Nghiên cứu nhân giống cây hà thủ ô đỏ polygonum multiflorum thunb bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Kết quả ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tạo chồi cây Hà thủ ô đỏ sau 20 ngày nuôi cấy .... - Xác định được ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tạo chồi của cây Hà t

NGUYỄN ĐỨC QUANG

Tên đề tài

NGHIÊN CỬU NHÂN GIỐNG CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ

(Polygonum multiflorum Thunb) BẰNG PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa : 2012 – 2016

Thái Nguyên, 2016

NGUYỄN ĐỨC QUANG

Tên đề tài

NGHIÊN CỬU NHÂN GIỐNG CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ

(Polygonum multiflorum Thunb) BẰNG PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa : 2012 – 2016 Người hướng dẫn: 1 PGS.TS Ngô Xuân Bình

2 Th.S Nguyễn Thị Tình

Thái Nguyên, 2016

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực tập tại viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm Nghiệp phía bắc, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ ban lãnh đạo, thầy cô hướng dẫn, bạn bè, gia đình

Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Ngô Xuân Bình và cô Th.S Nguyễn Thị Tình đã tận tình chỉ bảo trong suốt thời gian thực tập

Tôi xin chân thành cảm ơn chị Phạm Thị Thảo, cán bộ kỹ thuật phòng thí nghiệm cùng các bạn cùng thực tập đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn đến thầy cô trong khoa CNSH & CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ trong suôt quá trình học tập

và hoàn thành khoá luận này

Và cuối cùng tôi chân thành cảm ơn đến sự quan tâm sâu sắc từ gia đình, bạn

bè, đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khoá luận

Thái Nguyên, ngày 27 tháng 5 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đức Quang

LSD : Least Significant Difference

MS : Murashige and Skoog’s

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Tỷ lệ emodin và physcion 6

Bảng 2.2 Một số công trình NCKH về cây Hà thủ ô đỏ 18

Bảng 4.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch

HgCl2 0,1% đến khả năng tiêu diệt nấm và vi khuẩn (sau 7 ngày cấy) 29

Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng

tạo chồi cây Hà thủ ô đỏ (sau 20 ngày nuôi cấy) 31

Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng của tổ hợp BA + NAA đến khả năng

nhân nhanh chồi cây Hà thủ ô đỏ (sau 30 ngày nuôi cấy) 32

Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của tổ hợp BA + NAA + Kin đến khả năng

nhân nhanh chồi cây Hà thủ ô đỏ (sau 30 ngày nuôi cấy) 34

Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra

rễ cây Hà thủ ô đỏ (sau 25 ngày nuôi cấy) 36

Bảng 4.6 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ

cây Hà thủ ô đỏ (sau 25 ngày nuôi cấy) 37

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây Hà thủ ô đỏ 3

Hình 2.2 Hình ảnh của một số sản phẩm từ Hà thủ ô đỏ 20

Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng

dung dịch HgCl2 0,1% đến khả năng tiêu diệt nấm và vi khuẩn 30

Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của một số môi trường đến

khả năng tạo chồi cây Hà thủ ô đỏ 31

Hình 4.3 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BA + NAA đến

khả năng nhân nhanh chồi cây Hà thủ ô đỏ 33

Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của tổ hợp BA + NAA + Kin đến

khả năng nhân nhanh chồi cây Hà thủ ô đỏ 34

Hình 4.5 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng

ra rễ cây Hà thủ ô đỏ 36

Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ cây Hà thủ ô đỏ 38

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

MỤC LỤC v

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu nghiên cứu 2

1.2.1 Mục đích nghiên cứu 2

1.2.2 Yêu cầu nghiên cứu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về cây Hà thủ ô đỏ 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái 3

2.1.3 Tác dụng dược lý 4

2.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

2.2.1 Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào 7

2.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 7

2.2.3 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

2.2.3.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

2.2.3.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.3 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào 13

2.3.1 Giai đoạn chuẩn bị 13

2.3.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy 13

2.3.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi 14

2.3.4 Tạo cây hoàn chỉnh 14

2.3.5 Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên 15

2.4 Những vấn đề trong nuôi cấy mô 15

2.4.1 Sự tạp nhiễm 15

2.4.2 Tính bất định về mặt di truyền 16

2.4.3 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy 17

2.4.4 Hiện tượng thuỷ tinh thể 17

2.5 Tình hình nghiên cứu, sản xuất cây Hà thủ ô đỏ ở Việt Nam và trên thế giới 18

2.5.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất cây Hà thủ ô đỏ ở Việt Nam 18

2.5.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất cây Hà thủ ô đỏ trên thế giới 20

