nghiên cứu môi trường nhân giống lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM  BÙI THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGÀNH: SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Tâm Thái Nguyên, năm 2013 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực đề tài, em nhận sự giúp đỡ, bảo, đóng góp ý kiến quý báu thầy cô, gia đình bạn bè Em xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học sư phạm – Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN tạo điều kiện giúp đỡ em trình học tập nghiên cứu đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Thị Tâm, người tận tình hướng dẫn, bảo để em hoàn thành đề tài Đồng thời, em xin cảm ơn KTV Trần Thị Hồng phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ em tiến hành thí nghiệm đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè quan tâm, ủng hộ tạo động lực cho em để em hoàn thành đề tài Trong trình làm đề tài không tránh khỏi sai sót, em mong nhận ý kiến đóng góp chân thành từ phía thầy cô bạn Xin chúc thầy cô bạn khỏe mạnh thành công! Thái Nguyên, ngày 15 tháng 03 năm 2013 Người thực Bùi Thị Huyền MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục bảng iv Danh mục hình v Danh mục chữ viết tắt .vi MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một vài nét giới thiệu họ phong lan lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 1.1.1 Một vài nét giới thiệu họ phong lan 1.1.2 Một vài nét giới thiệu lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 1.2 Kĩ thuật nuôi cấy in vitro công nghệ tế bào thực vật 1.2.1 Cơ sơ khoa học kĩ thuật in vitro 1.2.2 Các hướng nghiên cứu ứng dụng ưu kĩ thuật nhân giống in vitro 1.2.3 Các phương thức nhân giống in vitro 1.2.4 Quy trình nhân giống in vitro 10 1.2.5 Một số thành tựu nhân giống in vitro 11 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu thực vật 16 2.2 Hóa chất, thiết bị 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phương pháp pha môi trường nuôi cấy 18 2.3.2.Thăm dò môi trường nuôi cấy 19 2.4 Tính toán kết 20 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Ảnh hưởng BAP lên phát sinh chồi tạo protocorm lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) .21 3.2 Ảnh hưởng kinetin lên phát sinh chồi tạo protocorm lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) .26 3.3 Thăm dò ảnh hưởng α- NAA đến phát sinh rễ lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO .36 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần môi trường Phytamax 18 Bảng 3.1 Ảnh hưởng BAP tới tỷ lệ mô sống, tỷ lệ mô tạo chồi tỷ lệ mô tạo protocorm lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 22 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP tới bật chồi lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 24 Bảng 3.3 Ảnh hưởng kinetin tới tỷ lệ mô sống, tỷ lệ tạo chồi tạo protocorm lan Kim Tuyến ( Anoectochilus setaceus) 27 Bảng 3.4 Ảnh hưởng kinetin tới bật chồi lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 28 Bảng 3.5 Ảnh hưởng α- NAA đến rễ lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 32 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh cụm hoa lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm nhân giống lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 18 Hình 3.1 Biểu đồ ảnh hưởng nồng độ BAP tới phát sinh chồi tạo protocorm lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) sau tuần nuôi cấy 25 Hình 3.2 Ảnh hưởng BAP tới phát