Nghiên cứu nhân giống lan thạch hộc (dendrobium nobile lindt) từ hạt bằng phương pháp nuôi cấy mô tại trường đại học nông lâm thái nguyên

25 Bảng 3.4: Ảnh hưởng nồng độ một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân cụm chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt .... Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ của một số chất kích thích si

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐỖ THỊ HÀO

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN THẠCH HỘC

(Dendrobium nobile Lindl) TỪ HẠT BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Khóa học: 2011 – 2015

Thái Nguyên - 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐỖ THỊ HÀO

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN THẠCH HỘC

(Dendrobium nobile Lindl) TỪ HẠT BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Khóa học: 2011 – 2015 Giảng viên hướng dẫn: 1 ThS Nguyễn Thị Tình

2 ThS Bùi Đình Lãm Khoa CNSH–CNTP–Trường Đại học Nông lâm

Thái Nguyên - 2015

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô trong khoa đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực tập

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo Nguyễn Thị Tình và thầy giáo Bùi Đình Lãm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất tốt nhất có thể và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong quá trình thực tập; cảm ơn bạn bè đã giúp đỡ

em trong thời gian vừa qua

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không thể tránh được còn nhiều thiếu xót, em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến chân thành từ các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Đỗ Thị Hào

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Các hóa chất, dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nuôi cấy 23 Bảng 3.2: Ảnh hưởng hiệu quả khử trùng của NaOCl ở nồng độ, thời gian khác nhau đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn đưa vào nuôi cấy (sau 1 tuần theo dõi) 24 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của một số loại môi trường (MS, 1/2MS, B5, SH và WPM) đến tỉ lệ nảy mầm hạt lan Thạch hộc ( sau 12 tuần theo dõi) 25 Bảng 3.4: Ảnh hưởng nồng độ một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân cụm chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt 26 Bảng 3.5: Ảnh hưởng hợp chất hữu cơ đến nhân nhanh cụm chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt (sau 4 tuần theo dõi) 27 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ lan Thạch hộc (sau 4 tuần theo dõi) 27 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây lan Thạch hộc ở vườn ươm (sau 4 tuần theo dõi) 28 Bảng 4.1: Ảnh hưởng khử trùng NaOCl quả lan Thạch hộc ở nồng độ, thời gian khác nhau (sau 1 tuần theo dõi) 30 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của môi trường (MS, 1/2MS, 2/3MS, B5 và WPM) đến tỉ lệ nảy mầm lan Thạch hộc (sau 12 tuần theo dõi) 32 Bảng 4.3: Ảnh hưởng nồng độ BA, Kinetine và TDZ đến khả năng nhân cụm chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt 34

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ đến nhân nhanh cụm chồi lan Thạch hộc

tái sinh từ hạt 37 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ lan Thạch hộc 39 Bảng 4.6: Ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây lan Thạch hộc ở vườn ươm 41

LSD: Least Singnificant Difference Test (Sai số trung bình nhỏ nhấtcó ý nghĩa)

MS: Murashige and Skoog’s

VW: Vacin and Went

WPM: Wood Plant Medium

MỤC LỤC

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Ý nghĩa của đề tài 2

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về hoa lan 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm sinh học 4

2.1.3 Các phương pháp nhân giống 6

2.1.4 Giá thể trồng lan 8

2.2 Giới thiệu về giống lan Dendrobium 9

2.2.1 Phân loại và phân bố 9

2.2.2 Đặc diểm hình thái 9

2.2.3 Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng 12

2.3 Giới thiệu về lan Thạch hộc 13

2.3.1 Nguồn gốc và sự phân bố 13

2.3.2 Đặc điểm hình thái 14

2.4 Giá trị của lan Thạch hộc 15

2.4.1 Giá trị dược liệu 15

2.4.2 Giá trị kinh tế 17

2.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước 18

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 19

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 19

Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu 23

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 23

3.3 Điều kiện nuôi cấy 23

3.4 Hóa chất và thiết bị 23

3.5 Nội dung nghiên cứu 24

3.6 Phương pháp nghiên cứu 24

3.6.1 Nghiên cứu hiệu quả khử trùng của NaOCl ở nồng độ, thời gian khác nhau đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn đưa vào nuôi cấy (sau 1 tuần theo dõi) 24

3.6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường (MS, 1/2MS, 2/3MS, B5, và WPM) đến tỉ lệ nảy mầm hạt lan Thạch hộc ( sau 12 tuần theo dõi) 25

3.6.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến nhân nhanh cụm chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt (sau 4 tuần theo dõi) 26

3.6.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ lan Thạch hộc (sau 4 tuần theo dõi) 27

3.6.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây lan Thạch hộc ở vườn ươm (sau 4 tuần theo dõi) 28

3.7 Chỉ tiêu theo dõi 28

3.8 Phương pháp xử lí số liệu 29

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Kết quả nghiên cứu hiệu quả khử trùng của NaOCl ở nồng độ, thời gian khác nhau đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn đưa vào nuôi cấy 30

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường (MS, 1/2MS, 2/3MS, B5 và WPM) đến tỉ lệ nảy mầm hat lan Thạch hộc ( sau 12 tuần theo dõi) 32

4.3 Kết quả ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt (sau 4 tuần theo dõi) 33

4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BA, Kinetine và TDZ đến khả năng nhân cụm chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt 33

4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ đến nhân nhanh cụm chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt 36

4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ lan Thạch hộc (sau 4 tuần theo dõi) 39 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây lan Thạch hộc con ở giai đoạn vườn ươm (sau 4 tuần theo dõi) 41

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị 43

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nước ta có trữ lượng lan rừng rất lớn và nhiều loài có giá trị như: Vanda,

Phaphiopedilum, Cymbidium và Dendrobium Dendrobium là một trong những

giống hoa lan phong phú, đa dạng với hơn 1500 loài Dendrobium khá phong phú

về màu sắc và hương thơm của hoa Ngoài ra loài hoa này còn có giá trị dược liệu

Lan Thạch hộc thuộc chi Dendrobium Đây là đối tượng cây quý hiếm Đặc điểm

của giống là sai hoa, hoa to, đẹp, hương thơm nên rất được ưa chuộng Theo Đặng Văn Đông (2004) [4] hiện nay giá của một cây hoa lan có thể từ 100.000-1.000.000 đồng/cây

Lan Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindt) phân bố ở vùng trung du miền núi

phía bắc Việt Nam Qua kiểm nghiệm lâm sàng cho thấy loài lan này có nhiều giá trị dược học: chống ung thư, lão hóa và tăng sức đề kháng của cơ thể [44], [48] Điều làm nên giá trị dược liệu của loài lan này chính là hợp chất alkaloid Với giá trị dược liệu lan Thạch hộc đã bị khai thác tới mức bị tuyệt chủng trong tự nhiên [8], [49] Hiện nay Lan Thạch hộc nằm trong danh mục Đỏ của cuốn “Sách đỏ Việt Nam” năm 2007 [21]

Số loài lan quý hiếm như Đuôi chồn, Đai Châu, Lan Hài đang bị đe dọa tuyệt chủng trong tự nhiên được bảo tồn nhờ phương thức nảy mầm từ hạt [47] Theo TS

Trần Minh (2011) công nghệ nhân giống in vitro cho hệ số nhân giống từ quả lan cao

hơn các phương pháp tái sinh từ các bộ phận khác [16]

Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu nhân giống lan Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindt) từ hạt bằng phương pháp nuôi cấy

mô tại trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên” với mục đích bảo tồn nguồn

dược liệu quý đồng thời góp phần phát triển một loài thuốc nam có giá trị

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu của đề tài

Tái sinh và nhân giống lan Thạch hộc bằng phương pháp in vitro

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

- Xác định hiệu quả khử trùng của NaClOở nồng độ và các mốc thời gian đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn đưa vào nuôi cấy