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 22

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 22

3.3 Hóa chất và thiết bị sử dụng 22

3.3.1 Hóa chất 22

3.3.2 Thiết bị sử dụng 22

3.4 Điều kiện nghiên cứu 23

3.5 Nội dung nghiên cứu 23

3.6 Phương pháp nghiên cứu 23

3.6.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 23

3.6.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 23

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1%

đến khả năng tiêu diệt nấm và vi khuẩn 29

4.2 Kết quả ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tạo chồi

của cây Hà thủ ô đỏ 31

4.3 Kết quả ảnh hưởng của BA, Kin, NAA đến khả nhân nhanh chồi

cây Hà thủ ô 32

4.3.1 Kết quả ảnh hưởng của tổ hợp BA + NAA đến khả năng

nhân nhanh chồi cây Hà thủ ô đỏ 32

4.3.2 Kết quả ảnh hưởng của tổ hợp BA + NAA + Kin đến khả năng

nhân nhanh chồi cây Hà thủ ô đỏ 34

4.4 Kết quả ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng

ra rễ cây Hà thủ ô đỏ 35

4.4.1 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây Hà thủ ô đỏ 36

4.4.2 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ cây Hà thủ ô đỏ 37

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

5.1 Kết luận 39

5.2 Đề nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC 1 43

PHỤ LUC 2 46

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Thảo dược là một nguồn nguyên liệu thực vật quý giá, cung cấp dược liệu để sản xuất và chế biến các loại thuốc hữu ích phục vụ cho việc chữa bệnh và phục hồi sức khỏe cho con người Hà thủ ô đỏ được tìm thấy ở Trung Quốc vào năm 713 và được sử dụng như một loại thảo dược trường sinh của con người Trên thế giới Hà thủ ô đỏ có nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan và Ấn Độ Ở Việt Nam Hà thủ ô đỏ mọc hoang từ các tỉnh miền núi từ Nghệ An trở ra, có nhiều ở Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, một số tỉnh khác như Cao Bằng, Lạng Sơn, Hoà Bình

có số lượng ít hơn [6] Hà thủ ô đỏ chủ yếu được biết đến như vị thuốc bổ, trị suy nhược thần kinh, ích huyết, khoẻ gân cốt, đen râu tóc Theo y học cổ truyền, Hà thủ

ô có vị đắng chát, hơi ngọt, tính ấm, có tác dụng bổ gan thận, ích tinh huyết, mạnh gân xương, nhuận tràng Được dùng để bổ máu, chữa thận suy, gan yếu, thần kinh suy nhược, thiểu năng tuần hoàn, ngủ kém, đau lưng mỏi gối, khô khát táo bón Trong củ Hà thủ ô đỏ có chứa nhiều chất quan trọng như emodin, chrysophanol, rhein, physcion, tinh bột, lipit…Trong tự nhiên Hà thủ ô đỏ có thể gây trồng bằng hạt hay bằng dây, sau 3-4 năm thì thu hoạch, lấy củ rửa sạch, bổ thành miếng phơi khô để làm thuốc Lá có thể dùng làm rau, dây lá cũng có thể dùng làm thuốc [2] Theo Chang Lin (2003) cây Hà thủ ô đỏ được nuôi trồng trong nhà kính sẽ cho tỉ lệ các chất emodin và physcion cao hơn cây ở ngoài tự nhiên [15] Trước đây nguồn Hà thủ ô đỏ ở nước ta khá dồi dào nhưng gần đây do khai thác quá mức và nạn phá rừng nên lượng Hà thủ ô đỏ bị giảm sút nghiêm trọng, không cung cấp đủ nguồn dược liệu cho việc chế biến và sản xuất thuốc chữa bệnh cho người dân Do đó, việc nhân nhanh số lượng cây Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp nuôi cây mô tế bào thực vật để đáp ứng cung cấp nguồn dược liệu là hết sức cần thiết Xuất phát từ thực tế trên, để góp phần vào công tác nhân giống cũng như việc nhân nhanh cây Hà thủ ô đỏ nhằm nâng cao năng suất, chất lượng, và hiệu quả sản xuất,

chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu nhân giống cây Hà thủ ô đỏ

(Polygonum multiflorum Thunb) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ”

1.2 Mục đích và yêu cầu nghiên cứu

1.2.1 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu nhân giống cây Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb)

bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.2 Yêu cầu nghiên cứu

- Xác định được ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2

0,1% đến khả năng diệt nấm và vi khuẩn

- Xác định được ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tạo chồi của cây Hà thủ ô đỏ

- Xác định được ảnh hưởng của BA, Kin, NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Hà thủ ô đỏ

- Xác định được ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra rễ cây Hà thủ ô đỏ

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của giống Hà

thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb) tại phòng thí nghiệm

- Là tài liệu tham khảo thêm cho việc nghiên cứu và sản xuất tại các cơ sở

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây Hà thủ ô đỏ

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora, đồng nghĩa: Polygonum multiflorum Thunb)

Theo hệ thống học thực vật mới nhất, cây Hà thủ ô đỏ được phân loại như sau:

- Nghành (Division): Magnoliophita

- Lớp (Class): Eudicots

- Bộ (Ordo): Caryophyllales

- Họ (Familia): Polygonaceae

- Chi (Genus): Fallopia

- Loài (Species): Fallopia multiflora

Tên gọi khác cây Hà thủ ô đỏ: Dạ giao đằng, Mã ôn, Khua lình (Thái ), Mán năng ón (Tày thổ) [7]

