chọn lọc và nhân giống 6 dòng keo tai tượng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Dòng keo tai tượng ưu trội số 1 cho hiệu quả nhân chồi tốt nhất và dòng này được chọn thử nghiệm giai đoạn tạo rễ và tạo cây con hoàn chỉnh và cấy cây ra vườn ươm.. Kết quả cụ thể đạt đư

BỘ CÔNG THƯƠNG TỔNG CÔNG TY GIẤY VIỆT NAM

VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY

………*………

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

CẤP BỘ NĂM 2010 TÊN ĐỀ TÀI:

CHỌN LỌC VÀ NHÂN GIỐNG 6 DÒNG KEO TAI TƯỢNG

BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS PHẠM ĐỨC HUY

8684

PHÚ THỌ 2010

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH ẢNH

Thứ thự Trang

Bảng 01 Thời gian và nồng độ chất NaOCl khử trùng 12

Bảng 02 Nồng độ BAP và NAA ở các công thức thí nghiệm 13

Bảng 03 Nồng độ IBA và ABT ở các công thức thí nghiệm cấy

Bảng 04 Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng

mẫu đến hiệu quả quá trình tạo chồi 17 Biểu đồ 01 Tỷ lệ mẫu nảy chồi ở các công thức khử trùng mẫu 18

Hình 2 Khử trùng mẫu và cấy tạo chồi dòng A14 20

Bảng 05 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hiệu quả

quá trình nhân nhanh chồi dòng A14

21

Biểu đồ 02 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hệ số nhân

chồi dòng A14

22

Biểu đồ 03 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến tỷ lệ chồi

Bảng 06 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hiệu quả

quá trình nhân nhanh chồi dòng số 1

Bảng 07 Tỷ lệ ra rễ và số rễ trung bình/cây ở các công thức thí

nghiệm

25

Biểu đồ 06 Ảnh hưởng phối hợp của IBA và ABT đến tỷ lệ ra rễ

của chồi cấy

25

Biểu đồ 07 Ảnh hưởng phối hợp của IBA và ABT đến số rễ tạo

thành của cây mầm

27

Hình 4 Cây mầm mô ở giai đoạn cấy tạo rễ và vườn ươm 28

Bảng 08 Tỷ lệ sống của cây con ở giai đoạn vườn ươm 29

Hình 5 Tóm tắt sơ đồ phương pháp nghiên cứu giai đoạn 2009

- 2010

30

1.1 Cơ sở pháp lý của đề tài 3

1.2 Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài 3

1.3 Đối tượng và nội dung nghiên cứu 5

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 5 1.3.2 Nội dung nghiên cứu 5

1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu 6

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 6

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 6

2.1.1 Xử lý cây mẹ tạo chồi 11 2.1.2 Tiêu chuẩn mẫu cấy 11 2.1.3 Thử nghiệm thời gian khử trùng mẫu cấy 11

2.1.4 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hiệu quả quá trình nhân nhanh chồi 12

2.1.5 Thử nghiệm ảnh hưởng phối hợp của IBA và ABT1 đến quá

2.1.6 Thử nghiệm thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng

2.1.7 Cấy cây mầm mô ra vườn ươm 14

2.1.8 Điều kiện vật lý của quá trình nuôi cấy 14

2.1.9 Bố trí thí nghiệm 15 2.1.10 Thu thập và xử lý số liệu 15

2.2 Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu 16

2.3 Kết quả thực nghiệm và thảo luận 17

2.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng mẫu bằng

2.3.2 Ảnh hưởng phối hợp của BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu 20

2.3.3 Ảnh hưởng phối hợp của IBA và ABT1 đến quá trình tạo rễ 25

2.3.4 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng của cây con ở vườn ươm 28

III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

PHẦN PHỤ BIỂU

TÓM TẮT

Đề tài “Chọn lọc và thử nghiệm nhân giống 6 dòng keo tai tượng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào” được thực hiện trong 2 năm 2009 và 2010 Qua 2 năm tiến hành các thử nghiệm, đề tài đã chọn được 6 cây trội và xác định được màu sắc gỗ của cây trội được chọn lọc Xử lý tạo chồi và đưa mẫu vào invitro được 6 dòng keo tai tượng và thử nghiệm giai đoạn nhân nhanh cho 6 dòng Dòng keo tai tượng ưu trội số 1 cho hiệu quả nhân chồi tốt nhất và dòng này được chọn thử nghiệm giai đoạn tạo rễ và tạo cây con hoàn chỉnh và cấy cây

ra vườn ươm Đồng thời đề tài cũng bước đầu thử nghiệm đưa chồi vào invitro

và nghiên cứu nhân nhanh chồi cho dòng keo tai tượng ưu trội A14 Đây là dòng

có triển vọng đã được chọn lọc và trồng rừng khảo nghiệm dòng vô tính tại Hàm Yên Kết quả cụ thể đạt được sau 2 năm nghiên cứu và thử nghiệm như sau:

Năm 2009, đề tài tập trung thực hiện 2 nội dung nghiên cứu chính: Thứ nhất là tiến hành chọn cây trội, xác định màu sắc gỗ của cây trội và

tiến hành xử lý tạo chồi phục vụ nuôi cấy mô tế bào Đề tài đã chọn được 6 cây

mẹ ưu trội nhất từ 20 cây trội của Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy đã chọn trước đây Đã xác định được màu sắc lõi gỗ của 6 cây mẹ cung cấp vật liệu nhân giống bằng phương pháp khoan tăng trưởng

Thứ hai là thử nghiệm một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đưa mẫu

vào in vitro và giai đoạn nhân nhanh chồi Giai đoạn đưa mẫu vào in vitro (cấy mẫu từ tự nhiên vào ống nghiệm) đã xác định được khử trùng bằng HgCl2 0,1% với thời gian 16 phút cho tỷ lệ sống cao nhất bình quân đạt 15,6% Thời gian cắt mẫu vào mùa hè có tỷ lệ mẫu sống cao hơn hẳn khi cắt mẫu vào mùa thu Môi trường cơ bản thích hợp nhất là môi trường MS Giai đoạn nhân nhanh chồi đã xác định được môi trường cho hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu cao nhất đối với từng dòng là:

- Dòng 1: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5 g/l agar + 1,5mg/l BAP + 1,2 mg/l NAA, pH=6 Với môi trường này, hệ số nhân chồi đạt 1,6 lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu là 18,9%

- Dòng 2, 3, 6 và dòng số 13: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5 g/l agar + 1,2mg/l BAP + 0,9 mg/l NAA, pH=6 Hệ số nhân chồi của các

Năm 2010, đề tài tiếp tục nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh chồi và thử nghiệm giai đoạn tạo rễ cho dòng ưu trội số 1 Đồng thời đề tài bước đầu nghiên cứu tạo chồi và nhân chồi cho dòng Keo tai tượng ưu trội có triển vọng đã được chọn lọc A14

Với dòng Keo tai tượng ưu trội số 1, môi trường thích hợp nhất cho giai đoạn nhân nhanh chồi là môi trường MS + 1,6mg/l BAP + 1,2mg/l NAA + 30g/l đường sucarose + 4,7g/l Agar, pH=6 Hệ số nhân chồi đạt được 2,5 lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu là 44,7% Môi trường thích hợp nhất cho tạo rễ là ½ MS + 2,0mg/l IBA + 2,0mg/l ABT1 + 15g/l đường sucarose + 5,0g/l Agar, pH=6 Tỷ lệ chồi ra

rễ đạt 78,0% và số rễ trung bình/cây đạt 2,7 rễ/cây Cây mầm trong ống nghiệm cần huấn luyện 2 tuần trước khi cấy ra vườn ươm, tỷ lệ cây sống sau 8 tuần kể từ khi cấy cây mầm ra vườn ươm đạt 60,7% với công thức huấn luyện 2 tuần

Giai đoạn tạo chồi dòng Keo tai tượng A14, đề tài đã thử nghiệm khử trùng mẫu bằng NaOCl với các nồng độ và thời gian khác nhau Công thức cho

tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi cao nhất đạt 7,2% Trong khi đó công thức đối chứng

sử dụng chất khử trùng là HgCl2 0,1% với thời gian khử trùng 16 phút cho tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi đạt 17,2% trường tạo chồi và nhân nhanh chồi tốt nhất cho dòng A14 là môi trường MS + 1,6mg/l BAP + 1,2mg/l NAA + 30g/l đường sucarose + 4,7g/l Agar, pH=6 Hệ số nhân chồi đạt được là 1,3 lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu là 30,2%

I TỔNG QUAN

1.1 Cơ sở pháp lý của đề tài

- Căn cứ quyết định số 6228/QĐ-BCT, ngày 10/12/2009 của Bộ trưởng Bộ Công thương về việc đặt hàng thực hiện các nhiệm vụ khoa học và công nghệ năm 2010

