Nghiên cứu tái sinh giống sa nhân tím (amomum longilgulare t l wu) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ THỊ HỒNG NHUNG Tên đề tài NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG SA NHÂN TÍM (Amomum longilgulare T.L.Wu) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa : Chính quy : Công nghệ sinh học : CNSH - CNTP Khoá học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, năm 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ THỊ HỒNG NHUNG Tên đề tài NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG SA NHÂN TÍM (Amomum longilgulare T.L.Wu) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học L ớp Khoa : K42 - CNSH Khoá học : 2010 - 2014 : CNSH – CNTP Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Ngô Xuân Bình ThS Đào Duy Hưng Thái Nguyên, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực đề tài em tạo điều kiện, quan tâm giúp đỡ thầy cô giáo, bạn bè gia đình, thời gian qua em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện Khoa học Sự sống, Đại học Nông lâm Thái Nguyên Em xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Ngô Xuân Bình, trưởng khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ Thực Phẩm, toàn thể thầy cô khoa Công nghệ Sinh học - Công nghệ thực phẩm giảng dạy bảo cho em nhiều trình học tập thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Thị Tình, giảng viên khoa CNSH - CNTP, người tận tình bảo, hướng dẫn, sai lầm giúp em hoàn thành tốt khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Đào Duy Hưng thầy cô, anh chị phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện Khoa học Sự sống, Đại học Nông lâm Thái Nguyên tận tình giúp đỡ hướng dẫn giúp em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp đại học Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện vật chất tinh thần cho em trình học tập nghiên cứu Do trình độ điều kiện thời gian thực đề tài có hạn nên đề tài không tránh khỏi sai sót Em mong nhận góp ý thầy cô bạn để đề tài hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, ngày 30 tháng năm 2014 Sinh viên thực Lê Thị Hồng Nhung DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT BA : 6-Benzylaminopurine CT : Công thức CV : Coefficient of Variation Đ/C : Đối chứng IAA : Indol axetic acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Significant Difference Test MS : Murashige and Skoog’s NAA : α - Naphlene axetic acid TN : Thí nghiệm 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu Sa Nhân Tím 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.2 Đặc điểm thực vật học Sa Nhân Tím 2.1.3 Công dụng Sa Nhân Tím 2.1.4 Tình hình nghiên cứu nhân giống Sa Nhân Tím giới Việt Nam 2.1.4.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống Sa Nhân Tím nuôi cấy mô giới 2.1.4.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống Sa Nhân Tím nuôi cấy mô Việt Nam 2.2 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.2 Tính toàn (Totipotence) tế bào 2.2.3 Sự phân hóa phản phân hóa tế bào 2.2.4 Điều kiện môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 2.2.5 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 2.2.6 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật 16 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 18 3.2 Địa điểm, thời gian điều kiện nghiên cứu 18 3.3 Hóa chất thiết bị 18 3.4 Nội dung nghiên cứu 19 3.5 Xử lý số liệu 25 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng số chất khử trùng đến khả vô trùng mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) 26 4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch H2O2 (5%) đến khả vô trùng mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) 26 4.1.