Trên thế giới Hà thủ ô đỏ phân bố nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan…Ở Việt Nam, chúng thường mọc hoang ở rừng núi, nhiều đất ở Tây Bắc, Lai Châu, Lào Cai hay ở vùng thấp như Sài Sơn (Sơn Tây) hoặc ở Thanh Hoá, Nghệ - Tĩnh đều có [7]

nguyên hoặc hơi lượn sóng, cả hai mặt đều nhăn Bẹ chìa mỏng, màu nâu nhạt, ôm lấy thân Hoa tự chùm nhiều nhánh Hoa nhỏ, đường kính 2mm, mọc cách xa nhau,

ở kẽ những lá bắc ngắn, mỏng Bao hoa màu trắng, 8 nhuỵ (trong số đó có 3 nhuỵ hơi dài hơn) Bầu hoa có 3 cạnh, 3 vòi ngắn rời nhau Đầu nhuỵ hình mào gà rủ xuống Quả 3 góc, nhẵn bóng, đựng trong bao hoa còn lại, 3 bộ phận ngoài của bao hoa phát triển thành cánh rộng, mỏng, nguyên [2]

2.1.3 Tác dụng dược lý

Theo Đông y hà thủ ô vị đắng ngọt chát, tính hơi ôn; vào các kinh can và thận

Có tác dụng bổ can thận, dưỡng huyết, bổ âm, giải độc, nhuận tràng thông tiện Dùng cho các trường hợp can thận âm hư, huyết hư, đau đầu hoa mắt chóng mặt, đau lưng mỏi gối ù tai điếc tai, râu tóc bạc sớm, di tinh, huyết trắng, táo bón, hội chứng lỵ mạn tính, trĩ xuất huyết, sốt rét, lao hạch, bệnh mạch vành, tăng huyết áp, tăng mỡ huyết, xơ vữa động mạch Râu tóc có mối quan hệ mật thiết với tạng thận Thận tàng tinh, tinh sinh huyết Tóc, râu là phần thừa của huyết cho nên nếu thận

hư, yếu thì râu, tóc không được nuôi dưỡng đầy đủ sẽ sớm bạc trắng và rụng Hà thủ

ô có công dụng bồi bổ can thận, dưỡng huyết tư tâm, bởi vậy khả năng làm đen râu, tóc Ngoài ra, thận tinh sung túc thì sự phát triển của cơ thể diễn ra thuận lợi, năng lực tính dục được khôi phục và nâng cao nên dễ sinh con Sự già yếu của con người cũng do quá trình suy giảm của thận tinh quyết định, bởi vậy việc sử dụng Hà thủ ô lâu dài để bổ ích thận tinh cũng có tác dụng kéo dài tuổi thọ [1]

Theo các kết quả nghiên cứu hiện đại cho thấy, Hà thủ ô có tác dụng dược lý khá phong phú như giúp đẩy lui tuổi già, tăng trí nhớ, ngừa bệnh Alhzeimer, bệnh Parkinson, trị mất ngủ, mệt mỏi, giúp tóc lâu bạc, kháng khuẩn, trị bệnh ngoài da, giảm cholesterol LDL, tăng cholesterol HDL, giảm triglyxerit, hạ đường huyết, giúp ngăn ngừa tình trạng vữa xơ động mạch, bảo vệ tế bào gan, thúc đẩy quá trình sản sinh hồng cầu, nâng cao khả năng miễn dịch, cải thiện hoạt động của hệ thống các tuyến nội tiết, đặc biệt là tuyến thượng thận và giáp trạng Ngoài ra, hà thủ ô còn có tác dụng kháng khuẩn, nâng cao khả năng chống rét của cơ thể, nhuận tràng và giải độc [10]

Lexitin là một photphatit được tạo thành từ sự kết hợp giữa axit glyxerophotphorit với một phân tử cholin và hai axit béo Trong Hà thủ ô đỏ lexitin chiếm một lượng nhỏ nhưng nó là thành phần quan trọng tham gia tích cực tới quá trình quan trọng trong hoạt động sống Theo một công trình nghiên cứu ở đại học Hamburg, Cộng hòa liên bang Đức, lượng chất béo trong mỡ giảm thiểu rõ rệt ở người được điều trị hỗ trợ với lexitin trong 4 tuần liên tục Nó giúp việc chuyển hóa

