TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TNTN BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ĐÈ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÁP TRƯỜNG
NHAN GIONG LAN Dendrobium anosmum, Dendrobium
mini BANG PHUONG PHAP NUOI CAY MO NGHIEN CUU CAC LOAI GIA THE TRONG LAN
Dendrobium mini THiCH HOP
VA CHO HIEU QUA CAO
Cha nhiém dé tai: NGUYEN THI MY DUYEN
Trang 2NHAN GIONG LAN Dendrobium anosmum, Dendrobium
mini BANG PHUONG PHAP NUOI CAY MO NGHIEN CUU CAC LOAI GIA THE TRONG LAN
Dendrobium mini THiCH HQP
Trang 3TRUONG DAI HQC AN GIANG KHOA NONG NGHIỆP & TNTN BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ĐÈ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÁP TRƯỜNG
NHAN GIONG LAN Dendrobium anosmum, Dendrobium
mini BANG PHUONG PHAP NUOI CAY MO NGHIEN CUU CAC LOAI GIA THE TRONG LAN
Dendrobium mini THICH HOP VA CHO HIEU QUA CAO
Cha nhiém dé tai: NGUYEN THI MY DUYEN Cộng tác viên: TRỊNH HOÀI VŨ
Trang 4LOI CAM ON
Chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý Khoa học, Phòng Kế hoạch và tài vụ, và đặc biệt là Ban chủ Nhiệm Khoa Nông nghiệp & TNTN Trường Đại học An Giang đã tạo điêu kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đê tài này
_ Rất biết ơn Thầy Võ Tòng Xuân, Thầy Võ Tòng Anh, Thầy Trương Bá Thảo, Thầy
Nguyên Hữu Thanh đã nhiệt tình động viên và ủng hộ tôi thực hiện đê tài Cùng với Nguyễn Thị Thúy Diễm, Trịnh Hoài Vũ và các đồng nghiệp trong bộ môn đã nhiệt góp sức cùng tôi nghiên cứu thực hiện đê tài này
Cô Mai Dung, cô Đặng Phương Trâm là những người Thầy đã chỉ dẫn cho tôi trong hai lĩnh vực trông lan và cây mô
Rất cám ơn Thầy Chương cùng các cán bộ phịng thí nghiệm đã tạo điều kiện để tơi
hồn thành các thí nghiệm
Các em sinh viên lớp DH3SH, DH4SH và DH5SHI đã góp sức cùng tôi thực hiện
đề tài
Trang 5PHAN TOM TAT
Dé tai nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Nông Nghiệp & TNTN, Trường Đại học An Giang từ tháng 02 năm 2006 đến tháng 02 năm 2008 Đề tài thực hiện với hai qui trình vi nhân giống lan Dendrobium anosmum và Dendrobium mini, và thử nghiệm ra cây Dendrobium mini trên nhiều loại giá thể khác nhau Với tổng cộng là 6 thí nghiệm gồm 5 thí nghiệm trong phịng và I thí nghiệm ngồi vườn
Qui trình vi nhân giống lan Dendrobium anosmum
- Trai lan Dendrobium anosmum sau khi được tự thụ 4 tháng, khử trùng và gieo cấy hạt vào mơi trường thích hợp Sau 3 tháng gieo cấy thì tất cả các hạt đều nầy mầm tốt, tỉ lệ đạt được là > 85% trên môi trường MS + 1 mg/I NAA và môi trường MS + 1 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA
- Sang giai doan nhan nhanh: Chéi lan Dendrobium anosmum phat trién va nhay chdi rat tốt trên môi trường MS + 2mg/1 BA, ở thời gian 3 tháng sau khi cấy đạt 3,17chôi, chỗi cao 20,6 mm Môi trường MS không bỗ sung BA cho kết quả nhân chồi rất thấp Đồng thời khi sử dụng BA ở nồng độ cao (10mg/l) vào môi trường nhân chồi cũng cho kết quả tạo chồi thấp (1,5 chồi), xuất hiện chồi dị dạng, cây phát triển yếu
- Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: Chéi lan Dendrobium anosmum tao ré tét nhất trên môi trường MS + 1 mg/I NAA Sau 3,5 tháng tạo được cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuân đê đưa ra ngoài vườn
Như vậy, sau thời gian 9,5 tháng thì từ hạt lan gieo cấy đã cho ra được cây lan con hồn chỉnh có thể đưa ra ngoài vườn trồng
Qui trình vi nhân giống lan Dendrobium mini
- Giai đoạn nhân chồi: Chồi lan Dendrobium mini phat triển và nhay chdi rat tốt trên
môi trường có bơ sung | mg/l BA Xét về tính kinh tê thì mơi trường MS/2 + Img/I BA cho hiệu quả cao hon trong việc nhân nhanh choi lan Dendrobium mini Sau 2 thang nhan choi thì đã 3,8 chơi, chôi cao 1,26em