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch HgCl2 (0,1%) đến khả vô trùng mẫu mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) 28 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng đến khả tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) 31 4.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến khả tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) 31 4.2.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) 33 4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp BAP IAA đến hiệu tái sinh chồi Sa Nhân tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) 35 4.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến hiệu tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) 37 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch H2O2 (5%) đến khả vô trùng mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) ( sau 20 ngày nuôi cấy) 26 Bảng 4.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch HgCl2 (0,1%) đến khả vô trùng mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 20 ngày nuôi cấy) 28 Bảng 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến khả tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) 31 Bảng 4.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) 33 Bảng 4.5 Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp BAP IAA đến hiệu tái sinh chồi Sa nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) 35 Bảng 4.6 Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến hiệu tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) 37 (sau 45 ngày nuôi cấy) 37 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 4.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch H2O2 (5%) đến khả vô trùng mẫu mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 20 ngày nuôi cấy) 27 Hình 4.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch HgCl20,1% đến khả vô trùng mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) sau 20 ngày nuôi cấy 29 Hình 4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến khả tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum Longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) 32 Hình 4.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) 34 Hình 4.5 Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp BAP IAA đến hiệu tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) 36 Hình 4.6 Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến hiệu tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) 38 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Sa Nhân Tím (Amomum longiligulare T.L.Wu), thuộc chi Sa Nhân (Amomum), họ gừng (Zingiberaceae) [11] Sa Nhân Tím thuốc quý, có danh mục thực vật rừng quý ban hành kèm theo nghị định số 18 HĐBT ngày 17/01/1992 [8] Trong y học cổ truyền, Sa Nhân sử dụng làm thuốc, nhằm kích thích tiêu hóa, chữa ăn uống không tiêu, bị nôn mửa, đau dày, đau bụng, kiết lỵ, sảy thai, bệnh cao huyết áp, cao cholesterol máu [11], [15] Quả Sa Nhân tím chứa tinh dầu có tác dụng kháng khuẩn nấm [17], [23], [28] Sa Nhân Tím dùng làm gia vị, hương liệu sản xuất xà phòng thơm Chính thế, không dược liệu quý mà dùng nhiều nước xuất nhiều nước giới Rừng tự nhiên bị tàn phá nghiêm trọng Cây dược liệu bị khai thác tự nên diện tích sản lượng ngày suy giảm Cây Sa Nhân bị khai thác tự nên ngày bị thu hẹp diện tích, giống Sa Nhân Tím bị dần thoái hóa Nếu không kịp thời trồng tác động biện pháp tích cực nguồn gen trồng có giá trị cao dần bị Trong nhu cầu sử dụng thuốc đông dược để chăm sóc bảo vệ sức khỏe ngày cao Vấn đề phát triển dược liệu, khắc phục khó khăn cần giải Nhân