đầu tư vào cách đây hơn 10 năm như DalatHasfarm chuyên trồng hoa ôn đới; công ty Lâm Thăng Đài Loan chuyên về lan

Phalaenopsis Vùng Sapa, Tam Đảo rất thích hợp cho việc trồng hoa ôn đới như hồng,

Lyly, lay ơn Riêng hoa lan nhiệt đới, qua các năm từ 2003- 2005 đã tăng từ 20 ha lên 50

ha (tăng 150%) Xu hướng tiêu dùng hoa lan đã tăng lên đáng kể và dự đoán sẽ tăng mạnhtrong thập niên tới do Việt Nam đã là thành viên của tổ chức thương mại thế giới WTO sẽ

là yếu tố tăng mạnh đầu tư nước ngoài làm tăng các dịch vụ du lịch, tổ chức hội nghị quốc

tế [23]

Các thí nghiệm được tiến hành trên nền môi trường PM (phytamax).

Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của môi trường PM

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Mẫu giống

Tạo protocorm Tạo đa chồi

Tạo rễTạo đa chồi

Cây hoàn chỉnh

Các bước pha môi trường nuôi cấy

Sau khi xác định công thức môi trường cần pha, tính thể tích hóa chất cần sửdụng trong môi trường cần nuôi cấy Ví dụ pha 1 lít môi trường nhân phong lan cócông thức: PM + đường D-glucose 30g + thạch agar 8,5g + than hoạt tính 1g + nướcdừa 100ml + khoai tây 40g + chuối 40g pha trong 1 lít môi trường

Đong khoảng 0,75 lít nước cất đun sôi trên bếp điện Dùng ống đong lấydung dịch PM đã pha vào cốc thủy tinh Cân đường D-glucose 30g, agar 8,5g, thanhoạt tính 1g, khoai tây 40g, chuối chín 40g Cho khoai tây, chuối chín vào máy xay,xay nhuyễn

Khi nước sôi khoảng 50 – 700C thì đổ agar khuấy đến khi nước trong rồi chođường, than, khoai tây, chuối chín vào rồi khuấy đều cho tan hết Bổ sung dungdịch hóa chất vào cốc thủy tinh Định lượng hỗn hợp dung dịch trên bằng nước cấtcho đủ 1 lít Chuẩn độ pH của hỗn hợp dung dịch khoảng 5,5 – 5,8.

Chia đều hỗn hợp nuôi cấy vào các bình tam giác đã chuẩn bị sau khi đã sấykhô Đậy bình bằng nút bông đã hấp trùng và bên ngoài có đậy bằng nắp giấy, đậykín Sau đó đem đi hấp khử trùng ở nhiệt độ 1200C, áp suất 1,2 atm trong thời gian

20 phút Sau khi hấp xong để 2 – 3 ngày cho môi trường ổn định rồi tiến hành cấy

Trước khi tiến hành nuôi cấy, cần khử trùng box cấy bằng tia UV trong khoảng

60 phút, khử trùng bộ đồ cấy bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó để nguội

2.3.2 Thăm dò môi trường nuôi cấy

Để tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho nhân chồi và ra rễ ở Lan Phi Điệp

(Dendrobium anosmum), chúng tôi đã bố trí thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi

cấy Tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều sử dụng nền môi trường PM +đường D-glucose 30g + thạch agar 8,5g + than hoạt tính 1g + nước dừa 100ml +khoai tây 40g + chuối 40g và bổ sung các chất kích thích sinh trưởng (α – NAA ,BAP, kinetin)

(1) Môi trường nhân chồi

Các chồi giống được cấy lên môi trường nhân chồi bổ sung BAP với cácnồng độ 0,5mg/l – 0,7mg/l – 0,9mg/l – 1,0mg/l hoặc kinetin với các nồng độ0,5mg/l – 0,7mg/l – 0,9mg/l – 1,0 mg/l – 1,2mg/l; so sánh với môi trường đối chứng(ĐC) không có BAP hoặc kinetin Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30

mô, lặp lại 3 lần Kết quả được đánh giá sau 4 – 6 – 8 tuần nuôi cấy

(2) Môi trường ra rễ

Môi trường PM bổ sung α NAA với các nồng độ 0,1mg/l – 0,3mg/l 0,5mg/l; so sánh với môi trường ĐC không có α - NAA Mỗi công thức thí nghiệmđược tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3 lần Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của câythông qua sự phát sinh rễ, kích thước rễ, sau 4 – 6 – 8 tuần nuôi cấy

-2.3.3 Phương pháp ra cây