Nghiên cứu nhân giống cây bạch đàn lai u6 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng ra rễ chồi của giống cây bạch đàn lai U6... Kết quả ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân chồi câ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐỖ THÚY LINH

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BẠCH ĐÀN LAI U6 BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 - 2015

Thái Nguyên, năm 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐỖ THÚY LINH

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BẠCH ĐÀN LAI U6 BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 - 2015 Giảng viên hướng dẫn : 1 ThS Dương Mạnh Cường

2 ThS Lê Thị Hảo

Thái Nguyên, năm 2015

đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu, học tập và hoàn thành đề tài

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái nguyên, ngày tháng năm 2014

Sinh viên thực hiện

Đỗ Thúy Linh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân chồi bạch đàn lai U6 (sau 25 ngày nuôi cấy) 32 Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân chồi bạch đàn lai U6 (sau 25 ngày nuôi cấy) 35 Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa kinetin và IAA đến khả năng nhân chồi bạch đàn lai U6 (sau 25 ngày nuôi cấy) 37 Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn lai U6 (sau 20 ngày nuôi cấy) 39 Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn lai U6 (sau 20 ngày nuôi cấy) 41 Bảng 4.6 Kết quả ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn lai U6 (sau 20 ngày nuôi cấy) 42 Bảng 4.7.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến tỉ lệ sống của cây bạch đàn lai (sau 60 ngày trồng) 45

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi bạch đàn 33 Hình 4.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi bạch đàn lai U6 34 Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi bạch đàn 35 Hình 4.2 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chồi bạch đàn lai U6 36 Hình 4.3 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của Kinetin kết hợp với IAA đến khả năng nhân nhanh chồi bạch đàn 37 Hình 4.3 Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa kinetin và IAA đến khả năng nhân chồi bạch đàn lai U6 38 Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn 40 Hình 4.5 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn 41 Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn 43 Hình 4.6 Ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng ra rễ chồi của giống cây bạch đàn lai U6 44

IBA : Indole - 3 - butylric acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Singnificant Difference Test

MS : Murashige & Skoog (1962) NAA : 1- Napthalene acetic acid NXB : Nhà xuất bản

TB : Trung bình TDZ : Thidiazuron WPM : Woody Plant Medium

MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích của đề tài 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về cây Bạch đàn 4

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây Bạch đàn 4

2.1.2 Đặc điểm thực vật học 4

2.2 Giá trị kinh tế cây cây bạch đàn urophylla 5

2.3 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

2.3.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

2.3.2 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.3.3 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.4 Các giai đoạn trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.4.1 Chuẩn bị mẫu 11

2.4.2 Khử trùng mẫu cấy 11

2.4.3 Tạo chồi và nhân nhanh 12

2.4.4 Tạo cây mô hoàn chỉnh 13

2.4.5 Chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm 14

2.5 Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bạch đàn urophylla 14 2.5.1 Môi trường nghiên cứu 14

2.4.2 Các điều kiện nghiên cứu 19

2.4.3 Vật liệu nghiên cứu 20

2.4.4 Điều kiện vô trùng 20

2.4.5 Buồng nuôi cấy 21

2.5 Tình hình nghiên cứu về cây bạch đàn trong nước và trên thế giới 21

2.5.1 Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây bạch đàn trên thế giới 21

2.5.2 Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây bạch đàn trong nước 22

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 25

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 25

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 25

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 25

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 25

3.2.2 Thời gian tiến hành 25

3.3 Nội dung nghiên cứu 25

3.4 Phương pháp nghiên cứu 26

3.5 Các chỉ tiêu theo dõi 31

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 31

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Kết quả ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân chồi cây bạch đàn lai U6 32

4.2 Kết quả ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn lai U6 39

4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến tỷ lệ sống của 44 cây bạch đàn lai 44

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

I Tiếng Việt 48

II Tiếng Anh 50

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, nền công nghiệp của Việt Nam ngày càng phát triển nhanh, trong đó có ngành sản xuất giấy và đồ gỗ gia dụng Một số cây công nghiệp lâu năm đã được chú trọng phát triển và đem lại nhiều lợi ích kinh tế cho người nông dân trong đó có cây bạch đàn lai U6 (hay còn gọi là cây bạch đàn nâu)

Bạch đàn lai U6 có tên khoa học là Eucalyptus urophylla S.T Blake, thuộc họ Sim Myrtaceae (Hoàng Thị Sản và cs, 2009) [13].Là loại cây mọc tự

nhiên và có nguồn gốc từ châu Úc, chúng có thể sinh trưởng dưới một phổ sinh thái rộng như tập trung ở các vùng thấp ven biển, nhưng cũng có thể mọc

ở những vùng cao (2000m so với mặt biển) hay vùng khô cạn (sa mạc hoặc bán sa mạc) Ở Việt Nam đã gây trồng bạch đàn từ những năm 1930 ở cả hai miền Nam, Bắc Hiện nay bạch đàn đang được trồng phổ biến ở nhiều nơi, nó mang lại nhiều lợi ích cho con người như: Tăng hiệu quả kinh tế, nâng cao thu nhập của nhiều người dân và cũng góp phần xóa đói giảm nghèo ở một số tỉnh miền núi của Việt Nam (Lê Đình Khả và cs, 2002) [5] Giống bạch đàn

urophylla là loại cây có khả năng sinh trưởng nhanh, có biên độ sinh thái

rộng, dễ trồng trên nhiều loại địa hình khác nhau, có khả năng chịu gió bão có thể sử dụng để làm rừng phòng hộ, chống xói mòn đất đai Ngoài ra, giống bạch đàn này có dạng thân thẳng, thon đẹp, tỉa cành tự nhiên tốt, không để lại vết sẹo trên thân cây nên thu hút nhiều người trồng hơn một số giống bạch đàn khác (Lê Đình Khả, 2003) [6]