giống Sa Nhân phương pháp nuôi cấy mô tạo sản lượng lớn giống bệnh phục vụ cho sản xuất, khắc phục khó khăn việc bảo tồn nguồn gen, cung cấp giống, giúp cho người dân chủ động mùa vụ diện tích trồng chi phí lưu trữ giống Xuất phát từ sở trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tái sinh giống Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) phương pháp nuôi cấy mô tế bào’’ 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu thành công tái sinh Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) phương pháp nuôi cấy mô tế bào 1.3 Yêu cầu Xác định ảnh hưởng số chất khử trùng (HgCl2, H2O2) đến khả vô trùng mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) Xác định ảnh hưởng số chất điều tiết sinh trưởng (BAP, IBA, IAA, Kinetin) đến khả tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu tái sinh giống Sa Nhân Tím phương pháp nuôi mô Từ đó, đánh giá tác động số chất kích thích sinh trưởng nhân giống Sa Nhân Tím Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo phục vụ nghiên cứu, giảng dạy sản xuất giống Sa Nhân Tím có suất cao 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết nghiên cứu thành công tái sinh Sa Nhân Tím phương pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm bảo tồn nguồn gen dược liệu cung cấp giống với số lượng lớn, chất lượng đảm bảo, đồng thời giữ đặc tính di truyền chon lọc 39 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu đưa số kết luận sau: Khử trùng mẫu HgCl2 nồng độ 0,1% thời gian 15 phút cho kết cao với tỷ lệ mẫu đạt 76,67% Môi trường MS + saccarose 30g/l + inositol 100 mg/l + agar 6,8 g/l +BAP mg/l + IAA 0,2 mg/l; pH = 5,8 thích hợp cho tái sinh chồi Sa Nhân tím in vitro cho tỷ lệ mẫu bật chồi đạt 82,22% hệ số bật chồi đạt 2,13 lần 5.2 Kiến nghị Do điều kiện thời gian không cho phép nên chưa thực thí nghiệm giai đoạn nên kiến nghị số vấn đề sau: - Tiếp tục nghiên cứu nhân nhanh, tạo rễ cho Sa Nhân tím, nghiên cứu Sa Nhân tím chăm sóc giai đoạn vườn ươm để hoàn thiện quy trình - Đưa quy trình nhân giống Sa Nhân tím vào thực tế sản xuất quy mô công nghiệp để sản xuất lượng giống lớn cung cấp cho thị trường giống dược liệu 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngô Xuân Bình, Bùi Bảo Hoàn, Nguyễn Thúy Hà (2003), Giáo trình công nghệ sinh học, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Lê Trần Bình, Hồ Hữu nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Nhà xuất nông nghiệp, Hà Nội Võ Văn Chi (1999), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, TP Hồ Chí Minh Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng – Tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật Trịnh Đình Đạt (2009), Công nghệ sinh học (công nghệ di truyền), tập 4, Nhà xuất giáo dục Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam – tập 3, Nhà xuất Trẻ, TP Hồ Chí Minh Hội đồng trưởng (1992) Quy định danh mục thực vật rừng, động vật rừng quý chế độ quản lý, bảo vệ (số 18 – HĐBT ngày 17-1-1992) Hội đồng dược điển Việt Nam III (2002), dược điển Việt Nam III, Nhà xuất Y học, Hà Nội 10 Nguyễn Hoàng Lộc (2006), Giáo trình công nghệ tế bào, Nhà xuất đại học Huế, TP.Huế 11 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học, Hà Nội 12 Đặng Ngọc Phúc, Nguyễn Thanh Tùng, Dương Thị Thùy Châu, Trương Thị Bích Phượng (2011), “ Nhân giống in vitro Sa Nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9(4A), trang 689- 698 41 13 Nguyễn Thanh Phương (2009), Kết nghiên cứu tuyển chọn xuất sứ giống Sa Nhân tím ( Amomum longiligurare T.L.Wu) cho suất cao, chất lượng tốt huyện KBang, tỉnh Gia Lai, Tạp chí KHCN Gia Lai, số năm 2009 ( ISN 1895 – 1442) 14 