sinh chồi tạo protocorm lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) sau tuần nuôi cấy 26 Hình 3.3 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng nồng độ kinetin tới phát sinh chồi tạo protocorm lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) sau tuần nuôi cấy 29 Hình 3.4 Ảnh hưởng kinetin tới phát sinh chồi tạo protocorm lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) sau tuần nuôi cấy 30 Hình 3.5 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng nồng độ α – NAA tới rễ lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 34 Hình 3.6 Ảnh hưởng α – NAA tới rễ lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) sau tuần nuôi cấy 34 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT - CT: Công thức - ĐC: Đối chứng - KTST: Kích thích sinh trưởng - PM: Môi trường PM (phytamax) - BAP: – benzyl amino purin - α – NAA: Axit α- Naphtyl axetic MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngày với phát triển nhanh chóng đời sống xã hội, nhu cầu hoa tươi giới nói chung Việt Nam nói riêng tăng nhanh hết Trong hoa lan trở thành loại sản phẩm có giá trị kinh tế cao, chiếm vị trí dặc biệt thị trường hoa tươi loại xuất lưu thông ngành thương mại Bởi từ ngàn năm nay, loài thảo mộc nhiều người ưa chuộng Họ bị quyến rũ màu sắc hài hòa, trang nhã hoa mùi hương tinh dầu trích từ chúng [7] Ngoài mặt thẩm mĩ, khoa học, chúng có giá trị kinh tế Gía loài lan quý dao động từ 400-10.000 USD/cây [11] Chính mà hoa lan mệnh danh nữ chúa loài hoa mục tiêu săn tìm nhiều người, đặc biệt người yêu thích hoa Cây lan Kim Tuyến có tên khoa học Anoectochilus setaceus, thuộc loài địa lan họ lan (Orchidaceae) Cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) dùng làm cảnh mà loài thảo dược có giá trị tiềm lớn Cây dùng làm thuốc chữa bệnh, tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa ung thư [31] Những loài lan quý Việt Nam chuyên gia nghiên cứu phong lan đánh giá cao [23] Song trình nuôi trồng lan nước ta lại mang tính chất cá nhân lẻ tẻ Nguồn giống chủ yếu từ khai thác lan rừng nguy cạn kiệt nguồn lan rừng báo động tình trạng khai thác lan bừa bãi Vì để đáp ứng nhu cầu thị trường để thương mại hóa ngành sản xuất lan cần phải có kĩ thuật cao mà trước hết phải có công nghệ nhân giống thật đại Đó công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Công nghệ trải qua trăm năm hình thành phát triển, đem lại giá trị to lớn cho loài người [8] Ở Việt Nam kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu nghiên cứu ứng dụng từ năm 80 kỉ XX Những kết bước đầu nghiên cứu ứng dụng đạt kết khả quan số đối tượng trồng như: chuối, khoai tây, phong lan, lúa… [4],[8] Với giá trị lớn y học, lan Kim Tuyến bị thu hái nhiều tới mức cạn kiệt tự nhiên Hiện lan Kim Tuyến cấp báo thuộc nhóm IA nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác mục đích thương mại [27] nhóm thực vật rừng nguy cấp EN A1a,c,d sách đỏ Việt Nam [3] Từ thực tế đồng thời góp phần bảo tồn loại lan rừng quý hiếm, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu môi trường nhân giống lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào” Mục tiêu nghiên cứu Tìm môi trường thích hợp cho việc nhân giống lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) ống nghiệm Nội dung nghiên cứu 1) Thăm dò ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng (KTST) thuộc nhóm xytokinin (BAP kinetin) lên phát sinh chồi lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) ống