- Xác định ảnh hưởng môi trường MS, 1/2MS, 2/3MS, B5 và WPM đến tỉ lệ nảy mầm của hạt lan

- Xác định ảnh hưởng nồng độ chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến nhân nhanh cụm chồi lan Thạch hộc

- Xác định nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ lan Thạch hộc

- Xác định loại giá thể thích hợp đến sinh trưởng và phát triển của cây con ở giai đoạn vườn ươm

1.3 Ý nghĩa của đề tài

- Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng được một biện pháp kỹ thuật nhân giống Lan

Thạch hộc bằng phương pháp in vitro

- Ý nghĩa thực tiễn

Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống Lan Thạch hộc bằng phương pháp

nuôi cấy in vitro, đảm bảo cung cấp số lượng lớn cây giống có chất lượng cao, đồng

đều cho sản xuất

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về hoa lan

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

2.1.1.1 Nguồn gốc

Các họ lan được đánh giá là loài hoa cao cấp trong vương quốc thảo mộc, bao gồm hơn 25.000 loài khác nhau, cùng với những loài mới được khám phá và mô tả theo từng năm Do chúng được phân bố vùng rộng lớn, trải dài từ xích đạo đến bắc cực, từ đồng bằng tới các vùng núi băng tuyết, các loài lan rất khác nhau Các loài lan chủ yếu sống trên cây cao, sống biểu sinh lâu năm, chúng được gọi chung là phong lan Các loài mọc trong đất gọi là địa lan và một số loài mọc trên núi đá gọi

là thạch lan [8]

Cây lan được biết đến đầu tiên ở Phương Đông khoảng từ 551- 479 trước công nguyên [20] Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lan ở buổi đầu không rõ rệt, người đầu tiên khảo sát hoa lan ở Việt Nam là ông Gioolas Noureiro nhà truyền giáo Bồ Đào Nha đã tả cây lan đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1789 trong “Flora Cochinnis”

gọi tên các cây lan trong cuộc hành trình tìm đến phía nam Việt Nam: Alrides,

Phagius và Sarcopodium đã được BenTham và Hooker ghi lại trong cuốn “Genera

rum” (1862-1885) Chỉ sau khi người Pháp đến Việt Nam mới có công trình được công bố đáng kể là: F.gagnepain vag A.gnillaumin mô tả 101 chi gồm 70 loài lan cho

cả 3 nước Đông Dương trong bộ “Thực vật Đông Chí Dương” [13]

2.1.1.2 Phân loại

Theo hệ thống thực vật học mới nhất cây hoa lan được phân loại như sau [8]:

Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Liliospida Bộ: Asparagales Phân họ: Orchidaceae

Đặc điểm về phân loại: Orchidacae là một họ rất lớn thuộc lớp đơn tử diệp, phân bố khắp nơi trên thế giới

Ở vùng ôn đới, ta gặp nhiều loài sống ở đất như địa lan, một số loài hoại sinh không diệp lục và sống vào chất mùn trong đất Có loài ở châu Úc có thể sống ngầm dưới đất như nấm [8]

Ở vùng nhiệt đới ta sẽ gặp nhiều loại phụ sinh sống trên cây khác như cattleya,

oncidium, laelia tập trung nhiều ở vùng Trung Mỹ, ở Đông Nam Á đặc sắc nhất là Denbrodium và còn có Cypripedium, Phalaenopsis, Cymbidium có nguồn gốc ở Inđônêsia

Cây lan có thể chia thành hai nhóm: Nhóm đơn thân và nhóm đa thân

* Nhóm đơn thân chia làm hai nhóm phụ:

- Nhóm phụ lá mọc đối (Sarcanthinae): Nhóm này lá được xếp thành hai hàng mọc đối nhau Gồm các giống như: Vanda, Aerides, Phalaenopsis

- Nhóm phụ lá dẹp thẳng hay tròn (Campylocentrinae): Papilionanthe, Luisia

* Nhóm đa thân: Gồm những cây tăng trưởng liên tục Căn cứ vào cách ra hoa nhóm này chia thành hai nhóm phụ:

- Nhóm ra hoa phía trên như: Cymbidium, Dedrobium, Oncidium

- Nhóm ra hoa ở đỉnh: Cattleya, Laelia, Epidendrum

* Ngoài ra còn có một số giống mang tính chất trung gian như: Centropetatum,

Phachyphllum, Dichaea

Theo nhiều nhà nghiên cứu về hoa của trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, với khoảng 897 loài phong lan hiện có và khí hậu thích hợp, nguồn nguyên liệu làm giá thể dồi dào cho cây sinh trưởng, phát triển Việt Nam có thể trở thành một nước

sản xuất hoa phong lan lớn trong khu vực [8]

2.1.2 Đặc điểm sinh học

2.1.2.1 Cơ quan dinh dưỡng

Giả hành (thân giả): Chỉ xuất hiện ở các loài đa thân Bộ phận giả hành cần thiết cho sinh trưởng, phát triển của lan Giả hành tuy là thân nhưng lại chứa diệp lục, đây là bộ phận dự trữ nhiều chất dinh dưỡng, nước cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới [20]

Thân: Lan có 2 loại thân: Đơn thân và đa thân [20]

+ Củ giả rất đa dạng: Hình cầu hoặc hình thuôn dài xếp sát nhau hay rải rác đều hoặc hình trụ xếp chồng chất lên nhau thành một thân giả

+ Cấu tạo củ giả: Gồm nhiều mô mềm chứa nhiều dịch nhầy, phía ngoài là lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ, tránh sự mất nước do ánh sáng mặt trời

Đa số củ giả đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó làm nhiệm vụ quang hợp Lá: Đa số các loài phong lan là cây tự dưỡng, nó phát triển đầy đủ hệ thống lá Hình dạng của lá thay đổi rất nhiều, từ loại lá mọng nước đến loại lá phiến mỏng Phiến

lá trải rộng hay gấp lại theo các gân vòng cung hay chỉ gấp lại theo gân hình chữ V Màu sắc lá thường xanh bóng nhưng có trường hợp 2 mặt lá khác nhau: Thường mặt dưới có màu xanh đậm hay tía, mặt trên lại khảm nhiều màu sắc sặc sỡ [20]

Rễ: Phong lan thuộc họ sống phụ sinh, treo lơ lửng trên các cây thân gỗ khác Các loại thân gỗ nạc dài, ngắn, mập hay mảnh mai đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày Đặc biệt đối với lan công nghiệp (nuôi cấy mô) người ta thường

sử dụng một số giá thể nuôi như: Dớn, than củi, … Rễ làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng, chúng được bao bởi lớp mô hút dày, ẩm Bao gồm: Những lớp tế bào chết chứa đầy không khí, do đó nó ánh lên màu xám bạc Với lớp mô xốp đó rễ có khả năng

hấp thu nước mưa chảy dọc dài trên vỏ cây, lấy nước lơ lửng trên không khí [7], [20]

2.1.2.2 Cơ quan sinh sản

Hoa: Lưỡng tính, rất hiếm các loại phong lan đơn tính, tạp tính và nhị dạng Hoa đối xứng qua một mặt phẳng, bên ngoài có 6 cánh, trong đó 3 cánh đài ở ngoài cùng, thường có màu sắc và kích thước giống nhau Một cánh đài nằm phía trên hay phía sau của hoa gọi là cánh đài lý, 2 cánh dài nằm 2 bên gọi là cánh đài cạnh Nằm

kề bên trong và xen kẽ với 3 cánh đài là 3 cánh hoa Chúng giống nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc Cánh còn lại nằm ở phía trên hay phía dưới, có hình dạng và màu sắc khác hẳn với các cánh còn lại gọi là cánh môi Cánh môi quyết định giá trị thẩm mỹ của hoa lan Ở giữa hoa có một trụ nổi lên bộ phận sinh dục của cây, giúp cây duy trì nòi giống Trụ gồm nhị và nhụy, sau khi thụ phấn các cánh hoa héo, cuống hoa hình thành quả lan [7], [8], [20]