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng, Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội 15 Nguyễn Tập, cs (2007), Xây dựng mô hình trồng Sa Nhân tím vùng đệm vườn Quốc gia Tam Đảo, Tạp chí Dược liệu, tập 12, số + 16 Nguyễn Tập (2007), “Sa Nhân tím”, Nhà xuất Lao động, Hà Nội 17 Đỗ Thị Hoa Viên, Lê Ngọc Tú , Nguyễn Đức Minh, Ngô Văn Thông (1994), “Nghiên cứu tính kháng khuẩn hạt Sa Nhân”, TC Nông Nghiệp Công nghiệp Thực phẩm 309 (12): 466-467 18 Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 19 Đỗ Năng Vịnh, Trần Văn Minh, Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thị Lý Anh, Đào Duy Thanh, Lê Huy Hàm, Cao Thị Huyền Trang, Hà Thị Thúy, Chu Bá Phúc, Dương Minh Nga, Đỗ Minh Phú, Phạm Thị Kim Hạnh (2006) Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo nhân nhanh số có giá trị kinh tế, Báo cáo tổng kết đề tài KC 04.19:247 285 20 Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội 21 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2006), công nghệ sinh học tập (công nghệ sinh học tế bào), Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội Tiếng Anh 23 Aneja RK, Joshi R (2009), “Antimicrobial activity of Amomum subulatum and Elettaria cardamomum against dental caries causing microorganisms”, Ethnobotanical Leaflets 13: 840- 849 42 24 Haiyan Yu (2002), Reserch on ABT and GGR International Application and Cooperation, China Forestry Publishing House, Beijing 25 Hongdong X, Lei N, Yuchai X (2006), “Tissue culture and rapid propagation of Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire”, Chinese wild plant resources 3:61-63 26 Hong H, Na TL (2005), “Tissue culture plantlet regeneration of Amomum villosum”, plant physiology communications 1: 57 – 61 27 Leong-Skornickova, J., Tran, H.D., Newman, M., Lamxay, V & Bouamanivong, S., 2012, Amomum Longiligulare, IUCN 2013 IUCN Red list of Threatened Species http://www.iucnredlisd.org/details/summary/202212/0, ngày 03/11/2011 28 Li W, Wang JP, Shigematsu M, Lu GZ (2011), “ Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil from Amomum Tsao-Ko cultivated in Yunnan area”, Advanced Materials Research 183:910-914 29 Ping JL (2004), “Micropropagation of Amomum villosum Lour”, Subtropical Plant science 33: 37- 38 30 Rao M, Wenli Z, Fanhua W, Chenghe H (2004), “Tissue Culture of Amomum krervanh”, plant physiology communications 2: 208 – 211 31.Rao M, Wenli Z, Fanhua W, Chunlin Q, Guixiu H (2003), “ In vitro Culture of Amomum Longiligulare T L Wu”, chinese jounal of tropical agriculture 4: – 32 Sajina A, Mini MP, John ZC, Babu NK, Ravindran NP, Rerter VK (1997), “Micropropagation of large cardamom (Amomum subulatum Roxb)”, Journal of Spices and Aromatic Crops (2):145 – 148 33.Tefera W, Wannakrairoj S (2004), “Micropropagation of Krawan (Amomum kerervanh Pierre ex Gagnep)”, Science Asia 30:9 -15 34 Overbeek J Van et al (1944) Coconut Milk used for growth and development of very young Datura embryos, Science,94,pp.350- Phụ lục Kết xử lý số liệu Bảng 4.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch H2O2 đến khả vô trùng mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 20 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMS FILE HUNG 20/5/14 12:12 :PAGE VARIATE V003 TLMS LN SOURCE OF VARIATION DF LN SOURCE OF VARIATION DF LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 8261.11 1652.22 258.61 0.000 R 19.4444 9.72222 1.52 0.265 * RESIDUAL 10 63.8895 6.38895 * TOTAL (CORRECTED) 17 8344.44 490.850 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMN FILE HUNG 20/ 5/14 12:12 :PAGE VARIATE V004 TLMN SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 