nghiệm 2) Thăm dò ảnh hưởng KTST nhóm auxin (NAA) đến việc rễ chồi lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) ống nghiệm Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một vài nét giới thiệu họ phong lan lan Kim Tuyến 1.1.1 Một vài nét giới thiệu họ phong lan Họ Lan, hay họ Phong lan (Orchidaceae) họ thực vật có hoa, thuộc Măng tây (Asparagales), lớp thực vật mầm Họ Phong lan họ lớn thực vật [27] có thành viên toàn giới, ngoại trừ châu Nam Cực Có loài lan sống mặt đất nở hoa mặt đất có loài lan sống vùng cao nguyên dãy núi Himalaya Hoa lan tìm thấy vùng có khí hậu nhiệt đới rừng già Brasil đến vùng có tuyết phủ mùa đông bình nguyên Manitoba, Canada Các loài lan chủ yếu mọc cao, sống biểu sinh lâu năm Chúng gọi chung phong lan Bên cạnh có loài mọc đất gọi địa lan số mọc đá gọi thạch lan [9] Số lượng loài lan cao gấp lần số lượng loài động vật có vú hay lần số lượng loài chim Nó chiếm khoảng – 11 % số lượng loài thực vật có hoa [28] Hoa lan nhiều người tiêu dùng ưa chuộng vẻ đẹp đặc sắc hình thức đa dạng chúng Hoa lan có màu sắc phong phú Hoa nhỏ hạt gạo hoa lớn có đường kính khoảng 1m Đa số loại lan bán rộng rãi thị trường thường mùi thơm, tự nhiên có nhiều loại hoa lan có mùi thơm đặc trưng Vanilla loại hoa lan mà hương thơm dùng loại ẩm thực giới có nguồn gốc từ Mexico, có loài hoa lan tỏa mùi khó chịu thịt bị hỏng để hấp dẫn loài côn trùng [28] 1.1.2 Một vài nét giới thiệu lan Kim Tuyến 1.1.2.1 Phân loại phân bố lan Kim Tuyến Phân loại Lan kim tuyến có tên khoa học là: Anoectochilus setaceus, có tên khác là: Chrysobaphus roxburghi Wall., Anoectochilus roxburghii (Wall.) Wall Ex Lindl [26], hay Anoectochilus roxburglihayata [30] 10 (cm) Sau tuần ĐC 0,0 1,10±0,13 1,21±0,13 Xanh BT CT1 0,5 1,86±0,11 1,67±0,10 Xanh BT CT2 0,7 1,84±0,12 1,22±0,13 Xanh BT CT3 0,9 1,80±0,11 1,27±0,13 Xanh BT CT4 1,0 1,64±0,09 Sau tuần 1,35±0,12 Xanh nhạt ĐC 0,0 1,30±0,12 2,03±0,08 Xanh BT CT1 0,5 1,91±0,15 2,91±0,09 Xanh BT CT2 0,7 1,90±0,15 2,75±0,11 Xanh BT CT3 0,9 1,89±0,111 2,68±0,09 Xanh nhạt CT4 1,0 1,72±0,13 Sau tuần 2,38±0,09 Xanh nhạt ĐC 0,0 1,80±0,11 4,18±0,15 Xanh BT CT1 0,5 2,92±0,11 4,91±0,08 Xanh BT CT2 0,7 2,63±0,11 4,38±0,11 Xanh BT CT3 0,9 2,24±0,09 4,33±0,08 Xanh nhạt CT4 1,0 1,97±0,09 4,31±0,08 Xanh nhạt Xanh BT: Xanh bình thường Từ bảng 3.2 cho thấy môi trường có bổ sung BAP 0,5 mg/l tạo số chồi/mô chiều cao chồi lớn (sau tuần trung bình 2,92 chồi/mô chiều cao trung bình 4,91cm) Bổ sung BAP nồng độ cao hơn, hai số giảm dần Kết luận: môi trường thích hợp cho phát sinh chồi tạo protocorm lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) môi trường có bổ sung BAP 0,5 mg/l Đối với lan Hồ Điệp, nồng độ 1,0 mg/l [28] Như loài lan khác thích hợp với nồng độ BAP định 29 Hình 3.1 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng nồng độ BAP tới phát sinh chồi tạo protocorm Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) ống nghiệm sau tuần A B 30 Hình 3.2 Ảnh hưởng BAP tới tạo chồi tạo protocorm Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) ống nghiệm sau tuân nuôi cấy A Mô lan sau tuần (đối chứng) B Mô lan sau tuần (BAP 0,5mg/l) 3.2 Ảnh hưởng Kinetin lên tạo chồi tạo protocorm Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus ) Kinetin dẫn xuất base hữu adenin thuộc nhóm xytokinin có cấu trúc phân tử (6 - fufuryl - aminopurin) Vai trò đặc trưng kinetin kích thích phân chia tế bào, làm chậm trình già hóa tế bào Ở mức