Quả và hạt: Quả lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-6 đường nứt dọc, quả

có dạng cài dài đến hình trụ ngắn phình ở giữa Khi chín quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc Ở một số loài quả chỉ mở theo 1-2 khía dọc, thậm chí không nứt ra, và hạt chỉ ra khỏi vỏ quả khi vỏ này mục nát [8] Hạt lan rất nhiều, kích thước nhỏ Hạt chỉ cấu tạo bởi một phôi chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí Hạt trưởng thành sau 2-18 tháng Hạt phong lan không có nội nhũ nên nó khó có khả năng phát triển thành cây Các loài lan rừng chủ yếu nhờ nấm cộng sinh để phát triển thành cây

2.1.3 Các phương pháp nhân giống

2.1.3.1 Phương pháp nhân giống hữu tính

Cơ chế sinh sản hữu tính của lan Thạch hộc cũng giống như một số loài cây khác, bao gồm: Quá trình hình thành giao tử và thụ tinh khi hạt phấn chín tiếp xúc với núm nhụy nhờ côn trùng hay con người Núm nhụy tiết ra các hoocmon sinh trưởng nhờ vậy mà hạt phấn có thể nảy mầm được Sau đó, hạt phấn này theo trục hợp nhụy xuống bầu noãn để tinh tử kết hợp với tế bào trứng tạo nên hợp tử Bầu noãn lớn dần lên, cánh hoa và đài hoa héo đi, quả dần dần được lớn từ bầu noãn trương phồng [33]

+ Phương pháp nảy mầm cộng sinh nấm

Hạt hoa lan không chứa anbumin và có phôi chưa phân hóa vì thế sự nảy mầm của hạt rất khó khăn trong điều kiện tự nhiên, tỷ lệ nảy mầm rất thấp (khoảng 1/1.000.000) và thường xảy ra ở gốc cây mẹ Noel Bernard (1904) là người đầu tiên nghiên cứu hiện tượng này và đã làm nảy mầm hạt lan theo phương pháp bắt trước điều kiện tự nhiên với cộng sinh của nấm Hiện nay phương pháp này ít được dùng [18] + Phương pháp nảy mầm không cộng sinh

Năm 1922, Lewis Knudson ở Mỹ thành công trong việc thay thế nấm bằng đường ở môi trường thạch để gieo hạt Trước đó ông nhận rằng các bình cấy chỉ chứa thạch và muối khoáng thì khả năng nảy mầm là rất ít thậm chí không có Nhưng nếu có nấm thì hạt lan nảy mầm rất sớm Ông nhận thấy sự khác nhau giữa cây lan và hạt lan

là việc sử dụng CO2 trong không khí: Từ CO2 và nước, cây lan tạo ra hydratcacbon theo phản ứng:

n CO2 + 2n H2O (CH2O)n + n O2 + n H2O

Hydrat cacbon (CH2O)n và muối khoáng là do rễ mang lại, cây lan đã tổng hợp được các chất cần thiết cho sự phát triển Ông nghĩ rằng hạt lan không mọc được bởi

lý do nó thiếu khả năng tự tạo ra hydratcacbon từ CO2 Do đó chỉ thêm 2% đường vào môi trường gieo hạt (gồm có thạch và muối khoáng), không cần có nấm, hạt lan vẫn nảy mầm được Như thế vai trò chính của nấm đối với sự nảy mầm của hạt lan là cung cấp đường Từ phương pháp này của Knudson được ứng dụng khắp nơi trên thế giới [29]

+ Phương pháp gieo hạt xanh

Sau khi thụ tinh, cần thời gian từ 6 tháng tới 1 năm để quả chín Ngoài ra, để đảm bảo thành công trong việc tạo cây lai bằng kỹ thuật lai giống từ 2 loài lan có nhiễm sắc thể khác nhau, người ta đã dùng một phương pháp gieo hạt hoàn toàn mới là phương

2.1.3.2 Phương pháp nhân giống vô tính

Nhân giống vô tính là quá trình nuôi cấy thực vật trong các điều kiện tự nhiên Bao gồm các phương pháp sau:

+ Phương pháp cơ học (chiết ngọn, xiết ngọn)

Khi cây đạt đến một kích thước mong muốn, ta sẽ cắt phần ngọn có rễ đem trồng vào chậu mới Khi cắt, dụng cụ phải được khử trùng bằng nhiệt, sau đó bôi

vadolin có trộn zineb, sơn hoặc vôi vào vết cắt để tránh nhiễm trùng và cuối cùng thay chậu cho cây [18]

Một phương pháp khác đơn giản mà có hiệu quả là lấy dây đồng buộc vào thân cây và dần dần xiết lại trong một thời gian, mạch dẫn nhựa sẽ bị ức chế là nguyên nhân kích thích mọc chồi mới Khi chồi nhú ra khỏi thân, gỡ dây đồng ra, cây con sẽ lớn dần Đợi cây con phát triển thành thục và mọc rễ, ta sẽ cắt cây lìa khỏi thân mẹ Với phương pháp này ta sẽ có cây con mới mà sức khỏe cây mẹ vẫn bình thường, không bị sốc và vẫn đảm bảo ra hoa trong mùa tiếp theo

+ Phương pháp kích thích tố

Một số loại kích thích tố được dùng có hiệu quả rõ rệt và nhanh chóng tới sự mọc chồi các loài lan Với dung dịch kích thích tố pha sẵn được phun sương vào lá

và rễ, chỉ sau một tháng có dấu hiệu của sự mọc chồi Có thể phun 2 lần cách nhau

5 ngày để có kết quả chắc chắn Chất được dùng thuộc nhóm cytokinin (BAP, Kinetine ) với hàm lượng 5ppm [18]

+ Phương pháp tạo cây con trên phát hoa

Sau khi cây lan trổ hoa, cắt bỏ phần ngọn phát hoa chỉ để lại 4 mắt phía gốc rồi bôi Ianilin có bổ sung thêm acid cinnamic 50mg/ml + BAP 5mg/ml Sau 4-8 tuần, cây con sẽ mọc ở vị trí mắt và rễ được tạo ra khi cây con lớn dần Lúc này có thể cắt phát hoa và đem trồng cây con trong chậu

Với phương pháp này, tốc độ phát triển đạt 1 cây/năm Do đó, phương pháp này chỉ áp dụng quy mô hộ gia đình hay quy mô nhỏ Với quy mô lớn, ta phải dùng phương pháp khác để nhân giống với số lượng lớn

Một trong những phương pháp đang được sử dụng hiện nay có khả năng đáp ứng được nhu cầu lớn về cây con và thị trường hoa trong và ngoài nước đó là: Phương pháp nuôi cấy mô tế bào [18]

2.1.4 Giá thể trồng lan

Có thể sử dụng than hoa, gạch, dớn, xơ dừa, rễ lục bình, vỏ thông để trồng hoa lan, có thể dùng một loại giá thể hoặc phối trộn các loại giá thể trên với nhau để trồng lan tuỳ thuộc vào điều kiện cụ thể của từng vùng và tuỳ thuộc vào loài lan cũng như độ tuổi của lan [18]

2.2 Giới thiệu về giống lan Dendrobium

2.2.1 Phân loại và phân bố

Theo Huỳnh Văn Thới (2005) [37], tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Grec Dendron nghĩa là cây gỗ và bios là tôi sống, Dendrobium là giống phụ sinh,

sống trên cây gỗ Có người gọi là Hoàng Lan, có người gọi là Đăng Lan

Dendrobium có trên 1.600 loài và chia thành 2 dạng chính:

+ Dạng đứng (Dendrobium phalaenopsis) thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm và

rất siêng ra hoa: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên

+ Dạng thòng (Dendrobium nobile) chịu khí hậu mát mẻ: Giả hạc, Hạc vĩ,

Long tu, Phi điệp vàng,

Ở Việt Nam, Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông được phân biệt

bằng thân (giả hành), lá và hoa [19]

2.2.2 Đặc diểm hình thái

Theo Nguyên Công Nghiệp (2004) [19], thì không có một hình dạng chung nhất về hoa và dạng cây do số lượng quá lớn, phân bố rộng rãi

Riêng giống lan Dendrobium đều có bộ phận dinh dưỡng như rễ, thân, giả

hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, trái

Thân: Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004) [19], lan Dendrobium thuộc nhóm

đa thân (còn gọi là nhóm hợp trục) có hệ thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ

Theo Trần Văn Bảo (1999) [1] Một số Dendrobium lá có ở các mầm non, là

loại chống tàn chúng vàng úa và rụng vào mùa thu, thân phì to giống như củ không

có lá là nơi dự trữ năng lượng

Giả hành: Giả hành là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giả sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cấy trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao Ngoài ra, giả hành còn chứa diệp lục ố nên

Các loài thuộc giống Dendrobium vùng nhiệt đới nói riêng và họ Orchidaceae

nói chung đôi khi trút là vào mùa khô hạn Sau đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mưa thì cho mới [1]

Hoa: Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004) [19], Dendrobium thuộc nhóm phụ

ra hoa ở nách lá Chồi hoa mọc từ các mắt ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và

cả ngọn cây Sự biểu hiện trước khoa ra hoa khác biệ có nhiều loài rụng hết lá trước

khi ra hoa Thời gian ra hoa đầu mùa mưa hay đầu

Giống Dendrobium khi đủ dinh dưỡng thì cho thành từng chùm, phát hoa dài

và thời gian ra hoa trung bình 1-2 tháng [19]

Quả: Họ Orchidaceae đều có quả thuộc quả nang, khi hạt chín, các nang bung

ra chỉ còn dính lại với nhau ở đỉnh và gốc Ở một số loài, khi quả chín quả không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi quả bị mục nát [11]

Hạt: Những hạt giống không chứa các chất dinh dưỡng do gió phát tán để được nảy mầm cần có nấm cộng sinh hỗ trợ các chất cần thiết, đăc biệt ở đầu các giai đoạn phát triển [9]

Theo Dương Công Kiên (2006) [11], quả chứa 10.000-100.000 hạt đôi khi đến 3 triệu hạt có kích thước rất nhỏ nên phôi hạt chưa phân hóa Sau 3-5 tháng hạt chín và phát tán nhờ gió

Rễ: Cây có hệ dễ khí sinh có một lớp hút ẩm dày bao quanh gồm những lớp tế bào chết chứa dầy không khí nên rễ ánh lên màu anh bạc Vì vậy rễ hút được nước mưa chảy dọc trên vỏ cây gỗ hay nước lơ lửng trong không khí hơi sương và hơi nước, giup cây hút dinh dưỡng và chất khoáng, mặt khác giúp cây bám chặt vào giá thể, không bị gió cuốn Một số loài có thân lá kém phát triển thậm chí tiêu giảm hoàn toàn, có hệ dễ chứa diệp lục tố giúp cây hấp thụ ánh sáng cần thết cho sự ra

hoa và quang hợp Rễ của lan Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thừ gian dài, rễ cây sẽ bị mục nát và cây bị chết Rễ lan Dendrobium cũng giống như rễ lan Vũ Nữ, Cattleya thuộc loại rễ bán gió [11], [19]

Theo Huỳnh Văn Thới (2005) [37], nhóm này thường có rễ nhỏ nhưng thường rất nhiều rễ chủ yếu bám vào giá thể, vào thân cây để hút dưỡng chất dính vào giá thể như nước, cho nên khi trồng vào chậu, phải để giá thể nhiều hơn, gần như toàn bộ rễ đều bám vào giá thể, vào thành chậu, chỉ có một số ít rễ chìa ra ngoài Đối với rễ lan rễ bán gió phải trồng với giá thê nhỏ hơn và nhiều hơn, để bộ

rễ bám dày đặc hút nhiều dưỡng chất

Giá thể của lan Dendrobium có cấu tạo tương tự như các loài thuộc giống

Cattleya, nghĩa là chậu phải thật thông thoáng và không úng nước Tuy nhiên do

bản năng sinh học và cấu trúc thực vật với giả hành có thân, các loài thuộc giống

Dendrobium có thể dùng giá thể hơ ẩm hơn Cattleya chút ít nhưng không được làm

thối căn hành Vì thế một số loài lan Dendrobium có thể phát triển trên các giá thể à

xơ dừa hay cả quả dừa, dùng như một cái chậu chứa săn giá thể Cũng có thể trồng

lan Dendrobium với căn hành cách đáy khoảng 3 cm, rồi rải thật thoáng xung quanh

căn hành một số rễ lục bình giặt sạch Với cách trồng này thì kích thước chậu và cây phải thật tương xứng Tuy nhiên giá thể than và gạch vẫn tỏ ra hiệu quả nhất [19]

2.2.3 Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng

2.2.3.1 Nhiệt độ, ẩm độ, mùa nghỉ

Phần lớn Dendrobium sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ bình quân năm

180C-200C, lượng mưa năm trên 1.000 mm, độ ẩm tương đối không khí trên 80% Tưới ẩm: Giữ độ ẩm tương đối của không khí khoảng 80%, giá thể khô, ướt xen kẽ nhau, khi tưới phải để ráo nước ngay trong ngày, tránh đọng nước làm thối

rễ, thối cây Nên tưới vào lúc 8-10 giờ sáng

Thời vụ trồng có thể trồng vào các tháng 3-4, khi trời ấm dần, có mưa xuân,

độ ẩm cao, có lợi cho việc kích thích chồi nách phát triển và mọc rễ khí sinh để hút nước và thức ăn nuôi chồi

Cây con được thuần hoá tốt, ở nơi có điều kiện che râm tốt (như trồng trong giàn che) có thể trồng quanh năm [38]

2.2.3.2 Ánh sáng

Các mùa vụ khác nhau phải điều chỉnh cường độ cho phù hợp [38]

2.2.3.3 Phân bón

Bón phân vào sáng sớm, không bón vào lúc nắng nóng Định kỳ bón phân lên

lá bằng phân cân bằng NPK theo tỷ lệ 1:1:1, kết hợp bón phân giàu lân, kali, theo tỷ

lệ NPK 15:20:25, có thể phối hợp tưới nước phân chuồng Cần ngừng bón phân 2-3 tháng trước khi thu hoạch [13], [38]

2.2.3.4 Thay chậu và nhân giống

+ Tách bụi: Vào vụ xuân hoặc thu, trước khi ra chồi khoảng vào cuối tháng 3 đầu tháng 4, chọn những bụi tốt, không sâu bệnh, rễ phát triển mạnh, sử dụng cây 1-

2 tuổi nhiều mầm, nhổ cả cây có kèm rễ, ngắt hết phần chết khô hoặc chồi gầy, ngắt bớt rễ con quá dài và rễ già, chỉ để lại 3 cm, tách ra những bụi nhiều bụi theo số thân, mỗi bụi có 4-5 cành để trồng [38]

+ Giâm cành: Vào cụ xuân, hè khoảng tháng 5-6, chọn cây 3 tuổi, lấy đoạn thân tròn, khỏe, cắt thành đoạn, mỗi đoạn 4-5 mắt, dài khoảng 15-20 cm, cấy vào bột đá hoặc cát sông, cắm sâu đến mức không ngã, chờ đến khi có chồi nách, có rễ khí sinh mọc ra, có thể đem cấy Khi chọn vật liệu nên sử dụng đoạn thân phần trên

vì có ưu thế điểm sinh trưởng, tỷ lệ sống cao, chồi nhiều, mọc nhanh [38]