mỡ và phân hủy chất béo, chất xơ cứng động mạch trong cơ thể cũng như trong mạch máu (cholesteron) Lexitin rất quan trọng để giữ cho lượng Cholesteron ở dạng hòa tan trong mật và giúp ngăn ngừa hiện tượng sỏi mật Lexitin rất quan trọng trong việc giữ cho hệ thần kinh luôn khỏe mạnh, nó luôn có ở vỏ bọc dây thần kinh Các thành phần cơ bản của lexitin, cholin rất cần thiết gây tác động từ tế bào thần kinh này sang tế bào thần kinh khác cải thiện hệ thần kinh Trong thí nghiệm tiến hành trên cơ thể thỏ người ta ghi nhận: Lecitin làm tăng huyết dịch và trợ tim rất đặc hiệu, giảm cholesteron trong máu, ngăn ngừa các bệnh lý về tim mạch giúp hạn chế rụng tóc Theo một số nhà nghiên cứu trong thành phần của lexitin có nhóm chức inositol là nhân tố kích thích sinh trưởng và giải độc tố Dựa vào tác dụng giải độc của lexitin, nhiều nhà điều trị đã từ lâu áp dụng chất này trong phác đồ điều trị cho những người bị gan nhiễm mỡ Hơn nữa lexitin có tác dụng tăng cường quá trình hấp thụ các chất béo, cân bằng omega Nó có khả năng chống oxi hóa giúp ngăn chặn quá trình phân hủy chất béo [5]

Thành phần hoá học: Thân rễ Hà thủ ô chứa antranoid, trong đó có emodin, chrysophanol, rhein, physcion; protid, tinh bột, lipid, lecitin, rhaponticin (rhapontin, ponticin) 2,3,5,4 tetrahydroxytibene -2-O-b-D-glucoside Tanin… Trong tự nhiên,

Hà thủ ô đỏ được trồng bằng cách giâm cành hoặc trồng bằng hạt Vấn đề gặp phải với phương pháp nhân giống truyền thống đối với cây Hà thủ ô đỏ là khả năng nảy mầm hạt lâu, tỷ lệ sống thấp còn phương pháp giâm cành tạo ra cây con có tuổi thọ

ngắn Và Chang Lin (2003) đã xác định các cây Hà thủ ô đỏ có nguồn gốc in vitro

sẽ cho tỉ lệ các chất emodin và physcion cao hơn so với cây ngoài tự nhiên [15]

Bảng 2.1: Tỷ lệ emodin và physcion

Sản phẩm Hà thủ ô đỏ Hàm lượng Emodin

(mg/g sấy khô)

Hàm lượng Physcion (mg/g sấy khô) Phần thân ngoài tự nhiên 0 075±0 000 0 078±0 00 Phần rễ ngoài tự nhiên 0 077±0 002 0 084±0 001

Phần chồi nhân giống in vitro 0 381±0 060 0 277±0 044

Cây trong nhà kính sau in vitro 0 392±0 060 0 413±0 064 Theo như bảng số liệu trên, nhân giống cây Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật rất hiệu quả và phù hợp

2.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm

80 của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân giống vô

tính in vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh, bảo quản nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo…[7]

Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng

khác nhau như: cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh, cây dược liệu…

Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn nhưng hiện nay đã bị chặt phá do nhiều nguyên nhân khác nhau Góp phần vào cung cấp nguồn giống cây rừng phục vụ cho công tác phủ xanh đất trống, đồi núi trọc của nhà nước ta, hàng loạt

quy trình nhân giống in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu nhằm tạo ra

lượng lớn cây giống có chất lượng tốt

Thuật ngữ nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất

cả các loại nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên

môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng [8] Cho đến nay, nuôi cấy mô tế

bào thực vật được xem giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh học nói chung Trên môi trường nhân tạo, từ các mô hoặc các cơ quan thực vật ban

đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểm sinh học giống hệt nhau

2.2.1 Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902 Haberlandt lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào [9]

2.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau

Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh

để thực hiện chức năng phân chia

Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng

2.2.3 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự

phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy

2.2.3.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

a) Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm bảo

điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm

Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro [11]

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao Thông thường hay sử dụng một số hoá chất như: cồn 700, NaOCl, Ca(OCl)2, HgCl2 0,1% … để

Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy

Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000 lux, ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật

in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng

trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 – 40 cm

- Nhiệt độ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây Tuỳ thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhìn chung nhiệt

độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±20

C [9]

- pH

pH của môi trường là một yếu tố quan trọng Sự ổn định của pH môi trường

là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào pH của đa số môi trường được điều chỉnh giữa 5,5-6 trước khi hấp khử trùng pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng [12],13

2.2.3.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy mô đều gồm các thành phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng vi lượng, đường làm nguồn cacbon, cac vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA, ) và một

số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch trích nấm men…

a) Nước

Cần đặc biệt chú ý đến thành phần này vì nước chiếm đến 95% môi trường dinh dưỡng Nên sử dụng nước cất khi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu Nếu môi trường chuẩn bị nuôi cấy protoplast, tế bào hay meristem thì nên dùng nước cất 2 lần Hoàn toàn không nên sử dụng nước máy trong nuôi cấy mô Trong trường hợp không có sẵn cũng chỉ nên sử dụng nước khử ion, mặc dầu nước này vẫn có thể chứa nguồn lây nhiễm hữu cơ và các loài vi khuẩn [9]

b) Dinh dưỡng vô cơ

Dinh dưỡng vô cơ được chia ra làm 2 loại: các nguyên tố dinh dưỡng đa lượng và nguyên tố dinh dưỡng vi lượng Theo thống nhất của Hội sinh lí học thực vật quốc tế (IAPP), nguyên tố khoáng mà thực vật cần với nồng độ lớn hơn 0,5 mmol/l gọi là nguyên tố đa lượng, nguyên tố khoáng mà thực vật cần có nồng

