Nghiên cứu môi trường nhân giống lan Phi Điệp bằng kĩ thuật nuôi vấy mô tế bào

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM  PHẠM THỊ THẢO NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG LAN PHI ĐIỆP (Dendrobium anosmum) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO Thái Nguyên, năm 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM  PHẠM THỊ THẢO NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG LAN PHI ĐIỆP (Dendrobium anosmum) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH: SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm Thái Nguyên, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện khóa luận, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm là giáo viên hướng dẫn, cô đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cô Trần Thị Hồng – kĩ thuật viên phòng Công nghệ tế bào – Vi sinh và toàn thể các thầy cô trong khoa Sinh – KTNN đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian làm đề tài. Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, đã luôn ở bên cạnh động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài. Trong qua trình thực hiện khóa luận, khó tránh khỏi những sai sót. Vì vậy, tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp từ thầy cô và bạn bè. Xin cảm ơn thầy cô và các bạn! Thái Nguyên, tháng 4 năm 2014 Sinh viên Phạm Thị Thảo MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ i LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU 1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Một vài nét giới thiệu về chi Dendrobium và lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 3 1.1.1. Giới thiệu về chi Dendrobium 3 1.1.2. Lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 4 1.2. Kĩ thuật nuôi cấy mô – tế bào trong công nghệ tế bào thực vật 5 1.2.1. Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy mô - tế bào 5 1.2.2. Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính 6 1.2.3. Quy trình nhân giống in vitro 7 1.2.4. Một số thành tựu của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào trong lĩnh vực nhân giống cây trồng 9 1.3. Hiện trạng canh tác hoa lan ở Việt Nam 11 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU 13 2.1. Vật liệu thực vật 13 2.2. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 13 2.3. Phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1. Phương pháp pha môi trường nuôi cấy 14 2.3.2. Thăm dò môi trường nuôi cấy 15 2.4. Tính toán kết quả 16 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1. Ảnh hưởng của BAP tới sự sinh trưởng và phát triển của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 18 3.2. Ảnh hưởng của kinetin lên sự phát sinh chồi của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 21 3.3. Ảnh hưởng của α- NAA đến sự phát sinh rễ của lan Phi Điệp 26 (Dendrobium anosmum) 26 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường PM 13 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BAP tới tỷ lệ tạo chồi và tạo protocorm ở lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 19 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP tới sự phát triển chồi của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 20 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin tới tỷ lệ tạo chồi và tạo protocorm của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 23 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát triển chồi của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 24 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ α- NAA đến sự ra rễ ở lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 27 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và α-NAA tới sự ra rễ của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 29 CT 29 Số rễ/ chồi 30 Chiều dài rễ 30 (cm) 30 Màu sắc lá 30 Sau 4 tuần 30 1,88±0,15 30 1,33±0,09 30 2,65±0,12 30 1,95±0,05 30 2,36±0,04 30 1,84±0,17 30 2,27±0,08 30 1,71±0,03 30 Sau 6 tuần 30 1,95±0,06 30 1,46±0,11 30 2,88±0,07 30 2,45±0,04 30 2,52±0,06 30 1,96±0,08 30 2,48±0,15 30 1,87±0,09 30 Sau 8 tuần 30 2,11±0,03 30 1,58±0,07 30 3,15±0,04 30 2,76±0,05 30 2,73±0,09 30 2,21±0,02 30 2,67±0,08 30 1,96±0,05 30 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của kinetin và α-NAA tới sự ra rễ của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 32 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình ảnh hoa lan Dendrobium anosmum 5 Hình 3.1. Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) sau 8 tuần nuôi cấy 21 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) sau 8 tuần 25 Hình 3.3. Ảnh hưởng của BAP 0,7 mg/l và kinetin 1mg/l lên sự sinh trưởng và phát triển của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 25 Hình 3.4. Ảnh hưởng của α – NAA tới sự ra rễ của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) sau 8 tuần nuôi cấy 28 Đưa cây ra ngoài vườn ươm là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi với thay đổi của nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn. Đây là giai đoạn quyết định khả năng ứng dụng quy trình nhân giống in vitro. Các loại giá thể gồm: than hoa, dớn, xơ dừa. Theo dõi sự phát triển của cây lan trong giai đoạn đầu ngoài môi trường nuôi cấy, tôi tiến hành trồng 30 cây con trên các giá thể than hoa, dớn, xơ dừa, than củi + xơ dừa, than củi + dớn và xơ dừa + dớn. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.10 34 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ĐC Đối chứng CT Công thức KTST Chất kích thích sinh trưởng PM Môi trường Phytamax MS Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) BAP 6 – benzyl amino purin α – NAA α – Naphthalene acetic acid MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hoa lan là một trong những loài hoa đẹp nhất, tinh khiết, vương giả cao sang, cùng với vẻ đẹp rực rỡ về màu sắc, quyến rũ về hình dáng, hoa lan còn có công dụng làm thuốc chữa bệnh mà từ ngàn xưa các danh y đã dùng để cứu người. Hoa lan đã trở thành một mặt hàng có giá trị trong kinh doanh, xuất khẩu trên thế giới. Các nước có ngành nuôi trồng hoa lan phát triển, hàng năm kim ngạch xuất khẩu lên đến hàng trăm triệu USD. Vì vậy, việc ứng dụng các kĩ thuật sinh học trong việc nhân nhanh các giống hoa lan ngày càng phát triển [19]. Hiện nay, trên thế giới ngành công nghệ sinh học phát triển rất mạnh mẽ, việc ứng dụng các công nghệ cao như: hệ thống fermenter, bioreactor, quang tự dưỡng…, với mục đích nhân nhanh các giống cây trồng. Việc ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã thu được những thành công rực rỡ trong việc nhân giống cây trồng. Ở nước ta trong những năm gần đây công nghệ này đã được thực hiện ở một số phòng thí nghiệm của một số trường Đại học, Viện nghiên cứu hoặc Trung tâm Công nghệ Sinh học. Những kết quả bước đầu trong nghiên cứu và ứng dụng rất khả quan trên một số đối tượng như: khoai tây, chuối, mía, hoa lan, các cây thuốc… [1], [6]. Dendrobium anosmum là một giống lan thường mọc ở các quốc gia thuộc vùng Đông Nam Á, nhưng nay phổ biến trên khắp thế giới bởi vì khá dễ trồng, nhiều hoa và hương thơm ngào ngạt [19]. Ngoài giá trị làm cảnh, cây còn được dùng trong y học với tên gọi Thạch hộc. Thạch hộc có vị ngọt nhạt, hơi mặn, không độc, tính lạnh, có tác dụng tư âm bổ thận, trừ phiền chỉ khát, ích vị sinh tân, bổ dưỡng thanh nhiệt, chỉ khát, sinh tân dịch chữa lao lực, gầy yếu, ho, sốt nóng, miệng khô khát, mồ hôi trộm, thiểu năng sinh dục ở nam giới, chân tay và lưng đau nhức, nóng trong, đau dạ dày, viêm ruột [24]. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, là môi trường thuận lợi cho việc nuôi trồng và phát triển hoa lan. Việt Nam có tới trên 1100 loài lan, trong đó có nhiều loài lan rừng quý hiếm được thế giới biết đến. Tuy nhiên, loài lan rừng đang trong tình trạng báo động vì tình trạng khai thác bừa bãi của con người [10]. 1 Hiện nay, ngày càng có nhiều cở sở kinh doanh hoa lan mọc lên, với nhiều chủng loại, nhưng để có số lượng lớn cây giống, đồng đều và sạch bệnh là một vấn đề khó. Do đó, để góp phần vào việc nhân giống bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền, sạch bệnh và đáp ứng giá cả, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu môi trường nhân giống lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô – tế bào”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Tìm được môi trường thích hợp cho việc nhân giống lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) trong ống nghiệm. Xác định được giá thể thích hợp để đưa cây lan Phi Điệp Dendrobium anosmum từ trong ống nghiệm ra môi trường tự nhiên. 3. Nội dung nghiên cứu - Thăm dò ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến sự phát sinh chồi của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) trong ống nghiệm. - Thăm dò ảnh hưởng của kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin đến sự ra rễ của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) trong ống nghiệm. - Thăm dò ảnh hưởng của tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và nhóm cytokinin lên sự sinh trưởng của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) trong ống nghiệm. - Nghiên cứu tìm ra loại giá thể thích hợp nhất cho ra cây lan Phi Điệp (xơ dừa, rong biển, than củi …). 2 [...]