_ 7 Su tao ré lan Dendrobium mini: m6i truong MS/2 + 0,2 mg/l NAA cho két qua ra ré tot va lai cé tinh kinh tê hơn so với các môi trường MS Sau 2 tháng, chôi lan tạo rễ tôt thành cây hoàn chỉnh đê đưa ra vườn ươm
- Thử nghiệm ra cây trên nhiều loại giá thể khác nhau thì thấy rằng đối với lan Dendrobium mini trong giai đoạn đầu nuôi trồng (từ cây mới ra mô đến khi cây được 7,5 tháng tuổi) thì giá thể thích hợp nhất cho cây là dớn và dừa miếng
Như vậy, sau 4 tháng nuôi cay da cho ra duge cay lan con Dendrobium mini hoan chỉnh có thể đưa ra ngoài vườn trồng Cây con thuần dưỡng l tháng trong vườn ươm với chế độ chăm sóc đặc biệt Sau đó đưa ra vườn trồng
Trang 6MUC LUC
TƯỜI Cảm Ơn - c1 SH Si Si SE ni Ki TK Ti KT Ki Tà ni ni KHE cà i
Phan tóm tắt ¿L1 2 12221112211 11121 1112111 111115111 1111 1111110111111 1E 1k HH ii
MUC LUC 2c cece cee cence eee e eee n ences eee e ee eG eA EEE E EEE EG EERE EG EE EMCEE EE EEE E EEE EE EE EEE EE EE EE iii Danh sách bảng - - SH ST TT TH nu nh nh nh ng nh vi Danh sách hình .- - c9 31301 31 91 1 90 S0 SE ni Ti nh ni ni kg He Vii
Danh mục các chữ viết tắt iii
CHUONG I MO DAU wel
I MUC TIEU VA NOI DUNG NGHIEN CỨU - 2 2222 2232222 + vs xzx 1
80/0 ‹3 1
2 Nội dung CS SH ST nh TT nh ni TH ni nh nh nh kg 2
II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VỊ NGHIÊN CỨU - ¿+ +2 3+ 22+ £+++zzzvs2 2 1, DGG o.ị-ciiaiiadđiaaaŸÃÝẢ 2
2 PHAM Vi oo cece cece eee e ence cee nee een en ee ence EEA EERE EG EG EERE EE EG EGE; EEE GEE EE EE EH EEE E EES 2
II CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . - : + +5555+ 3
1 Co sO ly T8 ““- 3
1.1 Giới thiệu về giống lan Dendrobium . 2 c5: 1E 322222113 * + czxeesrrx 3
1.1.1 Phân loại và phân bố - - + 1 2111222211211 1112281 1111151111115 811 11s 3
1.1.2 Đặc điểm hình thái 4
1.1.3 Lan Gia hac (Dendrobium anosmum)
1.1.4 Lan Dendrobium miHi .- cà Sàn SH vn tt vn cv sen 7
1.2 Gid thé tréng lan oo Ả 7
1.3 Lan rig Viét Nam 20.00 ee cece cee ce cree cec eee ec eeceen eee eeaeeeeeeeaeeaeee eee eeeneeeeee 9
1.4 Hiện trạng canh tác hoa lan ở Việt Nam và trên thế giới . . - +: 10 1.5 Thành tựu nuôi cấy mô ở Việt Nam và trên thế giới - <+ +55 25s +52: 11 1.5.1 Tr6n thé giGi oo ccccccccccscccecessceececsseeeceesseeescessseseeescesseeeceesseeesenssaeeess 11
1.3 11 1.6 Tam quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật LÍ
1.7 Những khó khăn và lợi ích trong nhân giống in vifro -+ « -12
1.7.1 Khó khăn . - cSScnn S1 SH Ynnnv ng ng nen TH ng nh như 12 5/0 13
Trang 71.8 Các yếu tố liên quan đến phương pháp vi nhân giống - - +: 5 +s+ 5<: 14
1.8.1 Qui trình vi nhân giống . ¿+ 2 1322212111122 1111581111251 xxe 14
1.8.2 Các thành phần trong môi trường nuôi cấy mô thực vật .16
2 Mô tả các phương pháp nghiên cứu liên quan đã được thực hiện 18 IV PHƯƠNG PHÁP TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm - + 2c E222 22132 *++22x£++xsc+zssx 19
2 Phương tiện nghiên cứỨu - - - <1 S2 S9 SH vn nh nh nh chư 19 3 Phương pháp nghiên cứu .- - - c2 SH hs ng 20 3.1 Lan Dendrobium đïIOSIMHN s75 SĂ SE Set sen 20 3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát một số môi trường gieo hạt thích hợp cho hat lan Dendrobium
2280 he e 20
3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng BA (6 — Benzyl — aminopurine) lên sự nhân chôi lan Dendrobiu a1OSIHHHI . - << << 22 3.1.3 Thi nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trréng NAA (Naphthalene acetic acid) lén sy tao rễ cho lan Dendrobium đH10SINHHH ò 5 << 5555 + 23 3 2 Lan Dendrobiuim HÌHÌ 5c c SE SE SE nh sen 23 3.2.1 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu môi trường ni cấy mơ thích hợp cho việc nhân chéi lan Dendrobium HHÌHÌ ch vn Tnhh nh ch nh 23 3.2.2 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của NAA với hai loại môi trường cơ bản là