Bạch đàn lai là cây công nghiệp dài ngày ở nước ta và ở một số quốc gia khác Ở nước ta, bạch đàn lai được trồng sau 7-8 năm có thể cho thu hoạch gỗ để làm nguyên liệu chế biến bột giấy Sau 15 năm, Bạch đàn có thể

khai thác làm gỗ gia dụng, gỗ xây dựng (Lê Sơn và cs, 2005) [14] Hiện nay, nhu cầu sử dụng của con người ngày càng cao làm cho lượng gỗ và giấy tiêu thụ ngày càng nhiều nhưng việc sản xuất vẫn chưa đáp ứng đủ yêu cầu do diện tích trồng bạch đàn ngày càng thu hẹp dần và lượng cây giống đưa ra ngoài thị trường cũng chưa đáp ứng đủ yêu cầu của người trồng (Đoàn Thị Mai và cs, 2010) [10]

Do đó, để đáp ứng cho thị trường sản xuất giấy và sản xuất đồ gia dụng, cần phải có số lượng cây giống với chất lượng đảm bảo, ổn định và đồng đều Trong khi đó, việc sản xuất cây giống bằng hạt hay bằng công nghệ giâm hom cho hiệu quả sản xuất không cao do các nguyên nhân như: Hệ số nhân giống chưa cao, cây giống sản xuất ra không hoàn toàn sạch bệnh, sản xuất phụ thuộc vào thời vụ, khó khăn trong việc vận chuyển đi các nơi khác nhau… gây ảnh hưởng đến cây giống và năng suất của cây sau này (Nguyễn Đức Thành, 2000) [18]

Nhằm đáp ứng các nhu cầu thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu nhân giống cây bạch đàn lai U6 bằng phương pháp nuôi cấy

mô tế bào”

1.2 Mục đích của đề tài

Nghiên cứu nhân giống cây bạch đàn lai U6 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

1.3 Yêu cầu của đề tài

+ Xác định ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân chồi bạch đàn lai U6

+ Xác định ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn lai U6

+ Xác định ảnh hưởng của một số giá thể đến tỉ lệ sống của cây bạch đàn lai U6 trong vườn ươm

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Ý nghĩa khoa học:

+ Giúp sinh viên củng cố và hệ thống các lại kiến thức đã học

+ Giúp sinh viên rèn luyện và học tập khả năng nghiên cứu khoa học + Biết được các phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý

và phân tích số liệu, cách trình bày một bài báo khoa học

+ Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm nâng cao hệ số nhân

và chất lượng cây bạch đàn lai mới

- Ý nghĩa thực tiễn:

Nâng cao hiệu quả nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, làm giảm chi phí giá thành, tăng năng suất, chất lượng và đáp ứng nhu cầu cung cấp giống bạch đàn mới ra thị trường

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây Bạch đàn

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây Bạch đàn

2.1.1.1 Nguồn gốc

Bạch đàn là chi thực vật có hoa Eucalyptus trong họ Myrtus,

Myrtaceae Các thành viên của chi này có xuất xứ từ Australia Có hơn 700

loài bạch đàn, hầu hết có bản địa tại Australia, và một số nhỏ được tìm thấy ở New Guinea và Indonesia và một ở vùng viễn bắc Philippines và Đài Loan Các loài bạch đàn đã được trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới gồm châu Mỹ, châu Âu, châu Phi, vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Trung Quốc, bán đảo Ấn Độ (Lê Đình Khả, 2003) [6]

2.1.1.2 Phân loại

Giới (Kingdom): Plantae

Họ (familia): Myrtaceae

Phân họ (subfamilia): Myrtoideae

Chi (genus): Eucalyptus

Loài (species) : Eucalyptus urophylla

2.1.2.1 Thân

Thân cây cao to, thẳng, tăng trưởng nhanh, có thể đạt kích thước rất lớn, tỉa cành tự nhiên tốt Vỏ cây thường tồn tại ở hai dạng vỏ trên một thân, dạng vỏ sần sùi, ráp dày có màu nâu đỏ, các cây non có vỏ màu nâu khi già chuyển sang xám (Hoàng Thị Sản và cs, 2009) [13]

2.1.2.2 Lá

Có hai loại lá: Trên cây non hay cành non: Lá mọc đối, gần như không

có cuống, phiến lá hình trứng hoặc giống hình trái tim, sắc lục, mỏng, giống như có sáp, dài 10 - 15 cm, rộng 4 - 8 cm Trên cành cây già lá mọc riêng biệt,

so le, hình liềm, cuống ngắn, cong, phiến lá hẹp dài 16 - 25 cm, rộng 2 - 5 cm, cành già tròn, không cạnh (Hoàng Thị Sản và cs, 2009) [13]

2.1.2.3 Hoa

Từ kẽ lá có những nụ hoa hình núm oản ngửa, có bốn cạnh tương ứng với bốn lá đài Cụm hoa dạng tán mọc ở nách lá, mang 4 - 8 hoa, hoa màu trắng vàng hoặc trắng xanh (Hoàng Thị Sản và cs, 2009) [13]

2.1.2.4 Quả

Quả hình chén có bốn ngăn trong có chứa ít hạt, hình trứng hoặc gần hình cầu, đường kính 6 - 8 mm (Nguyễn Kim Thanh, 2005)[19]