15427.8 3085.56 383.03 0.000 R 36.1111 18.0556 2.24 0.156 * RESIDUAL 10 80.5566 8.05566 * TOTAL (CORRECTED) 17 15544.4 914.379 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMC FILE HUNG 20/ 5/14 12:12 :PAGE VARIATE V005 TLMC SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 2261.11 452.222 325.60 0.000 R 2.77778 1.38889 1.00 0.404 * RESIDUAL 10 13.8890 1.38890 * TOTAL (CORRECTED) 17 2277.78 133.987 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HUNG 20/ 5/14 12:12 :PAGE MEANS FOR EFFECT T T NOS 3 3 3 TLMS 0.000000 11.6667 21.6667 31.6667 63.3333 48.3333 TLMN 100.000 78.3333 63.3333 43.3333 25.0000 16.6667 TLMC 0.000000 10.0000 15.0000 25.0000 11.6667 35.0000 SE(N= 3) 1.45933 1.63866 0.680416 5%LSD 10DF 4.59841 5.16349 2.14401 MEANS FOR EFFECT R - R NOS 6 TLMS 28.3333 30.8333 29.1667 TLMN 55.8333 52.5000 55.0000 TLMC 15.8333 16.6667 15.8333 SE(N= 6) 1.03190 1.15871 0.481127 5%LSD 10DF 3.25156 3.65114 1.51605 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HUNG 20/ 5/14 12:12 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLMS TLMN TLMC GRAND MEAN (N= 18) NO OBS 18 29.444 18 54.444 18 16.111 STANDARD DEVIATION C OF V |T SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 22.155 2.5276 8.6 0.0000 30.239 2.8382 5.2 0.0000 11.575 1.1785 7.3 0.0000 |R | | | 0.2647 0.1559 0.4038 | | | | Bảng 4.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch HgCl2 đến hiệu khử trùng mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 20 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMS FILE THI 20/ 5/14 11:43 :PAGE VARIATE V003 TLMS LN SOURCE OF VARIATION DF LN SOURCE OF VARIATION DF LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 13373.3 3343.33 573.14 0.000 R 3.33333 1.66666 0.29 0.761 * RESIDUAL 46.6670 5.83338 * TOTAL (CORRECTED) 14 13423.3 958.810 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMN FILE THI 20/5/14 11:43 :PAGE VARIATE V004 TLMN SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 18666.7 4666.67 509.09 0.000 R 10.0000 5.00000 0.55 0.604 * RESIDUAL 73.3332 9.16665 * TOTAL (CORRECTED) 14 18750.0 1339.29 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMC FILE THI 20/ 5/14 11:43 :PAGE VARIATE V005 TLMC SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 1506.67 376.667 226.00 0.000 R 3.33333 1.66667 1.00 0.412 * RESIDUAL 13.3333 1.66666 * TOTAL (CORRECTED) 14 1523.33 108.810 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THI 20/ 5/14 11:43 :PAGE MEANS FOR EFFECT T T NOS 3 3 TLMS 0.000000 13.3333 20.0000 76.6667 63.3333 TLMN 100.000 70.0000 60.0000 13.3333 6.66667 TLMC 0.000000 16.6667 20.0000 10.0000 30.0000 SE(N= 3) 1.39444 1.74801 0.745355 5%LSD 8DF 4.54712 5.70009 2.43053 MEANS FOR EFFECT R R NOS 5 TLMS 35.0000 35.0000 TLMN 49.0000 50.0000 TLMC 16.0000 15.0000 34.0000 51.0000 15.0000 SE(N= 5) 1.08013 1.35401 0.577350 5%LSD 8DF 3.52219 4.41527 1.88268 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THI 20/ 5/14 11:43 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLMS TLMN TLMC GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 34.667 15 50.000 15 15.333 STANDARD DEVIATION C OF V |T SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 30.965 2.4152 7.0 0.0000 36.596 3.0276 6.1 0.0000 10.431 1.2910 8.4 0.0000 |R | | | 0.7612 0.6035 0.4115 | | | | Bảng 4.3 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLBC FILE P4 21/ 5/14 14:27 :PAGE VARIATE V003 TLBC LN SOURCE OF VARIATION DF LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 8859.03 1771.81 684.16 0.000 R 25.9407 12.9704 5.01 0.031 * RESIDUAL 10 25.8976 2.58976 * TOTAL (CORRECTED) 17 