độ nhỏ hơn 0,5 mmol được gọi là nguyên tố vi lượng Nguyên tố khoáng là nhu cầu rất cần thiết đối với nuôi cấy mô thực vật Giống như cây trồng ngoài tự

nhiên các mô và cơ thể thực vật khi nuôi cấy trong ống nghiệm trên môi trường nhân tạo chúng cần được cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển Trong tự nhiên cây trồng muốn sinh trưởng và phát triển mạnh thì cần phải lấy từ đất các nguyên tố sau [9]:

- Các nguyên tố đa lượng: các ion của nitơ (N), photpho (P), kali (K), canxi (Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S)

- Các nguyên tố vi lượng: sắt (Fe), niken (Ni), clo (Cl), mangan (Mn), kẽm (Zn), bo (B), đồng (Cu), và molipden (Mo)

Mười bốn nguyên tố trên cùng với cacbon, oxy, hidro được xem là các nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu của thực vật

Nhu cầu của mô thực vật nuôi cấy đối với nguyên tố dinh dưỡng khoáng khác nhau so với thực vật ngoài đồng ruộng Hệ rễ thực vật lấy dinh dưỡng từ đất chủ yếu theo phương thức hấp thu chủ động, còn mô nuôi cấy dinh dưỡng khoáng từ môi trường theo phương thức hấp thu bị động là chính Theo nguyên tắc thành phần môi trường nuôi cấy sẽ được xây dựng trên thành phần các nguyên tố dinh dưỡng có mặt trong mô Môi trường nhân tạo sử dụng phổ biến nhất thường được sử dụng trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật là môi trường MS (Murashige và Skoog (1962) cũng được thiết lập dựa trên nguyên tắc này [9]

c) Đường

Đường là thành phần quan trọng trong tất cả các môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật Đường cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển vì quá trình quang hợp của mô hoặc cây nuôi cấy là không đủ cho sự sinh trưởng của chúng được đặt trong điều kiện không thích hợp cho quang hợp hay thậm chí hoàn toàn không có quang hợp (nuôi cấy trong bóng tối) Các mô có màu xanh

cũng không đủ khả năng để tự dưỡng in vitro Mặt khác, quá trình quang hợp

cũng bị hạn chế ở nồng độ CO2 trong bình cấy Trên thực tế việc bổ sung CO2 là rất khó khăn và tốn kém

Đường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật là đường saccharose ở nồng độ 1-5% Đường saccharose là dạng đường được tổng hợp và

vận chuyển tự nhiên trong cây nên rất thuận lợi cho các mô nuôi cấy Cũng có thể sử dụng đường glucose hoặc fructose trong nuôi cấy mô thực vật Nồng độ đường sử dụng phụ thuộc vào loại và tuổi mẫu cấy [9]

d) Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Đại

đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng số lượng thấp, có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vitamin B1), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy

e) Agar

Agar là một loại polysacharit của tảo Agar là chất keo đông thường được

sử dụng nhất, nguồn gốc chủ yếu của nó là rong biển đỏ, là một phức chất polysacharit do đường saccloze và galactose tạo thành Nồng độ của thạch dùng trong nuôi cấy rất dao động tùy theo độ tinh khiết của hóa chất và mục tiêu nuôi cấy (thường 4-12 g/l, trung bình 6-12 g/l) nếu nồng độ quá cao môi trường dinh dưỡng sẽ rất cứng chất dinh dưỡng khó khuếch tán để nuôi dưỡng mô cấy Ở

800C thì ngậm nước chuyển sang trạng thái sol còn ở 400C thì trở về trạng thái gel Khả năng ngậm nước của thạch khá cao: 6-12 gam/lít nước Thạch ở dạng gel nhưng vẫn để cho các ion vận chuyển dễ dàng [9]

f) Chất điều hoà sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật nuôi cấy mô Hiệu quả tác động của nó phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng, mẫu nuôi cấy và hoạt tính vốn có của nó [9]

Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính auxin và cytokinin, ngoài ra còn có gibberlin và etylen cũng là nhóm chất tham gia điều tiết sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan

Auxin: Auxin được chia thành 2 loại: auxin tự nhiên và auxin tổng hợp

Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3- acid acetic (IAA) và auxin tổng hợp là indole-3-butylric acid (IBA), 2,4-diclorophenolxy acetic acid (2,4-D), 1-napthalene acetic acid (NAA) Hoạt tính của các chất điều tiết sinh trưởng này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4-D IAA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng do đó không ổn đinh trong môi trường nuôi cấy mô NAA và 2,4-D không bị biến tính trong quá trình hấp tiệt trùng Tuy nhiên chất 2,4-D là chất dễ gây độc nhưng có

tác dụng rất nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus

Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, nhóm auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính Tùy loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy

mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay hình thành mô sẹo (callus) Nồng độ auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1- 2mg/l tùy từng chất và đối tượng nuôi cấy