+ Nuôi cấy mô: Sử dụng lá, thân non, rễ đem tiêu độc, cắt thành đoạn dài 1cm, sử dụng môi trường cơ bản MS hoặc B5, bổ sung chất kích thích NAA (0.05-1.5mg/l), IAA (0.2-1.0mg/l), 6-BA (1.0-5.0mg/l) và nhiều tổ hợp có kích tố khác nhau, pH nằm trong 5,6-6,0, số giờ chiếu sáng 9-10h/ngày, cường độ 1800-1900lux, Sau 20 ngày, trên thân có nhú mầm nhỏ, sau một tháng, mầm nhỏ dài ra, ngọn tẽ ra, sau 2 tháng, chiều dài 2,0-2,7cm, sau 4-8 tháng có thêm nhiều chồi trong ống nghiệm có thể phát hiện trong nhiều môi trường pha chế khác nhau thì MS có tốc độ sinh trưởng tốt hơn B5 [38]

0.5-2.2.3.5 Sâu bệnh và các vấn đề khác

+ Phòng trừ sâu bệnh: Diệt trừ kịp thời các loại bệnh: đốm đen, thán thư, thối thân, rỉ sắt, … các loại sâu như rệp, ốc, nhện, sâu xám bằng việc phòng ngừa và sử dụng các loại thuốc Trừ cỏ: Hàng năm trừ cỏ 2 lần vào vụ xuân và vụ đông, vào mùa

hè tránh nhổ cỏ, mà chỉ dùng kéo cắt cỏ, để không xâm hại đến cây

+ Điều tiết độ che râm: Khi cây sinh trưởng độ che phủ tăng dần, vì vậy hàng năm vào mùa đông ngắt bớt cành quá dày, giữ độ che 60% Vào mùa đông cũng có thể tháo dàn che để tăng độ chiếu sáng

+ Tỉa cành: Hàng năm vào vụ xuân trước khi nảy chồi hoặc thu hái, cần tỉa bớt cành già và cành khô héo, cành quá dày, để xúc tiến chồi non phát triển phù hợp [13], [18], [38]

2.3 Giới thiệu về lan Thạch hộc

2.3.1 Nguồn gốc và sự phân bố

Theo từ điển Bách khoa dược học của Việt Nam (1999) đã ghi “Thạch hộc”

(Dendrobium nobile Lindt) có tên khác là Kim Thạch Hộc [32]

Thạch hộc được phân bố ở Việt Nam, Lào, Trung Quốc, Myanma và nhiều nước vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [15]

Ở Trung Quốc họ Lan có 150 Chi, 1000 loài chủ yếu phân bố ở phía Nam vùng Tần Lĩnh và Lưu vực sông Trường Giang Phần lớn các loài của Chi Thạch hộc phân bổ tập trung ở vùng 15°30’ – 25°12’ vĩ Bắc, chủ yếu ở các tỉnh Chiết

Giang, Quảng Tây, Hồ Nam, Vân Nam, Quý Châu Chi Thạch hộc ở Trung Quốc có

72 loài, 2 loài phụ Theo “Dược điển nước cộng hòa Trung Hoa” xuất bản năm 2005

đã ghi nhận ở Trung Quốc có 5 Chi Thạch hộc là: Thạch hộc hoàng thảo, Thạch hộc bờm ngựa, Thạch hộc vỏ tím, Thạch hộc rỉ sắt, Thạch hộc Kim thoa, trong đó Thạch hộc rỉ sắt là quý nhất được đánh giá là tuyệt phẩm của Thạch hộc Thạch hộc rỉ sắt

là loài cây có nguy cơ tuyệt chủng, được ghi vào sách đỏ, là dược liệu quý hiếm được pháp luật bảo hộ nghiêm ngặt Quý tộc thời Trung Hoa cổ đại coi Thạch hộc rỉ sắt là “nàng tiên”, mà dân gian gọi là “cỏ cứu mệnh” [15]

Thạch hộc khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng, những cây mọc hoang dã đã được đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng” được pháp luật bảo vệ, do đó nguồn cung cấp tự nhiên đã cạn kiệt, cấm thu hái và buôn bán

Trước kia Trung Quốc có 9 loại “Đại Tiên thảo Trung Hoa” gồm Thạch hộc rỉ sắt , Thiên sơn tuyết liên, Tam trạng nhân sâm, Đông trùng hạ thảo, Bách niên thủ

ô, Hoa giáp phục linh, Đại mạc tùng dung, Thân sơn linh chi và Chân châu đáy biển Trong đó Thạch hộc có công năng siêu việt về tư âm, bổ thận, được xếp vào đại tiên thảo đầu vị của 9 loại đại tiên thảo trên

Bởi vậy, Thạch hộc được mệnh danh là “vàng thực vật” là dược liệu quý hiếm truyền thống, được ghi danh trong “Dược điển nước Cộng hòa nhân dân Trung Hoa” xuất bản năm 2005, là loài quý nhất trong các loài Thạch hộc Hiện nay trong dân gian vẫn dùng nhiều mĩ từ để mô ta cây này “Cây thuốc vàng”, “Cây thuốc nghìn vàng”, “Đại hồng mao của ngành dược”

2.3.2 Đặc điểm hình thái

Là cây phụ sinh trên thân gỗ hay vách đá, cao 30-50 cm, thường mọc thành

bụi Thân hơi dẹt, có rãnh dọc, phía t rên hơi dày hơn, có đốt dài 2,5-3 cm

Lá hình thuôn dài, phía cuống tù, gần như không cuống, ở đầu hơi cuộn hình nón, dài 12cm, rộng 2-3cm trên có 5 gân dọc Lá mọc so le thành dãy đều ở hai bên thân, hầu như không cuống Hoa to màu hồng, mọc thành chùm trên những cuống dài, ở họng hoa có những điểm màu tím Hoa rất đẹp, to, màu hồng hay điểm

hồng Cánh môi hình bầu dục nhọn, dài 4-5cm, rộng 3cm cuộn thành hình phễu trong hoa, ở nơi họng hoa điểm màu tía [5], [15]

Quả nang hình thoi, khi khô tự mở Hạt nhiều, mùa hoa tháng 2-4, mùa quả: tháng 4-6

2.4 Giá trị của lan Thạch hộc

2.4.1 Giá trị dược liệu

2.4.1.1 Thành phần hóa học

Trong Thạch hộc có chất nhầy và chất ankaloit gọi là dendrobin khoảng 0,3%

có công thức thô C16H 25O22 Theo báo cáo của Viện nghiên cứu y học, hệ dược học

Bắc Kinh năm 1958 thì trong Thạch hộc Dendrobium nolile có 0,05% ankaloit,

không có saponin và không cho phản ứng tanin [15]

2.4.1.2 Tác dụng dược lý

Theo tác giả Đỗ Tất Lợi (2004) [15], Giám định hoạt tính kháng oxy hóa và kháng u bướu, đã phát hiện phần lớn các hợp chất loại bibenzil đều có hoạt tính

kháng oxy hóa, có 2 loại hợp chất Bibenzil có hoạt tính kháng u bướu

Năm 1936, hai tác giả Kinh Lợi Bâu và Lý Đăng Bảng đã báo cáo dùng cao thạch hộc chế bằng rượu 1ml=4g dược liệu tiến hành thí nghiệm tác dụng giảm sốt thì thấy với liều 2,5ml trên 1kg thể trọng, tiêm vào màng bụng thỏ đã được gây sốt bằng dung dịch 0,03% trực trùng côli (2,3ml đối với 1kg thể trọng) không thấy có tác dụng giảm sốt [15]