8910.87 524.169 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSBC FILE P4 21/ 5/14 14:27 :PAGE VARIATE V004 HSBC SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 4.21718 843436 605.82 0.000 R 447777E-02 223889E-02 1.61 0.248 * RESIDUAL 10 139223E-01 139223E-02 * TOTAL (CORRECTED) 17 4.23558 249152 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE P4 21/ 5/14 14:27 :PAGE MEANS FOR EFFECT T T NOS 3 3 3 TLBC HSBC 0.000000 0.000000 12.2200 0.333333 24.4433 0.700000 40.0000 1.06667 62.2200 1.42333 54.4433 1.09000 SE(N= 3) 0.929114 0.215424E-01 5%LSD 10DF 2.92767 0.678809E-01 MEANS FOR EFFECT R R NOS TLBC 33.8883 HSBC 0.781667 6 31.1100 31.6650 0.746667 0.778333 SE(N= 6) 0.656983 0.152328E-01 5%LSD 10DF 2.07018 0.479991E-01 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE P4 21/ 5/14 14:27 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLBC HSBC GRAND MEAN (N= 18) NO OBS 18 32.221 18 0.76889 STANDARD DEVIATION C OF V |T SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 22.895 1.6093 5.0 0.0000 0.49915 0.37313E-01 4.9 0.0000 |R | | | 0.0309 0.2476 | | | | Bảng 4.4 Ảnh hưởng Kinetin đến khả tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLBC FILE P5 21/ 5/14 14:33 :PAGE VARIATE V003 TLBC LN SOURCE OF VARIATION DF LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 7506.26 1501.25 716.70 0.000 R 60.3729 30.1865 14.41 0.001 * RESIDUAL 10 20.9467 2.09467 * TOTAL (CORRECTED) 17 7587.58 446.328 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSBC FILE P5 21/ 5/14 14:33 :PAGE VARIATE V004 HSBC SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 3.51403 702806 841.13 0.000 R 191111E-02 955554E-03 1.14 0.358 * RESIDUAL 10 835554E-02 835554E-03 * TOTAL (CORRECTED) 17 3.52429 207311 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE P5 21/ 5/14 14:33 :PAGE MEANS FOR EFFECT T T NOS 3 3 3 TLBC HSBC 0.000000 0.000000 10.0000 0.266667 18.8900 0.633333 40.0000 1.30000 62.2200 1.03333 30.0000 0.843333 SE(N= 3) 0.835599 0.166889E-01 5%LSD 10DF 2.63300 0.525872E-01 MEANS FOR EFFECT R R NOS 6 TLBC 28.8867 24.4467 27.2217 HSBC 0.685000 0.665000 0.688333 SE(N= 6) 0.590857 0.118008E-01 5%LSD 10DF 1.86181 0.371848E-01 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE P5 21/ 5/14 14:33 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLBC HSBC GRAND MEAN (N= 18) NO OBS 18 26.852 18 0.67944 STANDARD DEVIATION C OF V |T SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 21.126 1.4473 5.4 0.0000 0.45531 0.28906E-01 4.3 0.0000 |R | | | 0.0012 0.3583 | | | | Bảng 4.5 Ảnh hưởng kết hợp IAA BAP đến hiệu tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLBC FILE NAN 21/ 5/14 16:39 :PAGE VARIATE V003 TLBC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= T 5160.82 1032.16 306.49 0.000 R 25.9633 12.9817 3.85 0.057 10 33.6772 3.36772 * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) 17 5220.46 307.086 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSBC FILE NAN 21/ 5/14 16:39 :PAGE VARIATE V004 HSBC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= T 1.01538 R 214444E-02 107222E-02 * RESIDUAL 203076 125.44 0.000 0.66 0.541 10 161889E-01 161889E-02 * TOTAL (CORRECTED) 17 1.03371 608065E-01 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NAN 21/ 5/14 16:39 :PAGE MEANS FOR EFFECT T - T NOS TLBC HSBC 62.2000 1.42333 67.8000 1.63333 3 82.2000 2.13333 65.5667 1.84333 55.5667 1.73333 26.6667 1.48000 SE(N= 3) 1.05952 0.232299E-01 5%LSD 10DF 3.33857 0.731983E-01 MEANS FOR EFFECT R R NOS TLBC HSBC 61.6667 1.69500 58.8833 1.70667 59.4500 1.72167 SE(N= 6) 0.749191 0.164260E-01 5%LSD 10DF 2.36073 0.517590E-01 - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NAN 21/ 5/14 16:39 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 18) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS 1.8351 TLBC 18 60.000 17.524 HSBC 18 1.7078 0.24659 C OF V |T % 0.40235E-01 |R | | | | | | | | | 3.1 0.0000 0.0568 2.4 0.0000 0.5407 Bản 4.6 Ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến hiệu tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 45 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSBC FILE 00 20/5/14 0:42 :PAGE VARIATE V003 HSBC LN SOURCE OF VARIATION DF LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 1.79891 359782 365.05 0.000 R 194444E-02 972222E-03 0.99 0.408 * RESIDUAL 10 985564E-02 985564E-03 * TOTAL (CORRECTED) 17 1.81071 106512 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLBC FILE 00 20/5/14 0:42 :PAGE VARIATE V004 TLBC SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= T 5002.32 1000.46 75.95 0.000 R 15.9144 7.95722 0.60 0.569 * RESIDUAL 10 131.726 13.1726 * TOTAL (CORRECTED) 17 5149.96 302.939 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 00 20/ 5/14 0:42 :PAGE MEANS FOR EFFECT T T NOS 3 3 3 HSBC 1.39000 2.03333 1.73333 1.54667 1.22000 1.09000 TLBC 56.6667 76.6667 81.1333 60.0000 50.0000 31.1000 SE(N= 3) 0.181252E-01 2.09544 5%LSD 10DF 0.571130E-01 6.60280 MEANS FOR EFFECT R R NOS 6 HSBC 1.50500 1.51333 1.48833 TLBC 58.3333 58.9000 60.5500 SE(N= 6) 0.128164E-01 1.48170 5%LSD 10DF 0.403850E-01 4.66888 -2 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 00 20/5/14 0:42 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE HSBC TLBC GRAND MEAN (N= 18) NO OBS 18 1.5022 18 59.261 STANDARD DEVIATION C OF V |T SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.32636 0.31394E-01 2.1 0.0000 17.405 3.6294 6.1 0.0000 |R | | | 0.4085 0.5694 | | | | Bảng Môi trường MS - Murashige and Skoog’s Nhóm I II III IV V Thành phần Hàm lượng (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO4 7H2O 370 MnSO4 H2O 22.3 ZnSO4 7H2O 10.6 CuSO4 H2O 0.025 CaCl2 2H2O 440 KI 0.83 CoCl2 6H2O 0.025 H3BO3 6.2 Na2MoO4 2H2O 0,25 FeSO4 7H2O 27.85 Na2EDTA 2H2O 37.25 Nicotinic acid 0,5 Glycine Thiamine HCl 0,1 Pyridoxine HCl 0,5 Vitamins [...]... chồi Sa Nhân t m (Amomum longilgulare T. L. Wu) 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 3.4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng m t số ch t khử trùng (HgCl2, H2O2) đến khả năng vô trùng mẫu Sa Nhân t m (Amomum longilgulare T. L. Wu) Giai đoạn t o v t liệu khởi đầu - V t liệu khử trùng: Đỉnh sinh trưởng, mầm ngủ t củ cây Sa Nhân t m (Amomum longilgulare T. L. Wu) - Phương pháp xử l mẫu: + Cây Sa Nhân T m con được rửa sạch bằng. .. Kinetin đến hiệu quả t i sinh chồi Sa Nhân T m (Amomum longilgulare T. L. Wu) Công thức thí Nồng độ (mg /l) Nồng độ IAA CT1(Đ/C) CT* 0,0 CT2 CT* 0,1 CT3 CT* 0,2 CT4 CT* 0,3 CT5 CT* 0,4 CT6 CT* 0,5 nghiệm Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự k t hợp giữa BAP hoặc Kinetin và IBA đến hiệu quả t i sinh chồi Sa Nhân T m (Amomum longilgulare T. L. Wu) Công thức thí nghiệm Nồng độ (mg /l) Nồng độ IBA CT1 CT*... Haberlandt, đã tiến hành nuôi cấy các t bào thực v t để chứng minh t bào l toàn năng Haberlandt cho rằng mỗi t bào của b t kỳ sinh v t nào cũng đều có khả năng tiềm t ng để ph t triển thành m t cơ thể hoàn chỉnh Ông nhận thấy, mỗi t bào của cơ thể đa bào đều ph t sinh t hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm Điều đó có nghĩa l mỗi t bào của m t sinh v t sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền... hóa t bào Cơ thể thực v t hình thành l m t chính thể thống nh t bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành t nhiều loại t bào khác nhau Tuy nhiên t t cả các loại t bào đó đều b t nguồn t m t tế bào đầu tiên (t bào hợp t ) Ở giai đoạn đầu, t bào hợp t tiếp t c phân chia hình thành nhiều t bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng bi t (chuyên hóa) Sau đó, t các t bào 10 phôi sinh. .. + 15 ph t CT5 HgCl2 0,1% + 20 ph t 3.4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của m t số ch t kích thích sinh trưởng (BAP, IBA, IAA, Kinetin) đến khả năng t i sinh của chồi Sa Nhân T m (Amomum longilgulare T. L. Wu) Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng t i sinh chồi Sa Nhân T m (Amomum longilgulare T. L. Wu) Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 6 công thức, mỗi... vi nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa ch t khử trùng (H2O2, HgCl2) và thời gian khử trùng đến khả năng vô trùng mẫu Sa Nhân T m (Amomum longilgulare T. L. Wu) - Nghiên cứu m t số ch t kích thích sinh trưởng (BAP, IBA, IAA, Kinetin) đến giai đoạn t i sinh giống Sa Nhân t m (Amomum longilgulare T. L. Wu) 3.2 Địa điểm, thời gian và điều kiện nghiên cứu 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu - Phòng thí nghiệm nuôi. .. m t khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các t bào xung quanh Khi t ch riêng t ng t bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ t o điều kiện cho sự ho t hóa các gen của t bào [5] 11 2.2.4 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô t bào thực v t Môi trường nuôi cấy l điều kiện t i cần thi t, yếu t quy t định cho sự phân hoá t bào và cơ quan nuôi cấy 2.2.4.1 Điều kiện nuôi cấy mô t bào thực v t Điều... cảnh thích hợp để cây có thể đ t tỷ l sống cao trong vườn ươm cũng như trong sản xu t 18 PHẦN 3 ĐỐI T ỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối t ợng và phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Đối t ợng V t liệu nghiên cứu l mẫu xử l t đỉnh sinh trưởng, mầm ngủ t củ của cây Sa Nhân T m (Amomum longilgulare T. L. Wu) t đỉnh sinh trưởng t t, cho năng su t cao, không sâu bệnh, được thu thập t i t nh Thái... dinh dưỡng nhân t o, trong điều kiện vô trùng Kỹ thu t nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xu t sinh 9 khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh thực v t, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý….[10] 2.2.2 T nh toàn năng (Totipotence) của t bào Nguyên l cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô t bào l t nh toàn năng của t bào thực v t Năm 1902, Nhà Sinh L thực v t học người... - Kiểm tra độ biến động của thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV% 26 PHẦN 4 K T QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng m t số ch t khử trùng đến khả năng vô trùng mẫu Sa Nhân T m (Amomum Longilgulare T. L. Wu) 4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch H2O2 (5%) đến khả năng vô trùng mẫu Sa Nhân T m (Amomum longilgulare T. L. Wu) Khử trùng v t liệu nuôi cấy l giai ... trữ giống Xuất phát từ sở trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu tái sinh giống Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) phương pháp nuôi cấy mô tế bào ’ 2 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên. .. học Sa Nhân Tím 2.1.3 Công dụng Sa Nhân Tím 2.1.4 Tình hình nghiên cứu nhân giống Sa Nhân Tím giới Việt Nam 2.1.4.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống Sa Nhân Tím nuôi cấy. .. mẫu Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau 20 ngày nuôi cấy) 28 Bảng 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến khả tái sinh chồi Sa Nhân Tím (Amomum longilgulare T.L.Wu) (sau