thể, kinetin có ảnh hưởng thúc tạo chồi tạo protocorm đối tượng thực vật [4] Chúng tiến hành nghiên cứu môi trường có bổ sung chất KTST kinetin với công thức : PM + 30g đường glucose + 8,5g thạch agar + 1g than hoạt tính + 100ml nước dừa + 40g khoai tây + 40g chuối bổ sung chất KTST kinetin (Nồng độ từ 0,5mg/l 1mg/l) Các thí nghiệm lặp lại - lần đánh giá sau – – tuần nuôi cấy Kết thu bảng 3.2 Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ kinetin tới tỷ lệ mô sống, tỷ lệ tạo chồi tạo protocorm lan Kim Tuyến ( Anoectochilus setaceus) CT kinetin (mg/l) Tỷ lệ mô sống (%) X ± mx Tỷ lệ mô tạo chồi (%) Tỷ lệ mô tạo protocorm (%) % so X ± mx với ĐC Sau tuần % so với ĐC X ± mx % so với ĐC ĐC 0,0 38,35±0,30 100,00 10,19±0,07 100,00 7,10±0,23 100,00 CT1 0,5 74,42±0,25 194,05 36,73±0,11 360,45 39,17±0,17 551,69 CT2 0,7 70,26±0,26 183,21 31,18±0,12 305,99 36,11±0,19 596,00 CT3 0,9 68,24±0,23 177,94 32,71±0,09 321,00 30,36±0,18 427,61 CT4 1,0 67,34±0,27 175,59 24,45±0,15 Sau tuần 239,94 29,55±0,21 416,20 ĐC 0,0 41,56±0,03 100,00 100,00 10,07±0,15 100,00 16,62±0,12 31 CT1 0,5 85,23±0,02 205,08 49,12±0,16 295,55 42,87±0,12 425,72 CT2 0,7 78,59±0,03 189,10 40,56±0,13 244,04 40,96±0,12 406,75 CT3 0,9 76,21±0,03 183,37 37,28±0,10 224,31 40,11±0,12 398,31 CT4 1,0 70,59±0,04 169,85 29,86±0,09 179,66 35,56±0,14 353,13 Sau tuần ĐC 0,0 60,37±0,02 100,00 17,43±0,24 100,00 21,45±0,10 100,00 CT1 0,5 92,47±0,01 153,17 55,15±0,23 316,41 51,23±0,04 238,83 CT2 0,7 83,95±0,03 139,06 42,01±0,17 241,02 46,92±0,06 218,74 CT3 0,9 83,61±0,03 138,50 39,35±0,21 225,76 45,44±0,06 211,84 CT4 1,0 82,34±0,14 136,39 33,23±0,21 190,69 39,67±0,07 184,94 Bảng 3.4 Ảnh hưởng kinetin tới phát triển chồi lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) CT kinetin (mg/l) Số chồi/ mô Chiều cao (cm) Màu sắc chồi Sau tuần ĐC 0,0 1,10±0,09 1,20±0,11 Xanh BT CT1 0,5 1,52±0,08 1,58±0,13 Xanh BT CT2 0,7 1,30±0,11 1,49±0,11 Xanh BT CT3 0,9 1,17±0,12 1,46±0,15 Xanh BT CT4 1,0 1,02±0,11 Sau tuần 1,31±0,11 Xanh nhạt ĐC 0,0 1,34±0,11 2,01±0,09 Xanh BT CT1 0,5 1,86±0,08 3,08±0,08 Xanh BT CT2 0,7 1,68±0,12 2,47±0,09 Xanh BT 32 CT3 0,9 1,56±0,12 2,35±0,09 Xanh nhạt CT4 1,0 1,36±0,13 Sau tuần 2,34±0,09 Xanh nhạt ĐC 0,0 2,01±0,14 3,12±0,11 Xanh BT CT1 0,5 2,87±0,08 4,35±0,09 Xanh BT CT2 0,7 2,57±0,09 4,07±0,08 Xanh BT CT3 0,9 2,31±0,09 3,83±0,13 Xanh nhạt CT4 1,0 2,03±0,14 Xanh BT: Xanh bình thường 3,64±0,11 Xanh nhạt Kết cho thấy, nồng độ kinetin 0,5 mg/l khả tạo chồi protocorm chiếm tỷ lệ cao lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) với tỷ lệ tạo chồi là: 36,73%; 49,12%; 55,15% tỷ lệ tạo protocorm đạt: 39,17%; 42,87%; 51,23% tương ứng với thời gian nuôi cấy tuần, tuần tuần So sánh với môi trường ĐC kinetin, tỷ lệ tạo chồi là: 10,19%; 16,62%; 17,43% tạo protocorm là: 7,10%; 10,07%; 21,45% sau tuần, tuần, tuần nuôi cấy Với số liệu ta thấy tỷ lệ tạo chồi protocorm môi trường ĐC có tăng lên theo thời gian tốc độ chậm Như vậy, tỷ lệ tạo protocorm môi trường có bổ sung kinetin 0,5 mg/l sau tuần nuôi cấy cao gấp 5,51 lần môi trường không bổ sung kinetin, tỷ lệ tạo chồi cao gấp 3,60 lần so với môi trường ĐC Sau tuần nuôi cấy tỷ lệ tạo chồi protocorm môi trường bổ sung kinetin 0,5 mg/l cao gấp 2,96 lần 4,25 lần so với môi trường ĐC Sau tuần nuôi cấy, tỷ lệ mô tạo chồi tăng lên môi trường bổ sung kinetin 0,5 mg/l cao gấp 3,16 lần tỷ lệ tạo protocorm tăng lên cao gấp 2,39 lần so với môi trường ĐC Bảng 3.4 cho thấy khả