- Căn cứ hợp đồng số 12.10.RD/HĐ-KHCN ngày 01/02/2010 giữa Bộ Công thương và Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy về việc đặt hàng sản xuất

và cung cấp dịch vụ sự nghiệp công nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ

- Căn cứ quyết định số 12/VNC-QĐ.KHTH ngày 04 tháng 02 năm 2010 của Viện trưởng Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy về việc giao nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ năm 2010

1.2 Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài

1.2.1 Tính cấp thiết của đề tài

Keo tai tượng (Acacia mangium Wild) đã và ngày càng được trồng rộng

rãi ở hầu hết các vùng sinh thái của nước ta và là loài cây ưu tiên trồng rừng ở cả

9 vùng sinh thái trên toàn quốc Đối với vùng Trung tâm Bắc Bộ hiện nay thì đây

là loài cây được trồng phổ biến và có diện tích rừng trồng lớn nhất trong số các loài cây trồng rừng kinh tế

Năm 1996 Trung tâm nghiên cứu cây nguyên liệu giấy nay là Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy đã chuyển hóa 10,6 ha rừng trồng khảo nghiệm từ nguồn hạt nhập nội xuất xứ Carlwell tại Hàm Yên – Tuyên Quang thành rừng giống Hiện nay, rừng giống chuyển hóa này đã cho hiệu quả rõ rệt, rừng trồng

từ nguồn hạt của rừng giống sinh trưởng, phát triển và cho năng suất cao hơn rõ rệt so với rừng trồng đại trà ở Vùng Trung tâm Bắc Bộ Tuy nhiên, sản lượng hạt của rừng giống còn thấp, nguồn hạt giống không đủ cung cấp cho trồng rừng của Tổng công ty giấy nói riêng cũng như trồng rừng trong khu vực Một số cây sinh trưởng và phát triển tốt, có thể tích thân cây lớn lại không ra hoa kết quả Đồng thời sử dụng hạt giống từ của cây trội còn có những hạn chế do thu phấn mang lại Nhân giống vô tính những cây trội này đảm bảo giữ được những đặc tính ưu trội của chúng và dễ dàng lưu giữ nguồn gen quý

Cũng như các loài cây khác, nhân giống vô tính cây Keo tai tượng vừa nhân nhanh các dòng đã được chọn lọc, tăng sự đồng đều của rừng trồng từ đó tăng năng suất và chất lượng rừng Do vậy, nuôi cấy mô tế bào các dòng Keo tai tượng ưu trội của rừng giống Hàm Yên vừa đáp ứng được các mục đích nêu trên vừa đáp ứng bảo tồn và phát triển nguồn gen quý khi rừng giống không còn thu hái hạt

Xuất phát từ những đặc điểm nêu trên, để tạo ra số lượng lớn cây con chất lượng cao phục vụ trồng rừng khảo nghiệm và trồng rừng kinh tế Về lâu dài là nâng cao năng suất, chất lượng rừng và phát triển nguồn gen quý được chọn lọc thì thử nghiệm nhân giống cây Keo tai tượng và tiến tới hoàn thiện công nghệ nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào là cần thiết

Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy là một trong những đơn vị đi đầu về nuôi cấy mô tế bào các loài cây lâm nghiệp, nhiều loài cây đã được nuôi cấy ở quy mô công nghiệp, đội ngũ cán bộ có nhiều kinh nghiệm, cơ sở vật chất tương đối đầy đủ Đây là những yếu tố quan trọng để đề tài đạt được tốt nhất các mục tiêu đề ra

1.2.2 Mục tiêu của đề tài

™ Mục tiêu lâu dài

Chọn lọc và nhân nhanh cây Keo tai tượng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào Tạo được cây con Keo tai tượng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào cho trồng rừng khảo nghiệm Góp phần nâng cao năng suất và chất lượng rừng trồng Keo tai tượng

™ Mục tiêu cụ thể:

Với dòng số 1:

1 Nâng cao hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu trong giai đoạn nhân chồi

2 Xác định môi trường thích hợp cho giai đoạn tạo rễ

3 Xác định thời gian huấn luyện thích hợp cho tỷ lệ cây sống cao khi cấy cây mầm từ bình nuôi cấy ra vườn ươm

Với dòng A14:

1 Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu bằng NaOCl cho tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi cao

2 Tìm môi trường nhân chồi thích hợp cho giai đoạn nhân chồi

1.3 Đối tượng và nội dung nghiên cứu

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

™ Dòng Keo tai tượng số 1:

Đây là dòng đã được tiến hành thử nghiệm nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào năm 2009 và cho kết quả có triển vọng nhất Năm 2010, đề tài tiếp tục thử nghiệm các bước hoàn thiện hơn cho quá trình nhân chồi và tạo rễ

™ Dòng Keo tai tượng A14:

Với dòng này, đề tài bước đầu thử nghiệm giai đoạn tạo chồi từ cây mẹ ngoài tự nhiên và môi trường thích hợp cho tạo chồi và nhân chồi

1.3.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:

1 Cắt mẫu, khử trùng mẫu cấy và cấy mẫu vào ống nghiệm

2 Thử nghiệm nồng độ và thời gian khử trùng mẫu bằng NaOCl

3 Thử nghiệm ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hiệu quả của quá trình nhân chồi

4 Thử nghiệm ảnh hưởng của IBA và ảnh hưởng phối hợp của IBA và ABT1

đến hiệu quả của quá trình ra rễ

5 Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống khi cấy cây mầm ở vườn ươm

6 Cấy chuyển cây mầm từ bình rễ ra vườn ươm và xác định tỷ lệ sống, chất lượng của cây con

7 Thu thập, xử lý số liệu và viết báo cáo

1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu

1.4.1 Trong nước

Các loài keo nói chung (Acacia) đặc biệt là keo tai tượng (Acacia

mangium) đã trở thành loài cây trồng rừng chính ở nước ta hiện nay Đây là loài

cây họ đậu có tốc độ phát triển nhanh, thích nghi với nhiều dạng lập địa, chất lượng gỗ tốt và đa tác dụng Đặc biệt cây keo có thể phát triển trên những lập địa thiếu nitơ vì hệ rễ có nốt sần cố định đạm do đó chúng còn được trồng làm cây cải tạo đất [2]

Trong các chương trình cải tạo giống cây lâm nghiệp thì giai đoạn nhân giống nhằm tạo ra số lượng lớn cây con có chất lượng di truyền đồng đều từ đó nâng cao năng suất và chất lượng rừng là vô cùng quan trọng Tuy nhiên, đối với cây keo tai tượng thì các nghiên cứu mới tập trung vào giai đoạn chọn tạo giống

và xây dựng vườn giống, rừng giống hữu tính Việc nghiên cứu và ứng dụng kỹ

thuật nhân giống in vitro còn hạn chế và cho đến nay chưa có những báo cáo về nhân giống in vitro đối với loài cây này

Cùng loài với cây keo tai tượng là cây keo lai đã được tiến hành nghiên cứu và sản xuất thử nghiệm tại nhiều nơi ở nước ta Hiện nay một số đơn vị đã sản xuất cây con keo lai bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào Trong số các công trình nghiên cứu trong nước thì nổi bật là kết quả nghiên cứu của đề tài

“Nghiên cứu nhân nhanh giống keo lai tự nhiên, keo lai nhân tạo, bạch đàn Uro, bạch đàn lai nhân tạo và lát hoa mới chọn tạo bằng công nghệ tế bào” do ThS Đoàn Thị Mai làm chủ nhiệm Đề tài đã xác định được phương pháp khử trùng cho một số dòng keo lai, trong đó các dòng keo lai tự nhiên như BV71, BV73 và BV75 là HgCl2 0,5% với thời gian khử trùng 10 phút cho tỷ lệ bật chồi 15,4% Với các dòng này thì môi trường nhân chồi là MS* + BAP 1,5mg/l + các phụ gia khác Môi trường ra rễ thích hợp là: 1/2MS* + IBA 1,5 mg/l + các phụ gia khác,

tỷ lệ ra rễ đạt 77-91% Ngoài ra công trình cũng đưa ra kết quả về nhân giống invitro với dòng keo lai nhân tạo MA2 cũng cho kết quả tương tự

1.4.2 Ngoài nước

Cùng với một số loài cây thân gỗ khác như bạch đàn, thông, dương vv, nhân giống cây keo tai tượng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã được

thực hiện ở nhiều nước trên thế giới và thu được những thành công đáng kể,

nhiều công trình nghiên cứu về loài cây này đã được công bố như:

Tác giả Darus H Ahmad thuộc Viện nghiên cứu lâm nghiệp Malaysia

(Forest Research Institute) đã nuôi cấy in vitro cây keo tai tượng (Acacia

mangium) bằng môi trường MS có bổ sung 3% sucrose, 0.6% agar và 0.5 mg/l

BAP cho giai đoạn nhân chồi Những chồi có chiều cao >0.5 cm được cấy vào môi trường tạo rễ và chất điều hoà sinh trưởng tốt nhất cho tạo rễ là IBA ở nồng

độ 1000ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% [7]

Với công bố của Marie-Claude Bon [8] về nghiên cứu nhân giống invitro cây Keo tai tượng với vật liệu nhân giống là hạt Tác giả đã thử nghiệm 7 công thức về nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng đối với môi trường nhân nhanh chồi Trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy ngày/đêm là 28/22 ± 20C thì môi trường nhân chồi tốt nhất là môi trường MS + 4,4µM BA + 2,7 µM NAA, pH =5,6-5,8 Sau 8 tuần nuôi cấy thu được chiều cao trung bình của chồi là 10,5mm

Năm 2004, Olivier Monteuuis [11] đã công bố kỹ thuật nhân giống in vitro

cây keo tai tượng với cây mẹ là những cây trội tuổi 7 Ở đây mẫu được khử trùng bằng cồn 70% trong vòng 5 phút sau đó khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 3 phút Môi trường nhân chồi là môi trường MS có bổ sung 50mg/l Myo-inositol +

200 mg/l casein hydrolyzate + 2mg/l glysin + 2,2 µM BA + 0,1µM NAA + 30g/l sucarose; pH từ 5,6-5,8

V.J.Hartney và cộng sự đã tạo cây con keo tai tượng thành công bằng nuôi

cấy in vitro Ở đây vật liệu nuôi cấy là hạt giống xuất xứ Cardwell, Queensland,

đây cũng là xuất xứ của những cây trội trong đề tài Hạt được gieo trong ống nghiệm cho nảy chồi phục vụ các nghiên cứu tiếp theo Môi trường nuôi cấy được sử dụng là WPM + 3% sucrose + 0.8% agar + 1µM BAP + 1 µM NAA Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250C (±40) Giai đoạn khử trùng mẫu

để tạo vật liệu ban đầu tác giả đã sử dụng muối hypochlorite 4% và khử trùng trong thời gian 20 phút

Cùng với cây keo tai tượng, cây keo lá tràm (Acacia auriculiformis) cũng

đã được W.Nitiwattanachai nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thành công từ chồi của cây trội Ở đây tác giả sử dụng môi trường nhân nhanh

chồi là MS (1962) + 10 µM BAP + 0.5 µM IBA, môi trường sử dụng cho tạo rễ

là môi trường White (1963) + 2 µM IBA + 1 µM NAA [12]

Từ những nghiên cứu trên cho thấy, nhân giống in vitro cây keo tai tượng

thường sử dụng tổ hợp 2 chất điều hòa sinh trưởng là BAP và NAA với ph từ 5,6-5,8 Tuy nhiên các các nghiên cứu khác nhau lại sử dụng nồng độ khác nhau, điều này cho thấy vật liệu nghiên cứu khác nhau đòi hỏi nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng cũng khác nhau Vật liệu là hạt gieo trong ống nghiệm thì nồng

độ các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường nhân chồi thấp hơn với vật liệu từ chồi cắt từ cây mẹ Cây mẹ có tuổi càng cao đòi hỏi nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng càng cao

- Dòng 1: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5 g/l agar + 1,5mg/l BAP + 1,2 mg/l NAA, pH=6 Với môi trường này, hệ số nhân chồi đạt 1,6 lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu là 18,9%

- Dòng 2, 3, 6 và dòng số 13: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5 g/l agar + 1,2mg/l BAP + 0,9 mg/l NAA, pH=6 Hệ số nhân chồi của các dòng lần là: 1,5 lần; 1,6 lần; 1,6 lần và 1,4 lần Tỷ lệ chồi hữu hiệu là 24,8%; 22,7%; 22,0% và 22,4%

- Dòng 14: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5 g/l agar + 0,9mg/l BAP + 0,6mg/l NAA, pH=6 Với môi trường này, hệ số nhân chồi đạt 1,7 lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu là 26,7%