2.2 Giá trị kinh tế cây cây bạch đàn urophylla

Bạch đàn U6 là sản phẩm của quá trình nghiên cứu khoa học chọn giống cây rừng, các cây đầu dòng được tiến hành nuôi cấy mô để duy trì nguồn gen, có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt Trong điều kiện bình thường năng suất rừng trồng bạch đàn U6 bình quân là 25-30m3/ha/năm, nếu được chăm sóc tốt rừng cây bạch đàn có thể cho năng suất 40 m3

50m3/ha/năm (Nguyễn Thị Lý Anh và cs, 2008)[1]

-Loài bạch đàn nói chung rất mau lớn, tán lá hẹp thưa, trồng trong vòng 5, 6 năm thì có chiều cao trên 7m và đường kính thân cây khoảng 9-10 cm Trước năm

1975, người ta đã nhầm lẫn trồng rừng Bạch đàn tập trung thuần loại ở Miền Trung Việt Nam nhằm mục đích phủ xanh và phủ nhanh đất trống đồi trọc nhưng kinh nghiệm cho thấy, cây Bạch đàn là loài dễ trồng, ít kén đất tăng trưởng nhanh nhưng hấp thụ nhiều nước và dưỡng chất trong đất nên nếu trồng tập trung thành rừng thuần loại trên đất trống đồi trọc vô tình sẽ làm khô cằn và nghèo nàn đất đai sau một vài chu kì Do đó, nếu cần phủ xanh đất trống đồi trọc thì chỉ nên trồng hỗn giao với loài bạch đàn bằng cách loài cây họ Ðậu như Keo lá tràm, Keo tai tượng hoặc Keo giậu để bù đắp chất đạm cho đất

Ở Việt Nam, gỗ bạch đàn thường đốn chặt khoảng 5-7 năm để làm cây chống trong xây dựng và làm bột giấy hay ván dăm bào gọi là ván okal (panneau de copaux) Bạch đàn có tuổi trên 70-80 năm, cây cao đến 50-60 mét, đường kính trung bình đến cả mét và gỗ được sử dụng đa năng từ làm bột giấy, ván ép, ván dăm bào, trụ cột cho đến dồ mộc gia dụng, xây cất nhà cửa cũng như công trình xây dựng nặng (Lê Sơn và cs, 2005)[14]

Đối với trồng rừng sản xuất, tiêu chuẩn quan trọng nhất để chọn cây trồng rừng là hiệu quả kinh tế Đối với bạch đàn, tuy có giá trị kinh tế kém hơn một số cây gỗ quý như cẩm lai, gỗ mật, sao, dầu, giáng hương song gỗ

dễ tiêu thụ, đưa lại hiệu quả kinh tế nhanh Ngoài ra chúng còn có một số ưu điểm khác: Một số cơ sở chế biến gỗ sử dụng gỗ Bạch đàn trong việc trang trí

và đóng các đồ gỗ dùng ở ngoài trời rất bền và tốt, một số loài đoạn thân dưới cành thẳng, dài, không bị mối mọt, nên được dùng trong xây dựng, ngành công nghiệp sản xuất giấy (Lê Đình Khả, 2002) [5]

2.3 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ : “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành Các tế bào phân hoá đều mang các thông tin di truyền có

trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ

đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể” (Nguyễn Đức Thành, 2000) [18]

Năm 1902, Harberland là người đầu tiên đã quan niệm rằng bất kì một tế bào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Ông đã cho rằng “Bằng nuôi cấy tế bào đã phân lập, người ta có thể tạo ra các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng” Ông cũng đã tiến hành nuôi cấy mẫu lá của một số cây một lá mầm như: Erythronium, Tradescantia, tuy nhiên đã không thành công (Vũ Văn Vụ và cs, 2008) [22]

Năm 1922, Kotte, học trò của Harberland và Robbins, người Mỹ, lặp lại thực nghiệm của Haberland với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hoà thảo Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ mang cả rễ phụ Tuy nhiên, sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm dần và dừng lại, mặc dù các tác giả đã chuyển sang môi trường mới (Nguyễn Đức Thành, 2000) [18]

Năm 1934, được xem là giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô và tế bào thực vật khi White thành công trong việc duy trì mô rễ cây cà chua trong môi trường lỏng có chứa muối khoáng, đường saccarozơ và dịch chiết nấm men Qua thí nghiệm, ông thấy rằng có thể thay dịch chiết nấm men bằng các vitamin nhóm B (B1, B3, B6) (Dodd J H., Roberts L W, 1999) [24]

Năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret cũng đã duy trì được sinh trưởng của mô sẹo cà rốt trong một thời gian dài Năm 1941, Van Overbeek và cộng sự đã phát hiện thấy nước dừa có ảnh hưởng tích cực đến

sự phát sinh phôi và tạo mô sẹo ở cây họ cà (Dodd J H., Roberts L W, 1999) [24] Cũng trong thời gian này, nhiều chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin như NAA, 2,4-D đã được tổng hợp Nhiều tác giả xác nhận cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo thông qua phân chia tế

bào ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy (Nguyễn Kim Thanh, 2005) [19]

Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm ADN chiết từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy mô thân cây thuốc lá Ông nhận thấy chế phẩm này có tác dụng kích thích sinh trưởng mô nuôi cấy rõ rệt Một năm sau, Skoog và cộng sự đã xác nhận chất gây ra hiện tượng trên là 6-furfuryl amino purine và đặt tên là kinetin Sau đó người ta đã tìm ra và tổng hợp một số chất có tác dụng kích thích phân bào tương tự như kinetin và cùng với kinetin gọi chung

là nhóm cytokinin Cytokinin được tách chiết từ thực vật bậc cao đầu tiên là zeatin có trong mầm ngô Các hợp chất này có khả năng kích thích sự phân chia tế bào của các mô đã biệt hoá cao như tế bào thịt lá hoặc nội nhũ của hạt