Cytokinin: Nhóm chất cytokinin kích thích sự phân chia tế bào và quyết

định sự phân hóa chồi Tỉ lệ auxin/cytokinin quyết định sự phân hóa của mô theo hướng tạo rễ, chồi hay mô sẹo Nồng độ sử dụng là 0,1-2mg/l Ở nồng độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng

thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy

Các cytokinin thường được sử dụng là Benzyladenin (BA) hay Benzyl amino purin (BAP), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2 iP) và Zeatin (cytokinin tự nhiên) Trong các chất này, BAP và sau đó kinetin được dùng phổ biến nhất vì

có hoạt tính cao và giá không đắt Zeatin làmột loại cytokinin tự nhiên có hoạt tính rất mạnh chỉ dùng trong những trường hợp đặc biệt do rất đắt Trong nhiều trường hợp, người ta còn sử dụng một số chất cytokinin khác như Diphenylurea, Thidiazuron (TDZ) trong đó TDZ là một cytokinin có hoạt tính cao thường dùng trong nuôi cấy nhân nhanh cây thân gỗ

g) Than hoạt tính

Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc Than hoạt tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol… trong trường hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi

có nó vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ Than hoạt tính còn là một trong những chất chống oxy hóa tốt Nhìn chung nó có ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường

2.3 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm 5 giai đoạn [16], [18]

2.3.1 Giai đoạn chuẩn bị

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro Mục đích là phải tạo được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy Có

thể vô trùng mẫu nuôi cấy bằng một số chất có tác dụng diệt khuẩn như: CaOCl2, NaOCl, HgCl2,…

Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo: Tỷ lệ nhiễm thấp; tỷ lệ sống cao; tốc độ sinh trưởng nhanh Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, đoạn thân…

Sharma G.J (2005) [22] đã dùng cồn 70% để khử trùng bề mặt thân rễ cây địa liền và cây ngải máu Sau đó, sử dụng NaClO 1% hoặc HgCl2 0,2% trong 15 phút để diệt nấm và vi khuẩn bám trên mẫu Dương Tấn Nhựt và cs (2011) [19] tiến hành khử trùng lá cây Sâm Ngọc Linh bằng Cồn 70% trong 30 giây và HgCl2 trong 5 phút thu được tỷ lệ mẫu sạch cao

2.3.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần

đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại sinh trưởng tốt Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của mô

nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy Behera K.K và cs (2010) [14] sử dụng BAP 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l để cảm ứng chồi cây nghệ vàng Tuy nhiên bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi cấy Thường các mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những mô

đã chuyển hoá

2.3.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất Chính vì thế giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy Để tăng hệ số người

ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin,…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm mem,…, kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp Chế độ nuôi cấy thường là 25-27ºC, có 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux Tuỳ thuộc vào đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính Jala A và cs (2012) [17] nghiên cứu trên cây Giảo cổ lam cho thấy khi kết hợp BA 1 mg/l và NAA 0,1 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,8 chồi/mẫu sau 80 ngày nuôi cấy

2.3.4 Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi trường

ra rễ Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoại này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2.4-

D được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi Nguyễn Thị Liễu

và cs (2011) [8] đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng tạo

rễ bất định sâm Ngọc Linh cho thấy nồng độ tốt nhất cho sự hình thành rễ bất

định sâm Ngọc Linh là 2,4-D 1,0 mg/l trong môi trường MS bổ sung sucrose 50 mg/l

2.3.5 Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng

dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất Là giai đoạn

chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất Sen A và cs (2010) [20] khi

chuyển cây nghệ in vitro sang đất vườn và cát với tỷ lệ 1:1 cho kết quả 93% cây

vi giống sinh trưởng và phát triển bình thường trong môi trường tự nhiên

Shahinozzaman M (2013) [21] chuyển cây con tái sinh in vitro sang chậu nhựa

có chứa hỗn hợp đất vườn và phân ủ với tỷ lệ 1:1 và được làm thích nghi Kết

quả cho thấy cây con in vitro cho tỷ lệ sống cao

Theo Goer (1993) để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:

- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá,

số rễ, chiều cao cây)

- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước

- Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp

2.4 Những vấn đề trong nuôi cấy mô

2.4.1 Sự tạp nhiễm

Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến quá trình nuôi cấy Một số nguồn gây tạp nhiễm như từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình nuôi cấy, từ môi trường, dụng cụ và các máy móc thiết bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thống không khí trong phòng cấy [4] Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đây cũng được xem là giai đoạn khó nhất trong vi nhân giống Mẫu cấy có thể là đốt thân, đỉnh sinh trưởng, mẫu lá hay rễ non Tuy nhiên, để mẫu sống và phát triển trong điều kiện vô

trùng thì không phải dễ Môi trường bên ngoài luôn có rất nhiều vi sinh vật bám trên