Trên mẩu hành lá tràng thỏ cô lập, với nồng độ thấp (0,0001-0,5%) thì thấy có tác dụng kích thích, sự co bóp được tăng cường Nhưng với nồng độ ao: 1-10% thì lại thấy tác dụng ức chế [15]

Đối với tim cô lập của loài cóc Bugo sp (dùng dung dịch Locke-Ringer) bất

kể nồng độ như thế nào đều thấy sử dụng ức chế co bóp Hiện tượng ức chế này hình như liên quan với thần kinh phó giao cảm vì thuốc chế từ thạch học đều có tác dụng làm giảm ảnh hưởng của pilocacpin, atropin và adrenalin trên cơ ruột, trên tim Tuy nhiên tác dụng ức chế đối với adrenalin có kém hơn Khi tiêm dung dịch

thạch hộc trên tim của loài cóc thấy dù nồng độ nào từ 0,01-10% đều không thấy ảnh hưởng [15]

+ Tăng cường khả năng miễn dịch: Nghiên cứu về dược lý hiện đại cho biết, Thạch hộc có tác dụng tốt về chống mệt mỏi và chống chịu ngạt oxy [15]

+ Hệ gan lợi mật: Thạch hộc có tác dụng lợi mật, tư dưỡng can âm, là dược thảo tốt điều trị các bệnh gan, mật, chữa trị viêm gan, viêm túi mật, sỏi mật [15] + Kháng phong thấp: Thạch hộc có khả năng tư dưỡng âm dịch, bôi trơn các khớp, giúp cho gân cốt khỏe, khớp nối thanh thoát, có hiệu quả tăng cường kháng phong thấp [15]

+ Giảm đường huyết, mỡ máu: Kết quả nghiên cứu lâm sàng cho biết Thạch hộc không những có hoạt tính tăng cường Insulin, đồng thời có khả năng giảm đường huyết giúp cho máu hoạt động bình thường, xúc tiến tuần hoàn, giãn huyết quản, giảm cholesterol và triglyceride [15]

+ Kháng u bướu: Thạch hộc có khả năng tiêu diệt một số tế bào ác tính của ung thư phổi, ung thư buồng trứng, bệnh máu trắng với hoạt tính kháng ung thư tương đối mạnh Trong lâm sàng sử dụng Thạch hộc rỉ sắt làm thuốc điều trị bổ sung các bệnh ung thư ác tính, cải thiện tình trạng của người bệnh, giảm nhẹ tác dụng phụ của các liệu pháp xạ trị, hóa trị, tăng sức miễn dịch, nâng cao chất lượng cuộc sống, kéo dài tuổi thọ [15]

+ Bảo vệ mắt: Thạch hộc có công năng dưỡng âm, là thảo mộc quý bảo vệ mắt, có hiệu quả tương đối tốt để chữa bệnh lòa của tuổi già, bảo vệ mắt cho trẻ em + Tự dưỡng da: Khi vào tuổi trung niên, âm dịch sa sút, da lão hóa, nám da và nhăn da Thạch hộc có chất nhờn, có tác dụng tư nhuận dinh dưỡng da [15]

+ Kháng suy não: Thạch hộc là thần dược có tác dụng trẻ hóa cơ thể Trong Thạch hộc có nhiều nguyên tố vi lượng quý có tác dụng chống lão hóa tốt hơn nhiều

so với các loại thuốc khác [15]

2.4.1.3 Công dụng và liều dùng

Theo tác giả Đỗ Tất Lợi (2004) Thạch hộc thường được dùng chữa những bệnh sốt nóng, khô cổ, khát nước, người háo bứt rứt khó chịu [15]

Theo đông y, thạch hộc dưỡng ấn minh tân, dùng trong các bênh tân dịch bất túc như miệng khô, hay do tân dịch không đủ mà không muốn ăn, mắt nhìn kém, khớp xương sưng đau hay không có lực Liều dùng hằng ngày: 4-12 g dưới dạng thuốc sắc

Theo tài liệu cổ thạch hộc vị ngọt, nhạt, tính hơi lạnh, vào 3 kinh phế, vị và thận Có tác dụng dưỡng âm, ích vị sinh tân Dùng chữa bệnh sốt, tân dịch khô kiệt Miệng khô khát khỏi bệnh mà người vẫn hư nhiệt Những người hư chứng mà không nóng không dùng được [15]

Đơn thuốc có thạch hộc chữa chứng ho, đầy hơi :Thạch hộc 6g, mạch môn 4g,

tỳ bà diệp 4g, trần bì 4g, nước 300ml, sắc còn 200ml Chia làm 3 lần uống trong ngày; chữa chứng hư lao, người gầy mòn: Thạch hộc 6g, mạch môn 4g, tỳ bà diệp 4g, trần bì 4g, ngũ vị tử 4g, đảng sâm 4g, trích cam thảo 4g, câu kỷ tử 4g, ngưu tất 4g, đỗ trọng 4g, nước 300ml Sắc còn 200ml Chia làm 3 lần uống trong ngày [15] Dùng cả cây, thu hái vào mùa đông, phơi hoặc sấy khô, bỏ rễ, tẩm rượu 1 đêm rồi phơi khô, lại tẩm giấm, phơi khô để làm thuốc [15]

Cây Thạch hộc chứa chất nhầy, ankaloit dendrobin, nobilin, vị hơi ngọt, hơi đắng, tính bình; vào ba kinh: phế, vị, thận Chủ trị bệnh ôn nhiệt tân dịch đã thương tổn, hoặc ôn nhiệt đã hết mà dư nhiệt vẫn còn Bổ ngũ tạng, hư hao, gầy yếu, miệng khô Ngày dùng 8-16g, dạng thuốc sắc hoặc hoàn tán, thường phối hợp với vị thuốc khác [5]

2.4.2 Giá trị kinh tế

Trong các loại hoa phong lan được trồng tại Việt Nam thì lan công nghiệp cho hiệu quả kinh tế tương đối cao Giá của một chậu lan có thể cho thu nhập từ 100.000 -1.000.000 đồng/cây [4]

Giá xuất khẩu vào những năm 80 đạt mức 3.000 USD/kg Ở Đài Loan giá từ 1.000 -3.000USD/kg.Ở Trung Quốc khoảng 30 đến 60 triệu VNĐ/kg Giá 1 cây Thạch hộc tươi 3 tuổi có giá 25.000 VNĐ – 35.000 VNĐ, 1 ha trồng 1 triệu cây thạch hộc, có thể thu được 25-30 tỷ trong 3 năm Nhu cầu của Trung Quốc và các nước trên thế giới về Thạch hộc còn rất lớn với giá cao, đem lại siêu lợi nhuân cho những người trồng và chế biến thạch hộc Nhu cầu thị trường Trung Quốc hiện nay cần khoảng

2000 tấn/năm, nhưng mới sản xuất được 200 tấn/năm Dự báo trong 10 năm tới thị trường nội địa cần tới 15000 tấn/năm tương đương hàng chục tỉ USD [15]

Với loài hoa chủ lực là Dendrobium, Thái Lan xuất khẩu đạt doanh thu gần 600

triệu USD mỗi năm Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, năm 2000, tổng sản lượng bán ra thị trường tương đương 100 nghìn USD Bên cạnh đó, ở các nước phát triển như: Anh, Mỹ, Đức, Ý đều nhập khẩu rất nhiều phong lan [37]

2.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1960, Morel đã tạo được cây Cymbidium sạch vius từ cây bị bệnh bằng

nuôi cấy chồi nách trên môi trường kunudson C đặc [18]

Đến năm 1963, Donald E Vimber đã nghiên cứu trên giống Cymbidium

nhưng lại cấy mô phân sinh trên môi trường lỏng và cũng cho kết quả rất tốt, tạo ra hàng trăm cây con từ một mô cấy trong thời gian từ 4- 5 tháng [18]