đã phơi khô (Dodd J H., Roberts L W, 1999) [24]

Nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel (1960) đã tạo ra được các protocorm (mô sẹo) từ địa lan Khi để trong các điều kiện nhất định, các protocorm có thể phát triển thành cây lan con và hoàn toàn sạch bệnh Cùng năm

đó, Cocking ở trường đại học tổng hợp Nottingham đã thu được các tế bào trần (protoplast) dùng cho nuôi cấy từ mô thực vật được xử lý với enzym xenlulaza Năm 1966, Guha và cộng sự đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn của cây cà độc dược (Datura inoxia) Việc tạo cây đơn bội thành công ở nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã đóng góp rất lớn cho các ngiên cứu di truyền và lai tạo giống (Vũ Văn Vụ và cs, 2008) [22]

Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi hai tác giả người Nhật Bản là Nagata và Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo được xenlulozơ Năm 1978, Melchers và cộng sự đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai

xa ở thực vật (Vũ Văn Vụ và cs, 2008) [22]

2.3.2 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật (plan tissue culture) là kỹ thuận đưa một mô,

bộ phận hoặc tế bào của thực vật vào trong một hệ thống vô trùng có thể kiểm soát về thành phần chất khoáng, điều hoà sinh trưởng, các chất hữu cơ cung cấp cho cây, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm để mô, bộ phận đó sinh trưởng, phát triển theo mục đích của người nuôi cấy (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2009)[20]

Các bộ phận được dùng để nuôi cấy có thể là chồi đỉnh, chồi bên, chồi bất định, bao phấn, bao hoa, phôi và các bộ phận khác như vỏ cây, lá non, thân mầm…

Ưu điểm chính của nuôi cấy mô là cây mô được trẻ hóa cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt, thậm chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt Một ưu điểm khác của nhân giống bằng nuôi cấy mô là có hệ số nhân giống cao hơn nhân giống bằng hom Từ một cụm chồi sau một năm nuôi cấy mô liên tục có thể sản xuất hàng triệu cây con Hơn nữa, nuôi cấy

mô cũng là một trong những biện pháp làm sạch bệnh Mặc dù nuôi cấy mô đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom đang được sử dụng khá phổ biến trong lâm nghiệp (Lê Đình Khả, 2002)[5]

2.3.3 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.3.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng

Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Ông nhận thấy, mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh Khi gặp

điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một

cơ thể hoàn chỉnh

Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham Unio) đã thành công khi thực nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế bào Thành công trên đã tạo ra công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu (Vũ Văn Vụ và cs, 2008) [22]

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh

từ một tế bào riêng rẽ

Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Sau đó, từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau (Nguyễn Đức Thành,

2000) [18] Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế

bào mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau Quá trình phân hóa tế

bào có thể biểu thị:

Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào

Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa tế bào

Sơ đồ các giai đoạn phân hóa tế bào

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào (Nguyễn Đức Thành, 2000), [18]

2.4 Các giai đoạn trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.4.1 Chuẩn bị mẫu

Mục đích của giai đoạn này là tạo nguồn mẫu sạch để phục vụ cho các bước tiếp theo Cây giống được đưa ra khỏi môi trường phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ động trong công tác nhân giống Trong điều kiện cần thiết có thể tác động các biện pháp trẻ hóa vật liệu nhân giống hoặc thụ phấn nhân tạo cho những loài khó thụ phấn trong điều kiện tự nhiên (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2000) [12]

2.4.2 Khử trùng mẫu cấy

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mô nuôi cấy Khi đã có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, cần tiến hành lấy mẫu và xử lý mẫu bằng hóa chất khủ trùng Tùy thuộc vào từng loại vật liệu mà chọn hóa chất,

nồng độ, thời gian khử trùng thích hợp Theo nguyên tắc thì lấy bất kỳ bộ phận nào của cây cũng có thể dùng làm mô nuôi cấy Nhưng thường lấy mô ở các phần non (chồi đỉnh, chồi bên) của cây thì cho tỷ lệ nuôi cấy thành công cao hơn so với lấy mô ở các bộ phận trưởng thành khác (Bhat K M and H, 2002) [23] Mẫu trước khi được cấy vào môi trường được rửa nhiều lần bằng nước sạch, rồi ngâm trong dung dịch khử trùng ở nồng độ và thời gian thích hợp để làm sạch nguồn bệnh Trong quá trình khử trùng mẫu phải đảm bảo không làm ảnh hưởng đến sức sống của mẫu cấy Tiếp đó cấy mẫu vào môi trường thích hợp cho từng loại cây Giai đoạn này kéo dài 4 - 6 tuần (Đặng Ngọc Hùng, 2009) [4]

Ngoài ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của mô càng thấp thì độ trẻ hóa càng cao, nuôi cấy dễ thành công Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Mô nuôi cấy có tỷ lệ sống cao, ít nhiễm bệnh, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào việc lựa chọn bộ phận nuôi cấy, nên khi lấy mẫu cần đảm bảo các nguyên tắc nêu trên (Đoàn Thị Mai và cs, 2010) [10]

2.4.3 Tạo chồi và nhân nhanh

Một trong những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào so với các phương pháp khác là hệ số nhân giống cao Vì vậy, có thể coi đây là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống Hệ số nhân nhanh ở giai đoạn này biến động từ 5 - 50 lần tùy thuộc vào từng loài cây, môi trường nuôi cấy và điều kiện ngoại cảnh thích hợp (Ngô Xuân Bình, 2010) [2]

Ở giai đoạn này bao gồm nhiều lần cấy chuyền mô lên các môi trường nhân nhanh nhằm kích thích tạo cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh Những khả năng tạo cây đó là:

+ Phát triển chồi nách

+ Tạo phôi vô tính

+ Tạo đỉnh sinh trưởng mới

Trong giai đoạn này vai trò của các chất kích thích sinh trưởng (auxin, cytokinin) là cực kỳ quan trọng để sản sinh ra lượng cây con tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây Theo nguyên tắc chung thì môi trường có nhiều Cytokinin sẽ kích thích việc tạo chồi cho cây

- Bổ sung tổ hợp hormone sinh trưởng mới: tăng cytokinin giảm auxin + Tỷ lệ auxin/cytokinin <1 tăng cường quá trình tạo chồi

+ Tỷ lệ auxin/cytokinin =1 cân bằng hai quá trình tạo rễ và chồi

+ Tỷ lệ auxin/cytokinin > 1 tăng cường quá trình tạo rễ

- Bảo đảm ở chế độ nhiệt 20 - 270C Tuy nhiên cần xác định số lần cấy chuyển hợp lý, bởi vì nếu số lần cấy chuyền quá lớn thì sẽ dẫn tới hiện tượng cây bị thoái hoá và sinh trưởng kém, có thể mất đi những đặc tính ban đầu của cây bố mẹ (Đoàn Thị Mai và cs, 2010) [10]

2.4.4 Tạo cây mô hoàn chỉnh

Các chồi hữu hiệu ở giai đoạn nhân nhanh sẽ được cấy chuyển sang môi trường ra rễ Thường 2 - 3 tuần các chồi này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh

Giai đoạn này bao gồm quá trình kéo dài chồi để tạo kích thước thích hợp và tạo rễ, tức là quá trình tạo cây hoàn chỉnh Môi trường lúc này không cần bổ sung cytokinin mà có thể chỉ bổ sung auxin Nồng độ auxin tối ưu được xác định dựa trên tỷ lệ tạo rễ, số lượng rễ và chiều dài rễ

Giai đoạn ra rễ là giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh có đủ thân, rễ và lá Giai đoạn này các chất kích thích tạo chồi và vươn cao của chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích ra rễ, do vậy các chất Auxin thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô tế bào Giai đoạn này không cần sinh trưởng về chiều cao mà chỉ cần tạo rễ cho chồi nên hàm lượngauxin, đường,

các chất khác trong môi trường nuôi cấy cũng được giảm một nửa (Lê Đình Khả, 2003) [6]

2.4.5 Chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm

Các bình ra rễ có chồi cây cứng, mập, khỏe đạt tiêu chuẩn nhất định về hình thái (chiều cao, số lá, số rễ) được mang ra ngoài huấn luyện một thời gian ở nới sạch sẽ, thoáng gió, tránh ánh sáng mạnh để cây tập thích nghi với môi trường tự nhiên Sau đó chuyển cây từ trong bình ra trồng ngoài khay giá thể, yêu cầu giá thể phải đảm bảo tơi xốp, thoáng nước và sạch Đặt cây trong nhà kính hoặc nhà lưới để huấn luyện thêm một thời gian nữa

Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm công việc huấn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện khí hậu thay đổi: Nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm…và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái tự dưỡng hoàn toàn Quá trình thích nghi ở đây phải được hiểu như là quá trình thay đổi những đặc diểm sinh lý, giải phẫu, của bản thân cây con đó Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần Trong thời gian này cây phải được bảo vệ trước những yếu

tố bất lợi như:

+ Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô

+ Nhiễm vi khuẩn và nấm làm cho cây bị héo khô

+ Cháy lá do nắng (Nguyễn Đức Thành, 2000) [18]

2.5 Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bạch đàn urophylla

2.5.1 Môi trường nghiên cứu

Trong nuôi cấy mô tế bào, môi trường nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được xem là vấn đề quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy Môi trường nuôi cấy được coi là phần đệm cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng và phân hóa mô trong suốt quá trình nuôi cấy Tùy vào đối tượng và mục đích nuôi cấy mà sử dụng các loại môi trường khác nhau Thành phần môi trường nuôi cấy đều bao gồm các muối khoáng đa lượng, vi

lượng, nguồn cacbon, các acid amin và các chất kích thích sinh trưởng (cũng

bổ sung thêm một số chất phụ gia khác như: Than hoạt tính, nước dừa…) tùy từng loài, giống, nguồn gốc mẫu, cơ quan hay bộ phận trên từng cơ thể mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng cũng khác nhau Do vậy, vấn đề lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu trong từng giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng Số lượng, nồng

độ và hàm lượng các loại hóa chất phải có độ chính xác cao và phù hợp cho từng giai đoạn, đối tượng cụ thể (Đỗ Năng Vinh, 2002) [21]

Môi trường nuôi cấy mô bao gồm các thành phần như:

a) Dinh dưỡng vô cơ

Dinh dưỡng vô cơ được chia ra làm 2 loại: Các nguyên tố dinh dưỡng đa lượng và nguyên tố dinh dưỡng vi lượng Trong tự nhiên cây trồng muốn sinh trưởng và phát triển mạnh thì cần phải lấy từ đất các nguyên tố sau (Nguyễn Quang Thạch, 2009) [20]:

- Các nguyên tố đa lượng: Các ion của nitơ (N), photpho (P), kali (K), canxi (Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S)

- Các nguyên tố vi lượng: Sắt (Fe), niken (Ni), clo (Cl), mangan (Mn), kẽm (Zn), bo (B), đồng (Cu), và molipden (Mo)

Các nguyên tố trên cùng với cacbon, oxy, hiđro được xem là các nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu của thực vật