MS và MS/2 lên sự tạo rễ từ chồi lan - - -2- - 222 +E2EEEE SE cv vế 24
3.2.3 Thí nghiệm 6: Thử nghiệm ra cây lan Dendrobium mỉni trên các loại giá thể khác
CHƯƠNG II KET QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ PHÂN TÍCH KÉT QUA
1 Lan Giả hạc (DendrobiUI' A10SIHHHN) 5< cc 5+0 38010131301 10 1111x111 vvvvey 1 Thí nghiệm 1: Khảo sát một số môi trường gieo hạt thích hop cho hat lan Dendrobium
2U e e e 27
2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh tường E BA ¬ _Benzy! - aminopurine) lên sự nhân nhanh chéi lan Dendrobium anosmum tre, .28 3 Thí nghiệm 3: Khảo sát một số môi trường tạo rễ giống Dendrobium anosmum
Trang 8
3 Thí nghiệm 6: Thử nghiệm ra cây lan Dendrobium mini trén cac loai giá thể khác nhau
— 40
4⁄08000.0020.4in0ie 001010577 45
1, KẾt luận 2c 1 211221 112312111123 1111111111111 11 1110111111111 11k 45
b0 ‹ 01) 0 am 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 2 322132221 13253 1135111121152 1 235151111511 48
Trang 9DANH SACH BANG
Bang Tựa bảng Trang
1.1 Các loại lan rừng có trữ lượng nhiều hoa đẹp được thị trường nước
ngoài ưa chuộng 9
1.2 Ký hiệu các nghiệm thức theo môi trường cấy hạt lan 22
13 Ky hiéu cdc nghiém thite theo méi trudng cay chéi lan Dendrobium
anosmum 22
1.4 Ký hiệu các nghiệm thức thí nghiệm nhân chồi lan Dendrobiwm mini 24 1.5 Các nghiệm thức thí nghiệm tạo rễ lan Dendrobium mini 24
1.6 Các giá thể chọn làm thí nghiệm trồng lan 25
2.1 Két qua gieo hat lan Dendrobium anosmum 27
2.2 Anh huéng cia néng d6 BA dén sy nhan chéi lan Dendrobium
anosmum thoi diém 70 NSKC 28
2.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự nhân chdi lan Gia hac Dendrobium
anosmum thoi diém 80 NSKC 29
2.4 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự nhân chồi lan Gid hac Dendrobium
anosmum thoi diém 90 NSKC 30
2.5 Mẫu lan Giả hạc tạo rễ ở thời điểm 30 NSKC 33 2.6 Mẫu lan Giả hạc tạo rễ ở thời điểm 60 NSKC 33 2.7 Mau lan Gia hac tao rễ ở thời điểm 105 NSKC 34
2.8 Ảnh hưởng của BA lên sự nhân chỗi lan Dendrobium mini 30 ÑSKC 36 2.9 Ảnh hưởng của BA lên quá trình nhân nhanh chdi lan Dendrobium mini
45 NSKC 37
2.10 Ảnh hưởng của BA lên quá trình nhân nhanh chdi lan Dendrobium mini
60 NSKC 38
3.11 _ Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự tạo cây hoàn chỉnh của lan
Dendrobium mini 39
3.12 Ảnh hưởng của giá thể trồng lên sự phát triển của của lan Dendrobium
mini 15 NSKT 41
3.13 Ảnh hưởng của giá thể trồng lên sự phát triển của của lan Dendrobium
mini 30 NSKT 41
3.14 Ảnh hưởng của giá thể trồng lên sự phát triển của của lan Dendrobium
mini 195 NSKT 42
Trang 10
DANH SÁCH HÌNH
Hình Tựa hình Trang
1.1 Hoa lan Dendrobium anosmum 6
1.2 Hoa lan Dendrobium mini 7
13 Su tao thanh chéi ngang (a) va chdi bat định (b) 13
14 Các bước cơ bản của vi nhân giống 14
1.5 Hiệu quả của sự tương tác NAA và BA trên cây Bowiea volubilis 18 1.6 Hoa lan Dendrobium anosmum và trái lan được thụ 20 1.7 Qui trình khử trai va gieo hat lan Dendrobium anosmum 21
18 Chuẩn bị vật liệu trồng và bồ trí thí nghiệm 26 2.1 Số lượng chồi lan Gia hac Dendrobium anosmum tạo trên mơi trường có
BA ở thời điêm 70, 80, 90 NSKC 31
2.2 Lan Giả hạc ra hoa trong keo nuôi cấy 32 2.3 Qui trinh vi nhan giéng lan Dendrobium anosmum tit hat 35
2.4 Qui trình nhân giéng lan Dendrobium mini 43