Năm 1966, Yocon Sagawa và T.shoji đã nuôi cấy mô phân sinh đỉnh và mô

phân sinh bên của Cymbidium trên cùng môi trường lỏng và đặc Kết quả là mô cấy

lớn lên rất nhanh Chỉ sau 4 - 6 tuần sẽ xuất hiện các thể giống protocorm, sau đó các cấy chuyển sang môi trường mới Từ các protocorm có thể tái sinh thành cây [18 ] Trong 1967, Yoneo Sagawa, T.shoji cũng nuôi cấy mô phân sinh ngọn và mô

phân sinh bên của giống Dendrobium trên môi trường Knudson lỏng + 5% nước

dừa và Knusdon đặc + 1 ppm NAA Kết quả là: Mô phân sinh ngọn cho kết quả rất tốt, mô phân sinh bên ở phần cuối thân cho kết quả trên môi trường Knudons C, còn

mô cấy từ cuống non không tạo protocorm [18]

Năm 1974, susannek - Mosich, Ernest A.Ball, Joseph Arditti đã nuôi cấy thành

công nốt Dendrobium trên môi trường knop để tạo chồi [18]:

Knudson C + 15% nước chuối tạo rễ và MS + 15% nước chuối tạo rễ Kết luận chồi của nốt trên môi trường knop bắt đầu phát triển sau 2 tuần được cấy chuyển sang môi trường mới, phần lớn rễ của chồi hình thành trong thời gian này

Năm 1976, Robert M.seulli JR đã nuôi cấy mô phân sinh ngọn và mô phân sinh

bên của giống Cattleya trên môi trường VW + 25% nước dừa và môi trường morel +

10% nước dừa + 1ppm NAA Kết quả là cây non sẽ hình thành trong thời gian từ 6 -

8 tuần [17]

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 1999, Mai Thị Tâm và cs nghiên cứu trên giống lan Dendrobium E.R Đối tượng nghiên cứu là chồi và quả của giống Dendrobium E.R, tạo ra nguồn vật

liệu khởi đầu là protocorm Môi trường cơ bản là VW có cải tiến với 1% sacarose, 15% nước dừa và các hàm lượng khác nhau của BA Kết quả cuối cùng tìm ra được các môi trường thích hợp cho quá trình tạo nguồn vật liệu khởi đầu, quá trình nhân nhanh tạo cây hoàn chỉnh [27]

Cũng trên giống này, với vật liệu là các protocorm đều, xanh mập, có mầm chồi, nghiên cứu đã xác định được ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng, phụ gia như đường saccarose, nước dừa, NAA, axit Nicotinic đến sự phát sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của cây Trên môi trường VW, tìm ra hàm lượng các chất

bổ sung hợp lý giúp cây sinh trưởng tốt, tăng cường sức sống và tạo cây hoàn chỉnh Năm 2003, Nguyễn Quang Thạch và cs nghiên cứu trên giống lan hồ điệp

(Phalaenopsis) với quả sau khi thụ phấn trên 100 ngày là đủ độ chín thuần thục và có

khả năng nảy mầm tốt nhất (95 - 100 %), thời gian khử trùng thích hợp cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, mẫu sạch sống cao là khử trùng kép 5 phút + 1 phút việc sử dụng nguồn vật liệu khởi đầu là cơ quan sinh dưỡng (lá non, mắt ngủ trên phát hoa và đỉnh hoa)

và cơ quan sinh sản hữu tính (hạt), kết quả VW + 100 ml nước dừa + 10 g đường saccarose + 6,5g agar +30 g khoai tây + 30 g cà rốt + 1g pepton thích hợp cho nhân

cụm chồi in vitro [33]

Năm 2007, Nguyễn Thị Tâm và cs nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố

môi trường và giá thể đến sinh trưởng của cây lan Dendrobium hybrid in vitro Sử dụng môi trường nền là VW (Vacin Went) + đường sacaroza 20 g/l + agar 9g/l +

nước dừa 100 ml/l + than hoạt tính 2 g/l Nồng độ BAP 2 mg/l và kinetine 3 mg/l

thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây lan Dendrobium hybrid, cho hệ số

tạo chồi và lá mới cao nhất (sau 6 tuần nuôi cấy) Khi bổ sung kết hợp NAA 0,3 mg/l với BAP 2 g/l cho hệ số nhân chồi và tạo lá cao nhất (1,80 và 2,04) Bổ sung NAA

0,3 mg/l có ảnh hưởng tốt đến khả năng ra rễ và phát triển của bộ rễ (số rễ đạt 15,83 cái/cây và chiều dài rễ đạt 2,3 cm) Khi ra cây trên 3 nền giá thể: rêu ngoại, rêu ngoại: xơ dừa (1:1), xơ dừa đều cho tỷ lệ sống khá cao (57,89 % - 67,67 %) Trong

đó, giá thể rêu ngoại đạt tỷ lệ sống cao nhất 67.67 % [28]

Năm 2009, Nguyễn Thanh Tùng và cs, nghiên cứu khả năng nhân nhanh in

vitro cây Mỹ Dung Dạ Lan Vanda denisoniana benson Đã xác định được: Khử

trùng quả Mỹ Dung Dạ Lan bằng HgCl2 với nồng độ 0,5% trong 10 phút cho tỷ lệ sống và tỷ lệ không nhiễm cao (81,82 %) Môi trường MS bổ sung kinetine 0,5 -1,5 mg/l cho tỷ lệ nảy mầm cao (>75 %), cao nhất ở nồng độ 0,5 mg/l (đạt 92,31 %) Nồng độ NAA tối ưu cho quá trình nảy mầm của hạt là từ 0,1-0,5 mg/l (tỷ lệ nảy mầm > 85%) MS +BAP 0,5 mg/l cho hệ số nhân cao nhất (2,7 chồi/protocorm) Nồng độ kinetine tối ưu cho nhân nhanh Mỹ Dung Dạ Lan là 0,5 mg/l [30]

Năm 2010, tác giả Ngô Xuân Bình và cộng sự nghiên cứu kĩ thuật nhân giống

phong lan Đuôi Chồn (Rhynchostylis retusa [L.] blume) bằng phương pháp nuôi cấy

mô tế bào Xác định được môi trường MS là tối ưu nhất cho sự nảy mầm của hạt lan Đồng thời, nhóm tác giả cho rằng cytokine có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả tái sinh hạt Tuy nhiên, khi sử dụng kết hợp giữa BA và Kinetine với tỷ lệ kinetine 0,1 mg/l + BA 0,3 mg/l cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất đạt 86.7 % [3]

Năm 2011, Hoàng Thị Nga và cs, xây dựng quy trình nhân nhanh giống địa lan

Hồng Hoàng (Cymbidium iridioides) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào đã cho kết quả

các chồi non có kích thước từ 4-6 cm hoặc hạt được sử dụng làm mẫu cấy, môi trường

để khởi động mẫu cấy là: MS + saccarose 20 g/l + agar 0,65 g + BA 1,5 ppm (hoặc 2 ppm Kinitine/l), để gieo hạt là: MS + sacarose 10 g/l + pepton 1 g + than hoạt tính 1 g/l + agar 6,5 g/l Môi trường thích hợp để nuôi cấy lát mỏng đã xác định là: MS + 1 ppm

K + sacarose 20 g/l + Kinitine 1 ppm (hoặc BA 0,5 ppm) + agar 6,5 g/l Nghiên cứu đã xác định được môi trường tối thích để tạo cây hoàn chỉnh là MS + than hoạt tính 0,1 g/l+ sacarose 25 g/l [17]