Nhu cầu của mô thực vật nuôi cấy đối với nguyên tố dinh dưỡng khoáng khác nhau so với thực vật ngoài đồng ruộng Hệ rễ thực vật lấy dinh dưỡng từ đất chủ yếu theo phương thức hấp thu chủ động, còn mô nuôi cấy dinh dưỡng khoáng từ môi trường theo phương thức hấp thu bị động là chính Theo nguyên tắc thành phần môi trường nuôi cấy sẽ được xây dựng trên thành phần các nguyên tố dinh dưỡng có mặt trong mô Môi trường nhân tạo sử dụng phổ biến nhất thường được sử dụng trong nuôi cấy

mô, tế bào thực vật là môi trường MS (Murashige và Skoog (1962) cũng được thiết lập dựa trên nguyên tắc này (Nguyễn Quang Thạch, 2009) [20]

Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường cấy tế bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzyme

Các ion của muối khoáng hòa tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường trong tế bào, duy trì điện thế hóa của thực vật

Ví dụ: Kali, cacbon rất quan trọng trong điều hòa tính thấm lọc của tế bào (Đỗ Năng Vinh, 2002) [21]

b) Các vitamin:

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình trao đổi chất Đại đa số

tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng số lượng thấp, có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vitamin B1), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy (Nguyễn Quang Thạch, 2009) [20]

c) Dung dịch hữu cơ:

Có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết khoai tây, cà rốt… được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo

và các cơ quan Nước dừa được sử dụng khá rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh in vitro Trong nước dừa chứa các hợp chất quan trọng trong nuôi cấy mô như: Myo - inositol, các hợp chất có chứa hoạt tính Auxin, các Gluxit của Cytokinin Vì vậy, nước dừa được sử dụng để kích thích phân hóa, nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây như: Hoa cúc, hoa lan, hoa đồng tiền… Nước dừa thường được sử dụng với nồng độ 5 - 20% thể tích môi trường, kích thích phân hóa, nhân nhanh chồi(Lê Sơn và cs, 2005)[14]

d) Agar:

Agar là một loại polysaccarit của tảo Agar là chất keo đông thường được sử dụng nhất, nguồn gốc chủ yếu của nó là rong biển đỏ, là một phức chất polysaccarit do đường saccaroze và galactose tạo thành Nồng độ của thạch dùng trong nuôi cấy thay đổi phụ thuộc vào mục tiêu nuôi cấy (thường 4-12g/l, trung bình 6-12g/l) nếu nồng độ quá cao môi trường dinh dưỡng sẽ rất cứng chất dinh dưỡng khó khuếch tán để nuôi dưỡng mô cấy

Ở 800

C thì ngậm nước chuyển sang trạng thái lỏng còn ở 400C thì trở về trạng thái gel Khả năng ngậm nước của thạch khá cao: 6-12g/l nước Thạch ở dạng gel nhưng vẫn để cho các ion vận chuyển dễ dàng (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006) [7]

e) pH

pH của môi trường là một yếu tố quan trọng Sự ổn định của pH môi trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào pH của đa số môi trường được điều chỉnh giữa 5,5-6 trước khi hấp khử trùng pH < 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel còn pH > 6 agar có thể rất cứng (Vũ Văn Vụ và

cs, 2008)[22]

f) Các chất điều tiết sinh trưởng

Trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều tiết sinh trưởng Chúng là các yếu tố điều khiển sự phát sinh hình thái, tái sinh cây hoàn chỉnh của mô

Các chất điều tiết sinh trưởng là những chất có tác dụng kích thích sinh trưởng và phát triển của thực vật Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như: Phân chia, biệt hóa tế bào… ngoài ra còn ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa mô và nhiều quá trình khác Các Phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: Auxin, Cytokinin, Giberillin,

Ethylen và Abscisic acid Chúng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy mô

* Auxin

Auxin được chia thành 2 loại: Auxin tự nhiên và auxin tổng hợp auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole - 3 - acetic acid (IAA) và auxin tổng hợp là indole-3-butylric acid (IBA), 2,4-diclorophenolxy acetic acid (2,4-D), 1-napthalene acetic acid (NAA) Hoạt tính của các chất điều tiết sinh trưởng này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4-D IAA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng do đó không ổn đinh trong môi trường nuôi cấy mô NAA và 2,4-D không bị biến tính trong quá trình hấp tiệt trùng Tuy nhiên chất 2,4-D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng rất nhạy đến sự phân chia

tế bào và hình thành callus

Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, nhóm auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính Tùy loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay hình thành callus Nồng độ auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1- 2mg/l tùy từng chất và đối tượng nuôi cấy (Nguyễn Quang Thạch, 2009) [20]

* Cytokinin

Nhóm chất cytokinin kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hóa chồi Tỉ lệ auxin/cytokinin quyết định sự phân hóa của mô theo hướng tạo rễ, chồi hay mô sẹo Nồng độ sử dụng là 0,1-2mg/l Ở nồng độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy

Các cytokinin thường được sử dụng là Benzyladenin (BA) hay Benzyl amino purin (BAP), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2 iP) và Zeatin (cytokinin tự nhiên) Trong các chất này, BAP và sau đó kinetin được dùng phổ biến nhất vì có hoạt tính cao và giá không đắt Zeatin là một loại cytokinin có hoạt tính mạnh Trong nhiều trường hợp, người ta còn sử dụng một số chất cytokinin khác như Diphenylurea, Thidiazuron (TDZ) trong đó TDZ là một cytokinin có hoạt tính cao thường dùng trong nuôi cấy nhân nhanh cây thân gỗ (Nguyễn Quang Thạch, 2009) [20]

g) Than hoạt tính

Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc Than hoạt tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol… trong trường hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có nó vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ Than hoạt tính còn là một trong những chất chống oxy hóa tốt Nhìn chung nó có ảnh hưởng trên 3 mặt: Hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường (Vũ Văn Vụ và cs, 2008) [22]