2.5 Một số hiện tượng trong quá trình sinh truéng cia lan Dendrobium mini 44
Trang 11
DANH MUC CAC KY HIEU VA CHU VIET TAT BA HLCC MS NAA NSKC NSKG NSKT NT Tp HCM 6 - Benzyl - Aminopurine Hoa lan cây cảnh
Murashige & Skoog 1- Naphhalene Acetic Acid Ngày sau khi cấy
Ngày sau khi gieo Ngày sau khi trồng
Nghiệm thức
Thành phó Hồ Chí Minh
Trang 12CHUONG I
MO DAU
Nói đến hoa lan thì ai cũng nghĩ ngay đến một loài hoa vương giả, thanh cao vì hoa lan khơng chỉ rất đẹp mà giá trị lại rất cao Ngày nay, nhờ kỹ thuật nhân giống hiện đại bằng phương pháp nuôi cây mô hỗ trợ cho phương pháp nhân giống cổ truyền theo kiểu tách chiết, nên đã nhân được số lượng lớn lan giống cung cấp cho thị trường hoa lan, vì thế giá thành của cây lan cũng tương đối dễ chịu hơn Cũng từ đó thú chơi lan trong dân ta ngày càng phát triển thông qua các Hội thi hoa lan ngày càng đa dạng và phong phú hơn Hơn thế nữa, Hoa lan đã dan dần chiếm vị trí cao trong các bàn tiệc, hội nghị, lễ, đám cưới, bằng cách trang trí giỏ hoa, lẵng hoa, bình hoa, và hoa cài áo, trang điểm cơ dâu Do đó Hoa lan đang được xem là một loại hoa trang trí quan trọng và
có giá trị kinh tế cao, là mặt hàng xuất khâu chiến lược của nhiều quốc gia
Chang han chi v6i loại hoa chủ lực là Dendrobiưm, Thái Lan đã xuất khâu đạt
doanh thu gần 600 triệu USD mỗi năm Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, năm 2000, tổng sản lượng lan bán ra thị trường đạt xấp xi 100.000.000 USD, trong đó Phalaenopsis chiém 75% (Griesbach, R.J 2002) Bên cạnh đó, ở các nước phát triển như: Anh, Mỹ, Đức, Ý, Singgapore, Hồng Kông đều nhập ¡ khẩu rất nhiều phong lan Việt Nam chúng ta cũng có nhiều triển vọng kinh doanh xuất khẩu phong lan (Huỳnh Văn Thới, 2005)
Với kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bảo thực vật, thì ngồi các ưu điểm là khả năng nhân giống nhanh với hệ số nhân cao trong thời gian ngắn, có thé nhân được từ nhiều bộ phận khác nhau của thực vật, tạo ra cây giống sạch bệnh Xa hơn nữa, thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô sẽ tạo ra nguồn vật liệu lai tạo ra cây giống mới có được các đặc tính ưu việc chỉ với thời gian ngăn Ưu điểm nữa của nuôi cây mô là giúp
cho việc nây mầm của hạt lan Vì hạt lan có đặc tính là chỉ có phơi mà khơng có (hoặc có q ít) phơi nhũ và kích thước hạt quá nhỏ khó nây mầm ngoài tự nhiên Nên ngoài phương pháp nhân giống cô truyền là tách chiết với tốc độ nhân giống rất chậm, người
ta phải sử dụng kỹ thuật gieo hạt trong ống nghiệm Ngoài ra, nhân giỗng bằng hạt cũng được áp dụng cho công tác lai tạo giống mới, đặc biệt là hoa Lan
Tuy nhiên, một yếu tố không kém phần quan trọng quyết định đến sự thành cơng của qui trình nhân giống bằng nuôi cấy mô là việc đưa cây mô ra vườn ươm với tỷ lệ
sống cao Do đó, dé tai “Nhan giéng lan Dendrobim anosmum va Dendrobium mini
bằng phương pháp nuôi cấy mô Nghiên cứu các loại giá thé trong lan Dendrobium
mini thich hợp và cho hiệu quả cao” được thực hiện nhắm nhân nhanh hai loài lan này
và nghiên cứu qui trình ra cây lan mô cho tỷ lệ sống cao để cung cấp cây giống cho thị trường hoa lan trong và ngoài tỉnh
I MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1 Mục tiêu:
- Đưa ra qui trình vi nhân giống lan Dendrobium anosmum bang phuong phap
nuôi cây hạt lan giúp cho việc nhân nhanh và bảo tơn lồi hoa q hiêm này của nước ta
- Đưa ra qui trình vi nhân giống lan Dendrobium mini nhằm nhân nhanh loài hoa lan này đề cung câp cây giông cho thị trường hoa lan trong và ngoài tỉnh
Trang 13_ 7 Nghién ciru qui trình ra cây của cây lan cấy mô nhằm giúp gia tăng tỉ lệ cây sông sau khi đưa ra ngoài