Năm 2010, đề tài tiến hành chọn ra một dòng làm đối tượng nghiên cứu

Vì mục tiêu của công tác cải thiện giống công tác cải thiện giống là nhân giống các dòng có năng suất và chất lượng tốt, hình thái thân cây đẹp thích hợp cho trồng rừng cung cấp gỗ nguyên liệu giấy Kết quả năm 2009 cho thấy dòng số 1

có hệ số nhân chồi thấp hơn chút ít so với dòng 14 nhưng thể tích thân cây đứng lại cao hơn rất nhiều và hình thái thân cây đẹp thích hợp cho trồng rừng nguyên liệu giấy Do đó, đề tài chọn dòng số 1 làm đối tượng nghiên cứu của năm 2010

Đồng thời từ kết quả khảo nghiệm dòng vô tính cây keo tai tượng của để tài cấp Bộ Công thương: “Chọn và dẫn giống một số dòng bạch đàn và keo tai

tượng ở vùng trung tâm Bắc Bộ để thiết lập vườn lưu giữ giống” do Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy chủ trì giai đoạn 2007-2009 Tại 25 tháng tuổi chọn được một số dòng sinh trưởng tốt Trong các dòng khảo nghiệm của đề tài này, dòng A14 có sinh trưởng tốt nhất với đường kính D1.3 đạt 7,4cm; Hvn đạt 7,5m

và thể tích thân cây đạt 15,8dm3 tại 25 tháng tuổi Đây là kết quả tốt có ý nghĩa

về cả về khoa học và thực tiễn Nhằm rút ngắn thời gian cho chương trình cải thiện giống, kế thừa những kết quả đã khảo nghiệm và phát triển giống tốt vào sản xuất, đề tài bước đầu thử nghiệm nuôi cấy mô cho dòng Keo tai tượng A14

Như vậy năm 2010, đề tài tiến hành các nghiên cứu cho hai đối tượng chính là dòng ưu trôi số 1 (chọn lọc và nghiên cứu tiếp cho năm 2009) và bước đầu nghiên cứu cho dòng keo tai tượng có triển vọng đã được chọn lọc là dòng A14

2.1 Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ phương pháp nghiên cứu của đề tài năm 2010

2.1.1 Xử lý cây mẹ tạo chồi

Cây trội dòng A14 được xử lý tạo chồi từ khoảng độ cao cách mặt đất từ 1-2m Tạo chồi bằng phương pháp ken cây (bóc toàn bộ lớp vỏ ½ chu vi thân cây với chiều dài 4-5cm) Sau khi ken cây, dùng bông thấm đều trên bề mặt vết cắt bằng dung dịch BAP 1%

Hình 01 Ken cây tạo chồi dòng A14 2.1.2 Tiêu chuẩn mẫu cấy

Mẫu được cắt vào buổi sáng (8h-9h) vào những ngày nắng ráo và trước ngày cắt từ 2-3 ngày cũng nắng, không mưa nhằm hạn chế tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn Mẫu n uôi cấy (explants) được lấy ở những chồi sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, cắt bỏ phần ngọn non, toàn bộ phiến lá và gần hết phần cuống lá (cuống lá được cắt sát với chồi) Mẫu cấy có chiều dài từ 4-7 cm, chứa 2-3 nách

lá từ lá thứ 3 đến lá thứ 6

2.1.3 Thử nghiệm thời gian khử trùng mẫu cấy

Do mẫu sống nên không thể khử bằng nhiệt độ cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó Do đó mẫu cấy thực vật phải được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng Các dung dịch khử trùng thường dùng là hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, oxi già…vv Tỉ lệ vô trùng thành công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và khả năng

xâm nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng

đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy Các dung dịch dùng để khử

trùng mẫu phải bảo vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng phải đủ để

tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn

Bảng 01 Thời gian và nồng độ chất khử trùng mẫu NaOCl ở các công thức

Nồng độ NaOCl (%) Thời gian khử trùng (phút) Công thức

Mẫu sau khi cắt được ngâm ngay vào nước Sau đó rửa mẫu bằng nước 3

lần, tiếp tục rửa bằng xà phòng (xà phòng bột) và rửa lại 4 lần bằng nước cất

Đưa mẫu vào phòng cấy vô trùng, rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng Khử

trùng bằng cồn 750 khoảng 2 giây, sau đó rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng

Cuối cùng khử trùng mẫu bằng NaOCl cuối cùng rửa lại bằng nước cất vô trùng

Các khoảng thời gian khử trùng mẫu cấy bằng NaOCl được thể hiện ở bảng 01

2.1.4 Thử nghiệm ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hiệu quả quá

trình nhân nhanh chồi

Các chất điều hoà sinh trưởng tuy chiếm hàm lượng rất nhỏ trong môi

trường nuôi cấy nhưng có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của quá

trình nhân giống Chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng mạnh mẽ và quan

trọng nhất trong giai đoạn nhân nhanh chồi đó là các chất thuộc nhóm cytokinin,

hầu hết các nghiên cứu nuôi cấy mô đều có sử dụng các chất thuộc nhóm này,

cytokinin thường được sử dụng là BAP Tỷ lệ cân đối giữa cytokinin /auxin có

ảnh hưởng đến chất lượng của chồi và hệ số nhân chồi [1] Nồng độ các chất

điều hòa sinh trưởng được bố trí theo các công thức ở bảng 02

Bảng 02 Nồng độ BAP và NAA ở các công thức thí nghiệm

1,3 CT13 1,1 CT14

1,2 CT15 (ĐC) 1,5

1,3 CT16 1,1 CT17 1,2 CT18 1,6

1,3 CT19

2.1.5 Thử nghiệm ảnh hưởng phối hợp của ABT 1 và IBA đến hiệu quả của quá

trình tạo rễ.

Trong nuôi cấy invitro, giai đoạn này không đòi hỏi cây trong ống nghiệm

sinh trưởng nhan mà chỉ nhằm cung cấp đủ chất dinh dưỡng thích hợp cho quá

trình tạo rễ Do đó, ở giai đoạn này hầu hết các loài cây chỉ sử dụng môi trường

khoáng ½MS và nồng độ đường giảm ½ so với môi trường nhân chồi Vì thế ở

đây đề tài cũng sử dụng môi trường khoáng ½ MS và nồng độ đường là 15g/l và

bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng ở bảng 03

Các công thức ở bảng 02 sử dụng môi trường cấy tạo rễ cây bạch đàn

dòng U6 làm đối chứng

2.1.6 Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và

chất lượng của cây con ở vườn ươm

Trong giai đoạn ống nghiệm, cây mô được nuôi cấy trong điều kiện tối ưu

về nhiệt độ, ánh sáng và môi trường dinh dưỡng Do đó, để cấy cây ra bầu có tỷ

lệ sống cao, chất lượng cây con tốt cần có khoảng thời gian để cây thích nghi dần

với ánh sáng và nhiệt độ của môi trường tự nhiên nên cần thiết phải huấn luyện

trong điều kiện ánh sánh và nhiệt độ tự nhiên

Khi cây con đã ra rễ trong bình trụ được đưa ra nhà huấn luyện với mái nhựa trong, không để ánh sáng trực tiếp chiếu vào bình cây Thử nghiệm huấn luyện ở 3 khoảng thời gian 1 tuần (ký hiệu CT32), 2 tuần (CT33) và 3 tuần (CT34)

Bảng 03 Nồng độ ABT 1 và IBA ở các công thức thí nghiệm cấy ra rễ

Nồng độ IBA (mg/l) Nồng độ ABT 1 (mg/l) Ký hiệu

2.1.7 Cấy cây mầm ra vườn ươm

Cây con được cấy ra vườn ươm theo quy trình kỹ thuật chăm sóc cấy cây mầm mô Bạch đàn với bầu 7x11cm, giá thể là đất tầng B Đánh giá tỷ lệ sống ở các công thức thử nghiệm thời gian huấn luyện ở 8 tuần sau khi cấy

2.1.8 Điều kiện vật lý của quá trình nuôi cấy

- Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250C (±30)

- Độ ẩm trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 55% (±5%)

- Cường độ chiếu sáng từ 1000-3000 lux (mỗi thời điểm khác nhau sử dụng cường độ chiếu sáng khác nhau)

- Thời gian chiếu sáng từ 10-11h/ngày

- pH môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng =6,0

- Đo đếm, tính toán tỷ lệ ra rễ, số rễ tạo thành ở 3 tuần sau khi cấy

- Với các thí nghiệm về khử trùng mẫu cấy thì mẫu được cấy trong ống nghiệm Đánh giá qua số mẫu sống và nảy chồi Mỗi công thức thí nghiệm cấy 60 mẫu (mỗi mẫu cấy vào 1 ống nghiệm)

- Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường nhân chồi, mẫu được cấy trong bình tam giác 500ml Các thí nghiệm về môi trường tạo rễ, mẫu được cấy trong bình trụ, mỗi công thức theo dõi thử nghiệm 10 bình, mỗi bình 10 chồi