Năm 2011, Nguyễn Văn Song, nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium

chysotoxum) – một loài lan có nguy cơ tuyệt chủng Kết quả đã chỉ ra rằng nguyên liệu

sử dụng là quả lan 3 tháng Môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocom của hạt là môi trường MS cơ bản có sucarose 20 g/l + agar 8 g/l + ND 150 ml/l + BAP 2,0 mg/l Môi trường nhân nhanh protocom tốt nhất là MS cơ bản có sucarose 20 g/l + agar 8 g/l + ND 150 ml/l + BAP 2,0 mg/l Môi trường MS cơ bản có sacarose 30 g/l + agar 8 g/l + THT 1 g + ND 150 ml/l + BAP 2,0 mg/l + NAA 1,0 mg/l thích hợp cho tái

sinh chồi từ protocom và sinh trưởng của chồi in vitro Môi trường cơ bản có sucarose

20 g/l + agar 8 g/l + ND 150 ml/l + NAA 1,0 mg/l là thích hơp cho ra rễ của chồi in

vitro [23]

Năm 2012, Nguyễn Thị Sơn và cs, nhân giống in vitro loài lan Dendrobium

fimbriatumhook (Hoàng thảo Long nhãn) Kế quả nghiên cứu đã chỉ rõ: Nguyên liệu

sử dụng là quả lan 3 tháng tuổi Môi trường thích hợp cho nảy mầm là và phát sinh protocom của hạt là môi trường MS + ND 100 ml/l + saccarose 10 g/l + agar 6,0 g/l môi trường Môi trường nhân nhanh protocom tốt nhất là môi trường KC + ND 100 ml/l + sacarose 10 g/l + khoai tây 80 g/l + agar 6,0 g/l môi trường Môi trường MS + ND 100 ml/l + sacarose 20 g/l + chuối chín 60 g/l + agar 6,0 g/l môi trường là

thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE +

THT 1 g/l + agar 6,0 g/l môi trường [25]

Năm 2013, Vũ Ngọc Lan và cs, nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan bản địa Dendrobium nobile Lindl (Thạch hộc) nhằm bảo tồn và phát triển loài lan quý

thuộc chi Hoàng thảo, có giá trị thẩm mỹ dược liệu cao, đang có nguy cơ tuyệt chủng Kết quả cho thấy nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi, môi trường gieo hạt là MS + ND 100 ml + saccarose 10 g/l + agar 6,0 g/l môi trường Trong

nhân in vitro, môi trường nhân nhanh protocom tối ưu là KC + ND 100 ml + sacarose

10 g/l + agar 6,0 g/l môi trường; nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS + ND 100ml/l + sacarose 10 g/l + agar 6,0 g/l môi trường Môi trường tối ưu tạo cây hoàn chỉnh là RE + sacarose 10g/l + THT 0,6 g/l, cường độ chiếu sáng 2300 lux [12]

Năm 2014, Nguyễn Thị Sơn và cs, nhân giống in vitro lan Dendrobium

offcinale Kimura et Migo (Thạch hộc Thiết bì) Một loài lan quý được sử dụng làm

thuốc và thực phẩm chức năng chữa bệnh tiểu đường và các bệnh nan y đang được

thương mại hóa rộng rãi trên thế giới Kết quả nghiên cứu đã chỉ rõ: Nhân giống bằng gieo hạt trên môi trường VW + saccarose 10 g/l + agar 6 g/l + ND 100 ml/l môi trường Nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + ND 100 ml/l + sacarose 20g/l + agar 6g/l + chuối chín 60 g/l môi trường Nhân giống vô tính

thông qua nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ sử dụng thân in vitro mang 2 mắt ngủ

và nuôi cấy trên môi trường MS + sacarose 20 g/l + ND 100 ml/l + BA 0,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l + agar 6 g/l môi trường Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE + 10 g/l sacarose + agar 6 g/l + THT 0,3 g/l + NAA 0,5 mg/l môi trường [26]

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Giống hoa lan Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindt)

khỏe mạnh, sạch bệnh, được thu thập từ Thái Nguyên

- Vật liệu nghiên cứu: Quả lan Thạch hộc 6 tháng tuổi thu thập từ Thái Nguyên

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ hạt, nhân nhanh,

ra rễ và giai đoạn ở vườn ươm lan Thạch hộc bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

Địa điểm: Phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật Khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8/2014 đến 5/2015

3.3 Điều kiện nuôi cấy

Các thí nghiệm nuôi cấy trong phòng được duy trì trong điều kiện: To phòng

22 -250C, cường độ chiếu sáng: 2000-2500 lux, ẩm độ: 60- 65 %, quang chu kì 16h sáng/8h tối

- Tủ sấy Memmert – Đức - Đĩa cấy - Môi trường cơ bản

3.5 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu hiệu quả khử trùng của NaOCl ở nồng độ, thời gian khác nhau đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn đưa vào nuôi cấy (sau 1 tuần theo dõi)

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường MS, 1/2MS, 2/3MS, B5 và WPM đến tỉ lệ nảy mầm của hạt lan (sau 12 tuần theo dõi)

Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến nhân nhanh cụm chồi lan Thạch hộc (sau 4 tuần theo dõi)

- Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BA, Kinetine và TDZ đến khả năng nhân

cụm chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt

- Nghiên cứu ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân cụm chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt

Nội dung 4: Nghiên cứu nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ lan Thạch hộc (sau 4 tuần theo dõi)

Nội dung 5: Nghiên cứu loại giá thể thích hợp đến sinh trưởng và phát triển của cây con ở giai đoạn vườn ươm (sau 4 tuần theo dõi)

3.6 Phương pháp nghiên cứu

- Bố trí thí nghiệm: Ở tất cả các thí nghiệm chúng tôi bố trí ngẫu nhiên hoàn

toàn với 3 lần nhắc lại

3.6.1 Nghiên cứu hiệu quả khử trùng của NaOCl ở nồng độ, thời gian khác nhau đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn đưa vào nuôi cấy (sau 1 tuần theo dõi)

Quả lan Thạch hộc sau khi thu hái về được rửa sạch bằng dung dịch xà phòng, tráng sạch dung dịch xà phòng bằng nước máy, dùng cồn 70%lau sạch lớp vỏ ngoài

và đưa vào tủ cấy vô trùng

Ngâm quả trong dung dịch NaOCl ở nồng độ và các mốc thời gian khác nhau được bổ sung 1-2 giọt tween (làm giảm sức căng vỏ quả giúp tăng hiệu quả khử trùng) sau đó tiến hành rửa quả bằng nước cất vô trùng và rắc phôi hạt trên bề mặt môi trường

- Bố trí thí nghiệm: Mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình/CT Các công thức được bố

trí cụ thể như sau:

Bảng 3.2: Ảnh hưởng hiệu quả khử trùng của NaOCl ở nồng độ, thời gian khác nhau đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn đưa vào nuôi cấy (sau 1

tuần theo dõi)

3.6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường (MS, 1/2MS, 2/3MS,

B 5 , và WPM) đến tỉ lệ nảy mầm hạt lan Thạch hộc ( sau 12 tuần theo dõi)

- Bố trí thí nghiệm: Mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình/CT Các công thức được bố

3.6.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến nhân nhanh cụm chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt (sau 4 tuần theo dõi)

3.6.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân cụm chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt

Các protocom (cụm chồi) lan Thạch hộc 12 tuần tuổi được gắp sang các môi trường MS có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng để tiến hành nhân nhanh

Bố trí thí nghiệm: Mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình 5 cụm chồi có chiều cao 5mm

Bảng 3.5: Ảnh hưởng hợp chất hữu cơ đến nhân nhanh cụm chồi lan Thạch

hộc tái sinh từ hạt (sau 4 tuần theo dõi)

3.6.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng

ra rễ lan Thạch hộc (sau 4 tuần theo dõi)

- Bố trí thí nghiệm: Mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 1 mẫu Các công

thức được bố trí cụ thể như sau:

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ

lan Thạch hộc (sau 4 tuần theo dõi)