2 Nội dung
Nghiên cứu môi trường gieo hạt thích hợp cho hạt lan, môi trường nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh lan Dendrobium anosmum (Gia hac)
Nghiên cứu mơi trường ni cấy thích hợp cho việc nhân nhanh và tạo cây hoàn chinh cho lan Dendrobium mini
Nghiên cứu anh hưởng của các yếu tố bên trong và bên ngoài, giá thể trồng ảnh
hưởng đên sự sông và phát triên của của lan con Dendrobiưm mini từ phòng thí nghiệm Ta ngồi vườn
II ĐÓI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1 Đối tượng
1.1 Lan Denbrobium anosmum thuộc giỗng Dendrobium, là loài lan rừng của Việt Nam cịn có tên Giả hạc Đây là đối tượng quý hiếm và đặc biệt chỉ có ở Việt Nam, Lào, Thái Lan, Philippines, New Guinea, Borneo, Indonesia, Malaya and Sri Lanka Dac diém cua gidng là sai hoa, hoa to, đẹp và có hương thơm nên rất được ưa chuộng Hiện nay giống lan này đang rất được ưa chuộng trong và ngoài nước, trong khi việc nhân giống bằng tách chiết thông thường không kịp đáp ứng nhu cầu
Cây lan giống (cây mẹ) được mua về từ Đà Lạt và trồng tại vườn lan của Trường Đại học An Giang Sau đó thụ phan tạo trái lan Khi trái được 4 tháng thì cắt đem vào
phịng thí nghiệm khử trùng và cấy vào môi trường nuôi cấy
1.2 Lan Ðendrobium mỉni, theo hướng dẫn của Công ty Long Đỉnh thì đây là một giống mới được lai tạo từ Thái Lan và mới được du nhập vào nước ta Đặc điểm của loài này là cây chỉ cao 15 — 20 cm, số hoa trên cành 6-12 hoa, thời gian hoa tàn 2,5 — 3 tháng, Thời gian từ cây seedling đến ra hoa khoảng 4 — 5 tháng nếu nuôi tốt Do đặc điểm cây nhỏ gọn lại siêng hoa, thời gian ra hoa nhanh nên rất phù hợp cho trang trí nội thất, đám tiệc, Nên cần nhân nhanh và rộng giống lan Dendrobium mini để cung cấp cho thị trường hoa tươi
2 Phạm vỉ nghiên cứu
Trong thế giới các loài hoa, hoa lan được coi là loài hoa vương giả, nữ hoàng của các loài hoa Bởi vì hoa lan không những đẹp về màu sắc mà còn đẹp cả về hình dáng Cái đẹp của hoa lan thể hiện từ những đường nét của cánh hoa, câu trúc đặc biệt quyến rũ của môi lan, cho đến những điểm xuyên ngộ nghĩnh trên các lá lan, hay cấu trúc đa dạng của thân lan Nhiều loài hoa lan, nhất là các loài lan rừng Việt Nam, có
hương thơm rất nồng nàn và quyến rũ như Giáng hương, Giả hạc, Ngọc điểm
Trang 14Loài lan Denbrobium anosmum hiện đang rất được các nghệ nhân Việt Nam và thế giới ưa chuộng Do loài lan này có hoa rất to, đẹp, lại có hương rất thơm Hiện thị trường trong nước một cây lan giả hạc với một đơn vị nhỏ cũng phải giá cả trăm ngàn, nếu là đơn vị lớn thì hàng trăm đến triệu đồng Do giá trị cao nên hiện Đài Loan đã lai tạo ra loài Giả hạc Hawaii va dang dugc rất nhiều nước ưa chuộng, ngay cả Việt Nam cũng đã nhập cây giống của loài này Như vậy để thấy việc bảo tồn, lai tạo và nhân giống loài lan này là rất cần thiết
Tuy nhiên, hiện nay vấn đề làm cho các phịng cấy mơ trong nước không phát
triển mạnh được, một : trong các nguyên nhân là việc không tiêu thụ được cây cây mô Vì
người dân khó biết để tìm mua Phần khác họ không biết cách ra cây nên tỉ lệ thất thốt ra đưa cây mơ ra vườn là rất cao, do đó họ rất e ngại khi mua cây con từ các chai mơ
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài này cũng nhằm để nghiên cứu qui trình vi nhân giống hai loài lan này nhằm cung ứng nhu câu cây giống cho thị trường Mặt khác thông qua đề tài nghiên cứu qui trình ra cây con cấy mô nhằm gia tăng tí lệ cây mô sống sau khi đưa ra ngồi Sau đó có thể triển khai hướng dẫn kỹ thuật cho các nghệ nhân trông lan
II CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Cở sở lý thuyết