bề mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp vầy của cây mẹ, đây là nơi cư ngụ khá vững chắc mà chất khử trùng không dễ tiếp xúc được chúng Đặc biệt, vi khuẩn thường nhiễm vào hệ thống mô mạch và gây nhiễm môi trường sau một tuần nuôi cấy Nhiễm khuẩn trong trường hợp này thường gây những vệt trắng sữa xuất phát từ mô cấy và quan sát rõ nhất khi xem từ dưới đáy chai nuôi cấy Vài loài vi khuẩn thường

gây nhiễm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas

Điều kiện trồng cây mẹ và vị trí lấy mẫu từ cây mẹ là yếu tố quan trọng thiết lập quá trình nuôi cấy sạch Cây trồng trong nhà kính ít nhiễm vi sinh vật hơn ngoài đồng ruộng Các bộ phận như rễ, củ, thân thì thường khó làm sạch hơn các bộ phận khác Môi trường không khí, trong phòng, phòng cấy gây nhiễm nghiêm trọng nếu không được xử lý kịp thời, nấm thường là nguyên nhân gây nhiễm chính trong trường hợp này Nấm thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng nuôi có nhiều người ra vào tạo điều kiện tích luỹ vi sinh vật càng nhiều

Nếu màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt trong quá trình cấy Ngoài ra, bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm những chai môi trường chưa được sử dụng hoặc những bình đã được nuôi 2 – 3 tháng Các loài nấm thường gặp:

Aspergillus, Candida, Cladosporium, Microsprium và Phialophra

2.4.2 Tính bất định về mặt di truyền

Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào qua nuôi cấy mô sẹo Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng thực tế có rất ít biến dị có lợi được báo cáo Nuôi cấy mô sẹo cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh Đến nay việc đưa ra biến dị chưa được làm sáng tỏ nhưng được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA Nhân tố thường gây

ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyển Số lần cấy chuyển càng nhiều càng cho độ biến dị cao Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài Số lần cấy chuyển ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyển ngắn làm giảm sự biến dị

2.4.3 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy

Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hoá nâu hay hoá đen mẫu làm sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa các hợp chất Tannin và Hydroxyphnol, có nhiều trong mô già hơn trong mô non Các phân tử Phenol làm nâu mẫu Cattleya là Eucomic acid và Tyramine Có vài phương pháp làm giảm sự hoá nâu mẫu:

- Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình hoá nâu hay đen,

đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalaenopsis, Cattleya và Aerides với

nồng độ thường dùng 0.1 – 0.3 % Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác

- Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thu phenol qua vòng hydrogen ngăn chặn sự hoá nâu ở nhiều loại cây trồng khác nhau

- Giảm sự hoá nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxy hoá vào môi trường ngăn chặn quá trình oxy hoá phenol, chất khử trùng được dùng như ascobic acid, citric acid, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol, glutathione và mecaptoethanol

Để hạn chế ảnh hưởng của phenol các nhà khoa học đưa ra vài kỹ thuật khi thao tác trên mẫu:

- Sử dụng mẫu nuôi cây nhỏ từ mô non

- Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng

- Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid, citric acid vài giờ trước khi cấy

- Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1 – 2 tuần

2.4.4 Hiện tượng thuỷ tinh thể

Trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện tượng thuỷ tinh thể mẫu nuôi cấy Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước và tỷ lệ sống sót thấp Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường bán rắn, đặc biệt khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây

Để hạn chế quá trình thuỷ tinh thể một phương pháp hiệu quả nhất được nhiều người ủng hộ là làm ảnh hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôi cấy

bằng cách tăng nồng độ đường và tạo điều kiện môi trường nuôi (nhiệt độ, ánh sáng, trao đổi khí) thích hợp

2.5 Tình hình nghiên cứu, sản xuất cây Hà thủ ô đỏ ở Việt Nam và trên thế giới

2.5.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất cây Hà thủ ô đỏ ở Việt Nam

Ở Việt Nam đã có khá nhiều công trình nghiên cứu khoa học về cây Hà thủ ô

đỏ Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào việc nghiên cứu tạo giống, nhân giống và công dụng một số hoạt chất trong cây Hà thủ ô đỏ

tetrahydroxxystilben-O-β-D-Glucosid trong dược liệu

Hà thủ ô đỏ bằng sắc ký lọc hiệu năng cao

TCDL

Số 6/2013 tập 18

Tác dụng chống oxy hoá in vitro và in vivo của

dịch chiết ethyl acetat từ Hà thủ ô đỏ TCDL 2011

Đánh giá bước đầu vị thuốc Hà thủ ô đỏ qua một

số phương pháp chế biến

Sách “CT NCKH 1987-2000”