∑ Chồi hữu hiệu

Tỷ lệ chồi hữu hiệu (%) = - x 100

∑ Số rễ tạo thành

Số rễ trung bình/cây (Rễ) = -

∑ Số cây Chồi hữu hiệu là những chồi có chiều cao từ 1,0 cm trở lên, thân, lá và ngọn rõ ràng, có nhiều hơn 2 cặp lá, không bị callus Ghi tình trạng phát triển của chồi ở cả hai giai đoạn nhân chồi và ra rễ bao gồm: hình thái của chồi, những chồi chết, chồi bị đen

Cây ra rễ là những cây có rễ với chiều dài rễ >2 mm, cây có rễ <2mm được coi là không ra rễ

• Xử lý số liệu

- Vẽ biểu đồ và tính các giá trị trung bình được thực hiện trên phần mềm Excel

- Để kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố đến chỉ tiêu nghiên cứu, đề tài

sử dụng phương pháp phân tích phương sai hai nhân tố với độ tin cậy 95% Với các thí nghiệm không thảo mãn điều kiện phân tích phương sai, sử dụng phương pháp kiểm định phi tham số cho K mẫu độc lập Dùng chỉ tiêu phân hạng Duncan để tìm ra công thức tốt nhất

2.2 Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu

- Panh, kéo nuôi cấy mô

- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô và các trang thiết bị phụ trợ khác

2.3 Kết quả thực nghiệm và thảo luận

2.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng mẫu đến tỷ lệ mẫu sống

Hiện nay, HgCl2 được sử dụng khá phổ biến để khử trùng mẫu trong nhân giống in vitro các loài thực vật nói chung Đây là chất khử trùng tốt, hầu hết khi khử trùng bằng HgCl2 đều cho tỷ lệ mẫu sống cao Tuy nhiên, HgCl2 là chất độc hại với con người cũng như các sinh vật nói chung Ngoài ra sau khi khử trùng thì HgCl2 được thải ra môi trường sẽ gây ảnh hưởng đến nguồn nước Với mục tiêu có thể sử dụng loại hóa chất khác thay thế cho HgCl2, đề tài thử nghiệm khử trùng mẫu bằng NaOCl, muối này dễ phân hủy và không độc hại khi thải ra môi trường bên ngoài Hầu hết các kết quả nghiên cứu về khử trùng mẫu đều cho thấy hiệu quả khi khử trùng mẫu bằng NaOCl đều thấp hơn HgCl2

NaOCl có tác dụng diệt khuẩn nhờ gốc OCl- , cơ chế của quá trình diệt khuẩn có thể chia làm 2 giai đoạn: đầu tiên chúng khuếch tán xuyên qua vỏ tế bào của vi sinh vật, sau đó phản ứng với men bên trong tế bào và phá hoại quá trình trao đổi chất của tế bào dẫn đến tế bào vi sinh vật bị diệt vong Hiệu quả quá trình khử trùng phụ thuộc vào nồng độ của gốc OCl-, thời gian và nhiệt độ nước, khi nhiệt độ nước càng cao thì quá trình khuếch tán cành mạnh Tuy nhiên nếu nồng độ quá cao sẽ dẫn đến tế bào thực vật bị tổn thương mạnh và gây chết mẫu

Giai đoạn này vật liệu nuôi cấy được tách rời hoàn toàn khỏi cây mẹ và đưa từ môi trường tự nhiên vào điều kiện ống nghiệm Mục tiêu của khử trùng mẫu cần đạt được các yêu cầu sau: tỉ lệ chồi chết thấp, tỉ lệ chồi nhiễm nấm, khuẩn thấp và tỉ lệ sống cao Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả được trình bày ở bảng

04 và biểu đồ 01

Bảng 04 Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng đến hiệu quả của

giai đoạn đưa mẫu vào in vitro với dòng A14

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu chết (%)

Tỷ lệ mẫu nảy chồi (%)

Biểu đồ 01: Tỷ lệ mẫu nảy chồi ở các công thức khử trùng mẫu

Bảng 04 cho thấy: Tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn ở các công thức khử trùng bằng NaOCl rất cao Số mẫu nhiễm cao nhất là 92,8% ở công thức số 1 (CT1) với nồng độ 5% NaOCl và thời gian khử trùng mẫu là 10 phút Thấp nhất là công thức số 9 (CT9) đạt 70,6% với thời gian khử trùng 30 phút và nồng độ 30% Mặc

dù tỷ lệ mẫu nhiễm ở các công thức 8 và 9 thấp hơn công thức 6 (CT6) nhưng tỷ