1.1 Giới thiệu về giống lan Dendrobium 1.1.1 Phân loại và phân bố Thuộc lớp một lá mam: Monocotyledones
Bộ: Orchidales
Họ: Orchidaceae
Họ phụ: Epidendroideae Tông: Epidendreae
Giống: Dendrobium
Họ Orchidaceae có khoảng 750 chi, 25.000 loài, chiếm vị trí thứ hai sau họ Cúc
trong ngành thực vật hạt kín và là họ lớn nhất trong ngành một lá mầm Các loài trong
hệ thống này phân bố rất rộng, do đó hình thái và cấu tạo cũng hết sức đa đạng và phức tạp (Dương Công Kiên, 2006)
Theo Huỳnh Văn Thới (2005), tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Grec
Dendron nghĩa là cây gỗ và bios là tôi sống Dendrobium là giống phụ sinh, sống trên cây gỗ Có người gọi là Hồng Lan, có người gọi là Đăng Lan Dendrobium có trên
1.600 loài và chia thành 2 dạng chính:
+ Dang đứng (Dendrobium phalaenopsis) thường mọc ở xứ nóng, chịu a am va rat siêng ra hoa: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hi, Ý thảo, Thủy tiên, Sonia,
+ Dạng thòng (Dendrobiưm mobile) chịu khí hậu mát mẽ: Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp vàng,
Với 1.600 lồi khác nhau địi hỏi nhiều cách chăm sóc khác nhau, nguyên do là
Trang 15_ Ở Việt Nam, Dendrobium có đến 100 lồi, xếp trong 14 tông được phân biệt
băng thân (giả hành), lá và hoa (Nguyên Công Nghiệp, 2004)
1.1.2 Đặc điểm hình thái
Theo Nguyễn Cơng Nghiệp (2004) thì khơng có một hình dạng chung nhất về hoa và dạng cây do sô lượng quá lớn, phân bố rộng rãi Riêng giong lan Dendrobium đều có bộ phận sinh dưỡng như rê, thân, giả hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, trái
Rễ: Cây có hệ rễ khí sinh, có một lớp hút âm dày bao quanh gồm những lớp tế bào chết chứa đầy khơng khí nên rễ ánh lên màu xanh bạc Vì vậy rễ hút được nước
mưa chảy đọc trên vỏ cây gỗ hay nước lơ lửng trong không khí, hơi sương và hơi nước, giúp cây hút dinh dưỡng và chất khoáng, mặt khác giúp cây bám chặt vào giá thể, khơng bị gió cuốn Một sơ lồi có thân lá kém phát triển thậm chí tiêu giảm hồn tồn, có hệ rê chứa diệp lục tố giúp cây hấp thụ ánh sáng cần thiết cho sự ra hoa và quang hợp
(Nguyễn Công Nghiệp, 2004)
Rễ của lan Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị mục nát và cây bị chêt (Dương Công Kiên, 2006)
Rễ lan Dendrobium cũng giống như rễ lan Vũ nữ, Cattleya thuộc loại rễ bán gió Nhóm này thường có rễ nhỏ nhưng rất nhiều rễ, chủ yếu bám vào giá thể, vào thân cây dé hút dưỡng chất dính vào giá thể như nước, cho nên khi trồng vào chậu, phải dé giá
thể nhiều hơn, gần như toàn bộ rễ đều bám vào giá thể, vào thành chậu, chỉ có một số ít
rễ chìa ra ngồi Đối với lan rễ bán gió phải trồng với giá thể nhỏ hơn và nhiều hon, dé
bộ rễ bám dày đặc hút nhiều dưỡng chất v.v (Huỳnh Văn Thới, 2005)
Giá thể của lan Dendrobium có cấu tạo tương tự như các loài thuộc giống Cattleya, nghĩa là chậu phải thật thơng thống và khơng úng nước Tuy nhiên do bản năng sinh học và cấu trúc thực vật với giả hành có thân, các lồi thuộc giống Dendrobium có thể dùng giá thể hơi âm hơn Cattleya chút ít nhưng khơng được làm thối căn hành Vì thế một số loài lan Dendrobium có thể phát triên trên các giá thể là xơ dừa hay cả quả dừa, dùng như một cái chậu chứa sẵn giá thể Cũng có thể trồng lan Dendrobium với căn hành cách đáy chậu khoảng 3 cm, rồi rải thật thoáng xung quanh căn hành một số rễ lục bình giặt sạch Với cách trồng này thì kích thước chậu và cây phải thật tương xứng Tuy nhiên giá thé than và gạch vẫn tỏ ra hiệu quả nhất (Nguyễn
Công Nghiệp, 2004)
Thân: Theo Nguyễn Cơng Nghiệp (2004) thì Dendrobium thuộc nhóm đa thân (cịn gọi là nhóm hợp trục) có hệ thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ
Một số Dendrobium lá chỉ có ở các mam non, là loài chống tàn chúng vàng úa và rụng vào mùa thu, thân phì to giơng như củ khơng có lá là nơi dự trữ năng lượng
(Trân Văn Bao, 1999)
Giá hành: Giả hành là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mât nước và dự trữ chât dinh dưỡng đê nuôi cây trong điêu kiện khô hạn khi cây sông bám trên cao Ngồi ra, giả hành cịn chứa diệp lục tô nên có thê quang hợp được (Nguyên Công Nghiệp, 2004)
Trang 16Một số loài ở xứ lạnh chỉ có nhiện vụ dự trữ chất dinh dưỡng nên giả hành
khơng có màu xanh nhưng phía trên có mang lá (Dương Cơng Kiên, 2006)
Lá: Các lá mọc xen kế nhau và ôm lấy thân giả do lá có tận cùng bằng một cuốn hay thuôn dải xuống thành bẹ ơm thân, hình dạng và cấu trúc lá rất đa dạng (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)
Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng Dạng lá mềm mại mọng nước nạc, dai, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tuỳ thuộc vảo vị trí sống của cây Phiến lá trãi rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gắp lại theo gân giữa như hình chữ V Những lá sát dưới gốc đôi khi giảm đi chỉ còn những bẹ không phát triển hay giảm hẳn thành vảy (Dương Công Kiên, 2006)
Các loài thuộc giống Dendrobium vùng nhiệt đới nói riêng và họ Orchidaceae
nói chung đôi khi trút lá vào mùa khô hạn Sau đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp
mưa thì cho chồi mới (Trần Văn Bảo, 1999)
Hoa: Theo Nguyễn Cơng Nghiệp (2004) thì Dendrobium thuộc nhóm phụ ra
hoa ở nách lá Chồi hoa mọc từ các mắt ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cả
trên ngọn cây Sự biểu hiện trước khi ra hoa khác biệt như có nhiều loài rụng hết lá
trước khi ra hoa Thời gian ra hoa đầu mùa mưa hay đầu tết (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)
Giống Dendrobium khi đủ dinh dưỡng thì cho hoa thành chùm, phát hoa đài và
thời gian ra hoa trung bình 1- 2 tháng (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)
Trái: Họ Orchidaceae đều có quả thuộc quả nang, khi hạt chín, các nang bung ra chỉ còn dính lại với nhau ở đỉnh và gốc Ở một sơ lồi, khi chín quả không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi quả bị mục nát (Dương Công Kiên, 2006)
Hạt: Những hạt giống không chứa các chất dinh dưỡng do gió gieo vãi, để được nây mầm cần có nắm cộng sinh hỗ trợ các chất cần thiết, đặc biệt ở đầu các giai đoạn phát triển (Trần Văn Huân và Văn Tích Lượm, 2004)
Theo Dương Công Kiên (2006), thì quả chứa 10.000 — 100.000 hạt đôi khi đến 3
triệu hạt có kích thước rât nhỏ nên phôi hạt chưa phân hoá Sau 3 — 5 tháng hạt chín và
phát tán nhờ gió
1.1.3 Lan Giả hac (Dendrobium anosmum)
Dendrobium anosmum xuất xứ từ các nước như Philippin, Malaysia., Lào, Việt
Nam Lindley đặt tên cho lan Giả hạc từ năm 1845 Lan Giả hạc có nhiều trên dãy
Trường Sơn từ Nam ra Bắc (Nguyễn Thiện Tịch, Hội HLCC - Tp HCM được trích bởi
Trần Văn Bảo, 1999)
Trang 17www theorchiddoctor com www.myriadgardens.com Hinh 1.1 Hoa lan Dendrobium anosmum
Lan còn có tên là Dendrobium superbum và ngudi Hawaii goi la Dendrobium honohono có nghĩa là lá mọc đối cách Người Việt chúng ta thường gọi là Dã Hạc, Gia hạc, Lưỡng điểm hạc, Phi diệp Lan thường mọc trên các cành cây ở cao độ khoảng
1000-1300 m tại các rừng cây thuộc Đô Lương, Vinh, Krong Pha, Đà Lạt, Bảo lộc, Đắc
Lắc, Sông Bé, Lộc Ninh v.v (Bùi Bảo Lộc, 2008)