2001

Một số kết quả bước đầu nghiên cứu chế biến Hà

thủ ô đỏ (Polygonum multiforum Thunb) TCDL

Số 232 5/1995

Do bị khai thác quá mức, lượng Hà thủ ô đỏ để sản xuất nhằm phục vụ nhu cầu cho người tiêu dùng đang hạn chế Hà thủ ô đỏ mọc hoang ở hầu hết các tỉnh miền núi từ Nghệ An trở ra, có nhiều ở Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Hòa Bình Hiện nay, Hà thủ ô đỏ được trồng nhiều nơi vùng ở phía bắc (Cao Bằng, Vĩnh Phúc) và cả ở phía nam, cây mọc tốt ở Lâm Đồng, Đắc Lắc, Phú Yên, Bình Định Do đặc điểm là phân bố nhỏ lẻ ở hầu hết các vùng núi, bị

khai thác tràn lan cùng với hoạt động đốt rừng làm nương rẫy của người dân đã làm cho Hà thủ ô đỏ đang đứng trước nguy cơ cạn kiệt Chính vì vậy, việc khai thác phải

đi đôi với bảo tồn và tái tạo Trong những năm gần đây tỉnh Cao Bằng cũng đã phát triển thêm diện tích trồng cây Hà thủ ô đỏ ở các huyện Bảo Lạc và Bảo Lâm nhằm tạo ra vùng nguyên liệu lớn phục vụ cho sản xuất các sản phẩm có giá trị từ Hà thủ

ô đỏ

Hiện nay, Hà thủ ô đỏ được bán trên thị trường Việt Nam dưới các dạng:

- Hà thủ ô đỏ dạng củ tươi (nguyên củ 100%)

- Hà thủ ô đỏ sơ chế (cắt lát, cắt khúc sấy khô nguyên chất 100%)

- Hà thủ ô đỏ bào chế dạng cắt lát hoặc đã nghiền thành bột

- Công ty TNHH Đầu tư và Phát triển Đông Tây

- Công ty Cổ Phần Trà Thảo Dược Trường Xuân

- Công ty Thảo Mộc Thiên Nhiên Thuận Thành

- Cửa hàng sản vật Tây Bắc Trần Lộc

- Nhà phân phối Thảo Dược Thiên Nhiên từ Tây Nguyên

- Cơ sở sản xuất Hà thủ ô Lê Thị Thanh Hải

- Công ty TNHH Dược Phẩm Nguyên Tâm,…

Giá bán Hà thủ ô đỏ cũng tùy theo từng dạng chế phẩm hay củ nguyên, tùy thuộc vào sản phẩm của từng công ty sản xuất khác nhau Thông thường giá bán của các dạng sản phẩm như sau:

- Hà thủ ô đỏ viên hoàn hoặc viên tròn có giá: 1.000.000 đồng/túi/100 viên

- Hà thủ ô đỏ chế biến cửu trưng, cửu sái, đóng gói hút chân không có giá: 400.000 đồng/kg

Trên thế giới Hà thủ ô đỏ được biết đến như một loại thuốc quý đã được nghiên cứu và sử dụng rất lâu đời Chúng được người Trung Quốc sử dụng như một loại thảo dược từ mấy ngàn năm nay Hà thủ ô đỏ được tiêu thụ dưới nhiều hình thức đa dạng, phù hợp với nhu cầu của người tiêu dùng như dạng bột, dạng viên nang, dạng khô đóng gói, Hà thủ ô đỏ đã qua sơ chế,

Tại các quốc gia Âu Mỹ cùng với sự bộc phát của phong trào thuốc thiên nhiên từ vài chục năm nay nên các sản phẩm được sản xuất từ Hà thủ ô đỏ cũng thấy xuất hiện nhiều trong các tiệm bán thuốc thiên nhiên và trên Internet dưới rất nhiều tên khác nhau như: Fo Ti, Chinese cornbind, Flowery knotweed, Climbing knotweed, He shou Wu, Ho shou Wu, Multiflora preparata, Shen Min, Shou wu Pian, Zi shou Wu… Đặc biệt ở Bắc Mỹ, Hà thủ ô đỏ (Fo Ti) bán được rất nhiều vì

để giúp cho đen tóc và phòng ngừa hói đầu Sản phẩm của Hà thủ ô đỏ được chế

biến dưới nhiều dạng khác nhau như phơi khô, sắc uống như trà, ngâm rượu, chế thành viên hoàn, chế thành cao, tán thành bột, viên nang (capsule), trà tan,…[23] Ngoài ra, Hà thủ ô đỏ còn được trồng nhiều nước khác như Bắc Lào, Đài Loan, Nhật Bản, Ấn Độ,… Việc nghiên cứu và sản xuất các sản phẩm từ Hà thủ ô

đỏ ở các nước này đã được tiến hành từ rất nhiều năm nay Các công trình nghiên cứu khoa học đã đưa ra được các công nghệ chế biến và sản xuất các sản phẩm thực phẩm từ Hà thủ ô đỏ ở trình độ tiên tiến có tính ứng dụng cao như các loại viên nang, trà tan,… Nhiều sản phẩm từ Hà thủ ô đỏ được đóng bao thiếc với công nghệ sản xuất bao thiếc tiên tiến bằng cách ép nhiều lớp màng có tính năng bảo quản cao song không độc hại, sản phẩm khi dùng rất tiện lợi và vẫn giữ nguyên vị [1]