tạo chồi/mô môi trường bổ sung kinetin nồng độ 0,5 mg/l cao (sau tuần số chồi/mô trung bình 2,87) số chồi/mô môi trương ĐC không cao giảm dần qua tuần (1,10 chồi/mô; 1,34 chồi/mô 2,01 chồi/mô) So sánh khả phát sinh chồi protocorm lan Kim Tuyến ( Anoectochilus setaceus) sử dụng hai loại chất kích sinh trưởng BAP kinetin môi trường PM 33 thấy tỷ lệ phát sinh chồi hình thành protocorm lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) sử dụng BAP cao sử dụng kinetin Trong môi trường bổ sung BAP nồng độ 0,5 mg/l cho khả tạo chồi tốc độ sinh trưởng chồi tốt Vì vậy, nhân giống lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) nên sử dụng môi trường BAP cho phát sinh chồi tạo protocorm tiết kiệm chi phí, hạ giá thành sản phẩm mà tỉ lệ phát sinh chồi tạo protocorm lại cao Hình 3.3 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng nồng độ kinetin tới phát sinh chồi tạo protocorm Lan Kim Tuyến ( Anoectochilus setaceus) sau tuần nuôi cấy 34 A B Hình 3.4 Ảnh hưởng kinetin tới phát sinh chồi tạo protocorm Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) sau tuân nuôi cấy A Mô lan sau tuần (đối chứng) B Mô lan sau tuần (kinetin 0,5mg/l) 3.3 Ảnh hưởng α- NAA lên rễ Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus ) α- NAA hormone sinh trưởng thuộc nhóm auxin, sinh mô phân sinh vận chuyển xuống phận khác Vai trò α- NAA thúc đẩy sinh trưởng dãn nở tế bào thực vật, tăng cường trình tổng hợp trao đổi chất ADN, protein… Ngoài kích thích rễ, kéo dài rễ tham gia vào cảm ứng tạo chồi vô tính… [22] Để tìm môi trường tối ưu cho rễ lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus), sử dụng môi trường: PM + 30g đường glucose + 8,5g thạch agar + 35 1g than hoạt tính + 100ml nước dừa + 40g khoai tây + 40g chuối bổ sung chất KTST α- NAA nồng độ 0,1mg/l – 0,3mg/l – 0,5 mg/l Kết thu từ bảng 3.3 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ α- NAA đến rễ Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 36 Công thức thí nghiệm α-NAA Tỷ lệ rễ (%) (mg/l) ĐC CT1 CT2 CT3 0,0 0,1 0,3 0,5 51,24±0,05 87,13±0,04 76,34±0,05 83,13±0,04 ĐC CT1 CT2 CT3 0,0 0,1 0,3 0,5 67,23±0,05 91,46±0,02 79,12±0,05 84,49±0,03 ĐC CT1 CT2 CT3 0,0 0,1 0,3 0,5 75,58±0,06 94,67±0,02 81,56±0,03 90,88±0,02 Số rễ/cây Chiều dài rễ(cm) Sau tuần 1,32±0,11 1,23±0,14 2,64±0,07 2,35±0,09 2,35±0,09 2,14±0,10 2,47±0,11 2,09±0,11 Sau tuần 1,61±0,12 2,57±0,12 2,84±0,11 3,39±0,07 2,50±0,09 3,42±0,09 2,68±0,09 3,12±0,11 Sau tuần 1,74±0,11 3,34±0,09 2,98±0,14 4,68±0,07 2,74±0,12 4,17±0,12 2,72±0,12 3.87±0,11 Số lá/cây Màu sắc 2,67±0,11 Xanh BT 3,46±0,09 Xanh BT 3,45±0,09 Xanh BT 3,38±0,11 Xanh nhạt 3,11±0,10 4,35±0,09 4,21±0,11 4,15±0,10 Xanh BT Xanh BT Xanh nhạt Xanh nhạt 4,89±0,14 5,12±0,11 5,01±0,13 4,97±0,11 Xanh BT Xanh BT Xanh nhạt Xanh nhạt Xanh BT: Xanh bình thường Qua bảng 3.3 ta nhận thấy bổ sung α – NAA nồng độ khác nhau,khả tạo rễ cao môi trường ĐC môi trường có α – NAA 0,1mg/l cho tỷ lệ rế cao Sau tuần nuôi cấy, môi trường có α – NAA 0,1mg/l cho tỷ lệ rễ cao đạt 87,13%, môi trường đối chứng đạt 51,24% Sau tuần nuôi cấy, tỷ lệ rễ môi trường có bổ sung α –NAA 0,1mg/l đạt 94,67%, cao gấp 1,25 lần so với môi trường ĐC (75,58%) Màu sắc môi trường ĐC môi trường có α - NAA 0,1 mg/l màu xanh bình thường, với nồng độ cao nhạt dần Do kết luận môi trường có bổ sung α - NAA 0,1mg/l thích hợp cho tạo rễ lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 37 Hình 3.5 Biểu đồ ảnh hưởng nồng độ α- NAA đến