2.4.2 Các điều kiện nghiên cứu

+ Ánh sáng: Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của các mô nuôi cấy Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường độ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng

Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của mô nuôi cấy Với đa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8 - 12 giờ/ngày Cường độ ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy nhìn chung từ 1000- 7000 lux

- Cường độ ánh sáng: Là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy với những cường độ ánh sáng khác nhau

- Loại ánh sáng: Có thể sử dụng ánh sáng tự nhiên cho những loại mô

tế bào cần cường độ ánh sáng thấp, ánh sáng đỏ kích thích kéo dài chồi, thân

so với ánh sáng trắng

- Chính vì vậy mà phòng thí nghiệm thường sử dụng nguồn năng lượng ánh sáng của đèn huỳnh quang, đặt trên các bình nuôi cấy khoảng 20 - 25 cm

sẽ cho cường độ ánh sáng tiêu chuẩn 2000 - 3000 lux

+ Nhiệt độ: Là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng đến

sự hoạt động của auxin, do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây mô (Vũ Văn Vụ, 2008) [22]

2.4.3 Vật liệu nghiên cứu

Thực tế cho thấy các loại tế bào và các loại mô khác nhau có mức độ nuôi cấy thành công khác nhau Một nguyên tắc trong nuôi cấy mô tế bào là vật liệu nuôi cấy càng non khả năng nuôi cấy thành công càng cao Như vậy,

tế bào và mô phôi non là triển vọng nhất, sau đó đến các tế bào của đỉnh sinh trưởng như: Mô phân sinh đỉnh ngọn, đầu rễ, lá non… sau đó là các tế bào sinh dục như: Noãn tế bào và tế bào hạt phấn ở giai đoạn non (Nguyễn Ngọc Tân, Trần Hồ Quang, 1997) [15]

2.4.4 Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng.Nếu không

đảm bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại

của nuôi cấy mô in vitro (Nguyễn Kim Thanh, 2005) [19]

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất

khử trùng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao Thông thường hay sử dụng một số hoá chất như: NaOCl, cồn 70o

, Ca(OCl)2,

HgCl2 0,1% … để khử trùng (Đoàn Thị Mai và cs, 2010)[10]

2.4.5 Buồng nuôi cấy

Buồng nuôi cấy là nơi dùng để đặt các mẫu nuôi cấy Buồng nuôi cấy cần đảm bảo các điều kiện sau:

+ Sạch sẽ, tránh tiếp xúc với bên ngoài

+ Nhiệt độ: 250C (±2)

+ Cường độ ánh sáng: 2000 - 3000 lux (Đoàn Thị Mai, 2004) [8]

2.5 Tình hình nghiên cứu về cây bạch đàn trong nước và trên thế giới

2.5.1 Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây bạch đàn trên thế giới

Từ năm 1987, Gupta và Mascarenhas đã cho biết là có trên 20 loài bạch đàn đã được nhân giống thành công bằng nuôi cấy mô và tạo được cây mô (planet) và con số này từ đó đến nay đã ngày một tăng lên (Higa, A.R., & Resende, M D V., 1994) [27]

Theo Hudson T Hartmann và các đồng sự: Từ chồi ngọn và chồi nách tạo và nhân chồi trên môi trường MS/2, có bổ sung BA (0,2 mg/l) và IBA (0,16 mg/l) Từ chồi tạo rễ trên môi trường MS/2, có bổ sung IBA (0,2 mg/l) Phương pháp này có ưu điểm chỉ sử dụng 2 môi trường nên đơn giản, tuy nhiên quy trình này cũng có những nhược điểm lớn khi áp dụng vào thực tiễn đó là: Tốc độ nhân giống chậm, hệ số nhân thấp do thời gian nuôi cấy chồi dài, cụm chồi tăng trưởng chậm và từ một cụm chồi số chồi có thể tách ra cấy vào môi trường rễ ít Trên môi trường tạo rễ cây cho ra rất ít rễ và rễ bị chuyển màu nâu nên không kéo dài thời gian sinh trưởng được (Harwood, C E., 1998) [25]

Nghiên cứu của Glori (1993) ở Philippin cho thấy trong các giống giữa

các loài Bạch đàn E pellita, E deglupta và E urophylla sau 4 năm trồng các

tổ hợp lai E deglupta x E pellita và E pellita x E urophylla đều có thể tích

thân cây cao hơn các loài cây bố mẹ Lai thuận nghịch và tế bào chất có ảnh hưởng rất lớn đến ưu thế lai, vì thế có vai trò quan trọng trong chọn giống cây rừng (Gamborg O L, G C Phillips,1997) [26].

Darus H Ahmas thuộc viện nghiên cứu lâm nghiệp Malaysia đã nuôi cấy mô tế bào cây Bạch đàn E pellita bằng môi trường MS có bổ sung 3% Sucrose, 0,6% agar và 0,5 mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi Những chồi có chiều cao >0,5cm được cấy vào môi trường tạo rễ và chất điều hoà sinh trưởng tốt nhất cho tạo rễ là IBA 1000 ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% (O L Gamborg, G C Phillips, 1997) [26]

V.J Hartney và cs thuộc (Division of Forest Research) đã sản xuất cây

Bạch đàn lai (E camaldulensis) thành công bằng nuôi cấy chồi in vitro Môi

trường nuôi cấy được sử dụng là WPM + 3% Sucrose + 0,5 % agar + 1,5 μM BAP + 2 μM NAA Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250C (± 40C), giai đoạn khử trùng mẫu để tạo vật liệu ban đầu tác giả đã sử dụng muối hypoclorite 4% và khử trùng trong thời gian 20 phút (sharma, J.K., 1994) [28]