... hành nuôi cấy, cần khử trùng box cấy bằng tia UV trong khoảng 60 phút, khử trùng bộ đồ cấy bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó để nguội 2.3.2 Thăm dò môi trường nuôi cấy Để tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho nhân chồi và ra rễ ở Lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum), chúng tôi đã bố trí thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy Tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều sử dụng nền môi trường. .. hoa lan Dendrobium anosmum Giống lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) được trồng nhiều nhất vì nó tương đối dễ trồng, khả năng chịu nóng, lạnh tương đối tốt Loài lan này cần nhiều ánh sáng, nuôi trồng trong điều kiện nhiệt độ là 8 – 250C, độ ẩm khoảng 60 – 70% [22] 1.2 Kĩ thuật nuôi cấy mô – tế bào trong công nghệ tế bào thực vật 1.2.1 Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy mô - tế. .. con vô tính được nhân giống để cung cấp cho các nước Châu Mỹ latinh [16] Nuôi cấy mô - tế bào thực vật đã được tiến hành trên 20 năm ở nước ta Hiện nay trên cả nước có trên 50 phòng nuôi cây mô – tế bào nằm ở các trường Đại học, Viện nghiên cứu, trung tâm Công nghệ Sinh học Quy trình công nghệ nhân giống đã được nhiều viện nghiên cứu và các trường đại học nghiên cứu hoàn thiện ở nhiều giống cây trồng... 6,0g/l [12] Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan Hài P hangianum perner Gurss (Hài Hằng) Kết quả nghiên cứu cho thấy, môi trường nhân nhanh protocorm và tạo chồi là môi trường RE có bổ sung nước dừa 150ml/l và chuối chín 100g/l cho hệ số nhân cao nhất (4,3 lần) Bổ sung α-NAA 0,4mg/l - 0,6mg/l vào môi trường cho khả năng ra rễ tốt nhất Các kết quả... ra môi trường tự nhiên Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm 2.3.1 Phương pháp pha môi trường nuôi cấy Nguyên tắc Pha môi trường đặc với thành phần, nồng độ và các chất phù hợp Môi trường cơ bản là PM, có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin, tất cả các hóa chất tan đều, không kết tủa Môi trường có bổ sung chất độn là thạch làm giá đỡ không quá rắn hay quá mềm để khi cấy mẫu được dễ dàng Khử trùng môi trường. .. 1,2 atm trong thời gian 20 phút Các bước pha môi trường nuôi cấy Sau khi xác định công thức môi trường cần pha, tính thể tích hóa chất cần sử dụng trong môi trường cần nuôi cấy Ví dụ pha 1 lít môi trường nhân phong lan có công thức: PM + đường D-glucose 30g + thạch agar 8,5g + than hoạt tính 1g + nước dừa 100ml + khoai tây 40g + chuối 40g pha trong 1 lít môi trường Đong khoảng 0,75 lít nước cất đun sôi... sinh trưởng của chồi in vitro Môi trường MS cơ bản, bổ sung saccharose 20g/l, agar 8,0g/l, nước dừa 15% và NAA 1,0mg/l là thích hợp cho tạo rễ của chồi in vitro [11] Nghiên cứu môi trường nhân giống in vitro giống lan Dendrobium fimbriatum (Lan Hoàng Thảo Long nhãn), Nguyễn Thị Sơn (2011) đã khẳng định môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là môi trường 10 MS, bổ sung nước dừa... nucleic và chlorophyl [1] Để xác định môi trường nhân giống tối ưu cho lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) trong ống nghiệm, chúng tôi sử dụng môi trường: PM + đường D-glucose 30g + thạch agar 8,5g + khoai tây 40g + chuối 40g + than hoạt tính 1g + nước dừa 100ml và bổ sung BAP (nồng độ từ 0,5mg/l đến 1mg/l ) pha trong 1 lít môi trường Chúng tôi nhận thấy môi trường nuôi cấy có bổ sung chất kích thích sinh... nước dừa 100ml/l, saccharose 10g/l, agar 6,0g/l; môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là môi trường Knud, bổ sung nước dừa 100ml/l, saccharose 10g/l, khoai tây 60g/l, agar 6,0g/l; môi trường MS, bổ sung nước dừa 100ml/l, saccharose 20g/l, chuối chín 60g/l, agar 6,0g/l là thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi in vitro; môi trường tạo cây hoàn chỉnh là môi trường RE (Robert Ernst), bổ sung saccharose 10g/l,... ăn gia súc, nông nghiệp và bảo vệ môi trường Vì vậy, nuôi cấy mô – tế bào đã mang lại hiệu quả hết sức to lớn nhờ có các ưu thế, đó là: (1) Hệ số nhân giống cao rút ngắn thời gian đưa con giống vào sản xuất Trong phần lớn các trường hợp công nghệ nuôi cấy mô tế bào đảm bảo tốc độ nhân nhanh, từ một cây trong vòng 1 – 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây [8]; (2) Nhân được một số lượng cây lớn trong . của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 18 3.2. Ảnh hưởng của kinetin lên sự phát sinh chồi của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 21 3.3. Ảnh hưởng của α- NAA đến sự phát sinh rễ của lan Phi Điệp. và phát tán nhờ gió [5]. 1.1.2. Lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) Lan Phi Điệp có tên khoa học là Dendrobium anosmum, thuộc họ Hoàng thảo (Dendrobium). Lan Phi Điệp còn có tên gọi khác như: Giả. của lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum) 32 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình ảnh hoa lan Dendrobium anosmum 5 Hình 3.1. Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan Phi Điệp