rễ Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) sau tuần nuôi cấy A B Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ α-NAA tới hình thành rễ lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus ) sau tuần nuôi cấy 38 A Cây sau tuần (đối chứng) B Cây sau tuần (α-NAA 0,1mg/l ) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Môi trường PM + 30g/l đường glucose + 8,5g/l thạch agar + 1,0g/l than hoạt tính + 100ml/l nước dừa + 40g/l khoai tây + 40g/l chuối + 0,5mg/l BAP môi trường thích hợp cho phát sinh chồi tạo protocorm lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) Môi trường PM + 30g/l đường glucose + 8,5g/l thạch agar + 1,0g/l than hoạt tính + 100ml/l nước dừa + 40g/l khoai tây + 40g/l chuối + 0,1 mg/lNAA môi trường thích hợp cho phát sinh rễ lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) Đế nghị Do thời gian làm đề tài có hạn nên thăm dò môi trường nhân nhanh rễ lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) số nồng độ định Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật mục đích cuối đưa môi trường Vì thời gian tiếp tục nhgiên cứu môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin xytokinin quy trình đưa môi trường tự nhiên, biện pháp chăm sóc cây, theo dõi sinh trưởng phát triển đến giai đoạn hoa để hoàn thiện quy trình nhân giống lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thị Lí Anh, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Xuân Trường, Đỗ Năng Vịnh (2003), “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống nuôi trồng phong lan Phalaenopsis ambilis (Lan Hồ Điệp)”, Báo cáo khoa học toàn quốc, NXB Khoa học kĩ thuật tr.850-855 Nguyễn Thế Anh, Trần Văn Minh (2007), “Vi nhân giống Pomu ( Forkien hocdginsii ( Dunn) A Henry & H H Thomas)”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr.647-649 Nguyễn Tiến Bân (chủ biên), Danh lục loài thực vật Việt Nam, tập 3, Nxb Nông nghiệp Hà Nội, 2005 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội, (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiên giống trồng, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội 40 Hoàng Thị Giang (2010), “Nghiên cứu nhân giống in vitro nuôi trồng giống lan Hài P hangianum perner Gurss (Hài Hằng) thu thập Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Phát triển, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Tập 8, số 2, tr.194 - 201 Nguyễn Thái Hà, Dương Minh Nga, Hà Thị Thúy, Lê Thu Về, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2003) giống hoa Lilium spp”, Báo cáo khoa học toàn quốc, Nxb Khoa Học Kĩ thuật, tr.73 Trần Văn Huân, Văn Tích Lượm (biên dịch), Alberto Fanfani, WalterRossi (2004), Kĩ thuật nuôi trồng cấy lan, Nxb Mĩ Thuật, trang 8 Dương Công Kiên (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nxb Thành Phố HCM Đinh Đoàn Long, Lê Huy Hoàng, Đỗ Năng Vịnh, Hà Thị Thúy, Bernd Bueter (2004), “Nhân giống vô tính in vitro dòng Kava (Pipe methusticum G Forster) có hoạt tinhsinh học cao”, Những vấn đề nghiên cứu Khoa học sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr.536 - 550 10 Chu Văn Mẫn (2000), Ứng dụng tin học sinh học, Nxb Đại học Quốc gia- Hà Nội 11 Nguyễn Công Nghiệp (2000), Trồng hoa lan, Nxb Nông Nghiệp 12 Phùng Văn Phê, Nguyễn Trung Thành, Vương Duy Hưng, “Đặc điểm hình thái, phân bố loài lan Kim Tuyến Anoecto chillus Setaceus Blume vườn quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học tự nhiên công nghệ, số 26 (2010), 104-109 