2.5.2 Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây bạch đàn trong nước

Đã có trên 50 loài bạch đàn được khảo nghiệm ở nước ta từ trước những năm 1970 và từ đó đến nay có hàng chục loài được khảo nghiệm trên diện tích rộng với khá nhiều xuất xứ làm cơ sở cho chọn loài và xuất xứ sinh trưởng nhanh phục vụ trồng rừng đại trà

Ở nước ta nuôi cấy mô đã được áp dụng rộng rãi trong công tác nhân giống một số giống bạch đàn nhập nội, các dòng vô tính bạch đàn lai và keo lai có năng suất cao Cùng với kết quả về cải thiện giống Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào cho Keo lai, Bạch đàn và một số cây rừng khác (Lê Đình Khả, 2003)[6]

Đoàn Thị Mai và cs (2000) đã nghiên cứu nuôi cấy mô thành công cho giống bạch đàn lai U29C3 Kết quả cho thấy thời kỳ mẫu bị nhiễm ít nhất và có

tỷ lệ bật chồi cao nhất từ tháng 5 - 8 Môi trường MS + 0,5mg BAP/l cho số chồi trung bình trong cụm chồi cao nhất (16,6 chồi/cụm) Môi trường ra rễ thích hợp là môi trường MS + 1,0mg IBA/l cho tỷ lệ 83,3% (Đoàn Thị Mai và

cs, 2000) [9]

Lê Sơn và cs (2002) đã nghiên cứu nuôi cấy mô thành công cho giống bạch đàn lai U29C3.Kết quả cho thấy thời gian xử lý khử trùng từ 6-8 phút cho kết quả cao tỷ lệ nhiễm giảm hẳn chỉ còn 20-24%, tỷ lệ bật chồi đạt 38-60%

Môi trường MS* bổ xung BAP nồng độ 0.5mg/l thích hợp nhất cho Bạch đàn số chồi/cụm đạt trung bình 17 chồi/ cụm đặc biệt có thể tới 30 chồi/ cụm

Môi trường ra rễ thích hợp là môi trường MS* bổ sung IBA nồng độ 1.5mg/l tỷ lệ ra rễ cũng đạt 97.3% (Lê Sơn và cs, 2002) [13]

Đoàn Thị Mai và cs (2000), đã đưa ra giá thể thích hợp cho Bạch đàn là 45% đất tầng B + 45% trấu hun + 10% phân chuồng hoai mục cho tỷ lệ cây phát triển đạt 93.33% cây sinh trưởng và phát triển tốt (Đoàn Thị Mai và cs,2000) [9]

Đoàn Thị Mai (2010) đã đưa ra môi trường nuôi cấy mô cho cây Bạch đàn dòng UE35 hoá chất khử trùng thích hợp là chất kháng sinh với nồng độ 4,5mg/l trong thời gian 25 phút, tỷ lệ bật chồi đạt 17,5% và PN3D là mẫu bật chồi đạt 17,5% HgCl2 nồng độ 0,5% trong khoảng thời gian là 12 phút Môi trường là MS* + 0,5mg BAP /l + 0,3mg NAA /l + các phụ gia khác (Đoàn Thị Mai, 2010) [10]

Đoàn Thị Nga, thuộc viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh - Phú Thọ nghiên cứu nuôi cấy mô cây Bạch đàn dòng PN2 Tác giả cho rằng, môi trường thích hợp nhân nhanh là MS + 0,5mg BAP /l + 0,25 mg NAA /l Môi trường ra rễ tối ưu là 1/4 MS + 1mg IBA /l (Đoàn Thị Nga, 1997) [11]

Lê Đình Khả và cs, 2002 từ chồi ngọn bạch đàn lai U6 dùng môi trường dẫn dắt phân hóa là môi trường MS, có bổ sung BAP (0,5 - 1 mg/l) và IBA

(0,1 - 0,5 mg/l), nhân nhanh cụm chồi trên môi trường MS, có bổ sung BA (1

- 2 mg/l), Kinetin (0,5 mg/l) và IBA (0,1-0,5mg/l) cho số chồi cao nhất đạt 18 cụm/chồi,tạo rễ trên môi trường MS/2, có bổ sung ABT (0,5 -3mg/l), IBA (0,01 -0,05mg/l) và GA3(0,05 mg/l) (Lê Đình Khả và cs, 2002) [5]

Nguyễn Ngọc Tân và cs, 1997 đã đưa ra môi trường nuôi cấy mô cho cây Bạch đàn dòng U6 là: môi trường nhân chồi (MS + 3% đường + 4,5 g/l agar + 0,5 mg BAP /l + 0,25 mg NAA /l), môi trường tạo rễ (1/4 MS + 1,5 % đường + 5g/l agar + 1mg IBA /l) (Nguyễn Ngọc Tân và cs, 1997) [16]

Nguyễn Ngọc Tân và Trần Hồ Quang thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam nghiên cứu nhân giống cây lai giữa bạch đàn liễu và bạch đàn trắng bằng phương pháp nuôi cấy mô Kết quả nghiên cứu cho thấy: việc nhân chồi bạch đàn lai đạt kết quả tốt trên môi trường MS có bổ sung 0,3-0,5

mg BAP /l và 0,2 mg Kinetin /l cho số chồi 16.9 chồi/cụm Môi trường ra rễ thích hợp là 1/2 MS + 1 mg IBA /l (tỷ lệ ra rễ đạt 80% sau 12 ngày) (Nguyễn Ngọc Tân và cs, 1997) [15]