13 Phùng Văn Phê, Nguyễn Trung Thành, Vương Duy Hưng (2010), “Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in vitro lan Kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl”, Tạp chí khoa Đại học Quốc gia Hà Nội, số 26 (2010), tr.248-253 14 Lâm Ngọc Phương (2003), Nhân giống dưa hấu tam bội ( Citrullus Vulgarir schrad) invitro, Báo cáo khoa học toàn quốc, Nxb Khoa học Kĩ thuật, tr.79 15 Trần Duy Qúy (1999), Các phương pháp chọn giống trồng, Nxb Nông nghiệp 16 Hoàng Thị Sản (2003), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục 41 17 Nguyễn Văn Song (2011), “Nhân nhanh invitro lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum) - loài lan rừng có nguy tuyệt chủng”, Tạp chí khoa học Đại học Huế, số 64, tr.127-136 18 Nguyễn Thị Sơn (2011), “Nhân giống in vitro giống lan Dendrobium fimbriatum Hook (Lan Hoàng Thảo Long nhãn)”, Tạp chí Khoa học Phát triển, Trường Đại học Nông nghiệp, Tập 10, số 2, tr.263 - 271 19 Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Minh Quế (2009), Nghiên cứu trình bảo tồn nguồn gen dẻ Trùng Khánh – Cao Bằng kĩ thuật in vitro, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Nxb Đại học Thái Nguyên, tr.335- 339 20 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật- Nghiên cứu ứng dụng, Nxb Nông Nghiệp, tr 40-46 21 Hoàng Thị Kim Thoa, Nguyễn Trâm Anh 2003), Ảnh hưởng số chất điều hòa sinh trưởng lên trình nhân giống vô tính chè 1A tiếp cốt thảo, Báo cao khoa học toàn quốc, Nxb Khoa học kĩ thuật, tr.319- 321 22 Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển, “Vi nhân giống đu đủ”, Báo cáo khoa học 2002, Nxb Khoa học kĩ thuật, tr.875 23 Trịnh Cẩm Tú, Bùi Trang Việt (2006), “Sử dụng kĩ thuật nuôi cấy invitro để nghiên cứu phát triển phát hoa Dendrobium sonia”, Tạp chí phát triển khoa học công nghệ, Tập 9, số 9- 2006, tr.83- 87 24 Nguyễn Thị Kim Uyên, Trần Văn Minh (2007), “Dòng hó hao (Artemisia annua L.) in vitro”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Nxb Khoa học kĩ thuật Hà Nội, tr.872- 875 25 Đỗ Năng Vịnh (2002), Công nghệ sinh học trồng, Nxb Nông Nghiệp 26 Bộ khoa học công nghệ, Sách đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb Khoa học tự nhiên & Công nghệ Hà Nội, 2007 42 27 Chính Phủ Nước Cộng hòa xã hôi chủ nghĩa Việt Nam, Nghị định 32/2006/NĐCP,2006 28 vi.wikipedia.org/wiki/Ho_Phong_Lan 29 http://vtc.vn/394-360635/phong-su-kham-pha/giai-ma-bi-an-loai-co-tri-gia-100-trieudongkg-o-sapa.htm 30 http://y dược Nguyễn Hữu Hách-Đông y 31 caythuocviet.com.vn/cay-thuoc-vi-thuoc/lan-kim-tuyen.html 43 [...]... Nam, lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) phõn b : Lo Cai (Sapa), H Giang (Qun Ba), Yờn Bỏi, Vnh Phỳc (Tam o), H Tõy (M c, Chựa Hng), Qung Tr (ng Chố), Kontum (c Tụ, c Uy), Gia Lai (Kbang, Kon H Nng); Trờn th gii, lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) xut hin : Trung Quc (Võn Nam, Qung ụng), n , Lo, Indonexia [26] 1.1.2.2 c im sinh hc ca cõy lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) Lan Kim Tuyn (Anoectochilus. .. Vit Nam, lan Kim Tuyn c gi bng nhiu tờn khỏc nhau nh: Cõy Kim Cng, lan Gm, Kim Tuyn, Kim Tuyn Liờn, Mc Sn Thch Tựng, Thch Tm, Lỏ Gm [30] hay Kim Tuyn T, Gii Thựy T, Gii Thựy Roxburgh, Sa Hng, Lan Nhung Sột, Hoa Hip Khai Thn Lan, [28]; nhng tờn thng gi l cõy lan Kim Tuyn Lan Kim Tuyn thuc Chi (genus): Anoectochilus H (familia): Orchidaceae B... protocorm lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) l mụi trng cú b sung BAP 0,5 mg/l i vi lan H ip, nng ny l 1,0 mg/l [28] Nh vy mi mt loi lan khỏc nhau s thớch hp vi mt nng BAP nht nh 29 Hỡnh 3.1 Biu so sỏnh nh hng ca nng BAP ti s phỏt sinh chi v to protocorm Lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) trong ng nghim sau 8 tun A B 30 Hỡnh 3.2 nh hng ca BAP ti s to chi v to protocorm Lan Kim Tuyn (Anoectochilus. .. n 1,5cm mi bờn gc mang 6-8 di hp, ch u ụi Mựa hoa thỏng 10-12, mựa qu chớn thỏng 12-3 nm sau [12] 12 Hỡnh 1.1 Hỡnh nh cõy lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) 1.1.2.3 Mt s ng dng ca cõy lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) trong y hc Theo ụng y, lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) cú v ngt, hi chỏt, tớnh mỏt, cú tỏc dng cha thn kinh suy nhc, ho khan, au hng, cao huyt ỏp, suy thn; cha di tinh,... protocorm ca lan Kim Tuyn ( Anoectochilus setaceus) khi s dng hai loi cht kớch sinh trng BAP v kinetin trờn mụi trng PM 33 thy rng t l phỏt sinh chi v hỡnh thnh protocorm ca lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) khi s dng BAP cao hn khi s dng kinetin Trong ú mụi trng b sung BAP nng 0,5 mg/l cho kh nng to chi v tc sinh trng ca chi tt nht Vỡ vy, trong nhõn ging cõy lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus). .. protocorm s tit kim chi phớ, h giỏ thnh sn phm m t l phỏt sinh chi v to protocorm li cao nht Hỡnh 3.3 Biu so sỏnh nh hng ca nng kinetin ti s phỏt sinh chi v to protocorm ca Lan Kim Tuyn ( Anoectochilus setaceus) sau 8 tun nuụi cy 34 A B Hỡnh 3.4 nh hng ca kinetin ti s phỏt sinh chi v to protocorm Lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) sau 8 tuõn nuụi cy A Mụ lan sau 8 tun (i chng) B Mụ lan sau 8 tun... cho rng: Kim tuyn liờn l mt trong nhng dc tho quý, giỳp b mỏu, dng õm, cha tr núng phi v núng gan [31] Nhng cụng trỡnh nghiờn cu ca ngnh dc hc v kinh nghim ca cỏc thy thuc i Loan cho thy lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) cú mt s cụng dng sau: Ton thõn cõy thuc c dựng lm tng cng sc khe, ch tr bnh phi, di tinh, xut tinh sm, yu gan, yu tỡ v cũn cú tỏc dng b mỏu Lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus). .. nhõn ging lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) trong ng nghim ti u, chỳng tụi s dng mụi trng: PM + ng 30g glucose + 8,5g thch agar + 1g than hot tớnh + 100ml nc da + 40g khoai tõy + 40g chui v b sung cht KTST BAP (nng t 0,5 mg/l n 1 mg/l) Kt qu thu c bng 3.1 sau 4 6 8 tun nuụi cy Bng 3.1: nh hng ca BAP ti t l mụ sng, t l mụ to chi v t l mụ to protocorm lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) CT... khớ huyt lu thụng [31] Cõy lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) c thu hỏi ton cõy quanh nm, ra sch, un ti hay phi khụ dựng dn Trc õy, khi giỏ tr ca lan Kim Tuyn cha c bit ti, ngi dõn thng hỏi v nu canh n, v ngt mỏt nh rau mng ti Nhng ngun ti liu v y hc ca i Loan cho thy cõy lan gm li l v thuc c coi l rt quý [31] Sỏch Thanh tho gia ỡnh t nhiờn liu phỏp ghi: tr em hay khúc dựng kim tuyn liờn sc ung s khi... dựng c nhung trc cỏc cuc thi u bi nú cú tỏc dng chng kộm gỡ doping Vin quõn y Trung Quc s dng Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) cựng mt s v khỏc trong iu tr ung th t rt lõu ri Nhng Kim Tuyn cũn cú mt tỏc dng thn kỡ m ngi Vit cha bit ú l cú kh nng tỏi to t bo gan Vi tỏc dng ny, lan Kim Tuyn (Anoectochilus setaceus) thc s l thn dc, c trng sinh, quý hn vng rũng [30] 1.2 K thut nuụi cy in vitro trong cụng