Thân dài tới 1,20 m buông rũ xuống Lá mọc đối cách đài 8 - 12 cm, rộng từ 4- 7 em Hoa to tới 10 em mọc từ 1- 3 chiếc ở các đốt đã rụng lá, nở vào mùa Xuân Dendrobium anosmum có hai màu sắc chính: tím hồng và trắng Tuy nhiên có khá nhiều biến dạng hồng nhạt, hồng thẫm hoặc cánh trắng lưỡi tím, nhưng rất dễ nhằm lẫn với Dendrobium parishii thân ngắn chỉ chừng 30-40 cm và hoa tím sẫm hơn nhiều Hoa có hương thơm ngào ngạt và lâu tàn (3 - 4 tuần lễ) Nhiều hoa trên phát hoa, một cây nếu mạnh khỏe có thể ra tới 50 - 70 hoa (Bùi Bảo Lộc, 2008)
Sau khi hoa tàn, những đốt gần trên ngọn hoặc ở gần dưới gốc thường nầy sinh ra những cây con (keiki) Vài tháng sau, khi các cây con mọc rễ dài chừng 3 - 4 cm có thể tách ra trồng riêng Năm đầu cây này còn nhỏ và ngắn chừng 30 - 40 em và không ra hoa, nhưng sẽ ra hoa vào năm tới Khi đó dưới gốc sẽ ra tới 3 - 4 mầm non, những mầm
cây này mọc mạnh và lớn hơn rất nhiều có thê đạt tới 1- 1,20 m nếu nuôi trồng đúng
cách (Bùi Bảo Lộc, 2008)
Ngoài ra ta cũng có thể nhân giống loài lan này theo phương pháp truyền thống:
Trang 18Người ta trong Dendrobium anosmum véi nhiều vật liệu khác nhau như: mảnh cây dương sỉ, cành cây, mảnh gỗ hay trong chậu với vỏ thông, vỏ đừa v.v nhưng tốt hơn cả là trồng trong chậu gỗ và treo lên bởi vì cây cần thống gió và thống gốc (Bùi Bảo Lộc, 2008)
1.1.4 Lan Dendrobium mini
Nếu như Lan Giả hạc là một loài thuộc nhóm lan rừng Việt Nam có giá trị cao, than thong, thi lan Dendrobium mini lai 1a m6t 1oai lai tạo, thân đứng Loài lan này được lai tạo từ Thái Lan và được du nhập vào nước ta Đặc điểm của loài lan nay là cây dạng
bụi, lùn (chỉ cao 15 — 20 cm), nhưng rất siêng hoa, hoa nở quanh năm Cây nhỏ nhưng nhảy chỗi rất mạnh, nhảy chồi ngay cả trên các thân già hay cây suy yếu Hoa có kích thước không lớn chỉ khoảng 4 x 5 cm nhưng hoa rất đẹp, số hoa trên cành nhiều từ 6 -
13 hoa, hoa rất bền lâu tàn (1,5 — 2 tháng) Thông thường trên một giả hành có tới 3 - 4
phát (cành) hoa, nêu cây tơt có thê lên đên 5 phát hoa
Hình 1.2 Hoa lan Dendrobium mini
1.2 Giá thé tring lan (compost)
Trang 19_ Với một số loài Lan trồng không cần dùng đến giá thể vẫn sinh trưởng tốt, nhưng nêu môi trường sơng có giá thê vân tot hon
Giá thể của lan gồm những thứ dễ kiếm, nhiều khi không cần mắt tiền mua, vì có
săn chung quanh ta Những chât liệu này không phải nước nào cũng dùng như nhau và chúng được chọn tùy theo điêu kiện ngoại cảnh, nhân lực, loài lan và qui mô sản xuât
Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004) và Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2006), thì có các loại giá thê trơng lan và đặc tính của từng loại như sau:
a Than gỗ: trồng lan bằng những thanh than gỗ ngắn, với kích cỡ bằng ngón tay cái, ngón chân cái là vừa Đặc tính của than gỗ là hút nước và giữ ẩm được lâu Nên chọn loại than xốp, với than chắc quá như than đước khơng nên dùng vì khả năng giữ ẩm kém Than không mục như gỗ, cũng khơng có mầm bệnh nên giới nghệ nhân trồng lan không ai chê thứ giá thể quí giá này
b Xơ dừa: Dừa là thé sản của nước mình nên xơ dừa gần như không cần phải
mua, mà mua cũng với giá rẻ Khi cần dùng đến quanh năm lúc nào cũng có Xơ dừa làm giá thể để trồng lan chính là vở của trái dừa khô Xơ dừa được tách ra thành từng mảng lớn, tuỳ theo nhu cầu mà nhà vườn để nguyên miếng, hoặc xé ra, chặt khúc ra để sap xép trong lan trên vạt tre hoặc cho vào chậu Xơ dừa rút ẩm rất tốt, tốt hơn cả than gỗ, nhưng khuyết điểm là mau mục và là nơi đeo bám lý tưởng của rêu và cỏ đại
._ Trong xơ đừa có chất tanin là chất chát, vì vậy trước khi dùng ta nên ngâm nước nhiêu ngày, sau đó vớt ra phơi khô, rôi cân thận hơn nên phun thuôc trừ sâu bệnh,
c Gach: Gach 1a chất hút nước tốt, giữ 4m cao Gạch được nung chín xốp vừa
nhẹ vừa hút nước nhiều Khi dùng làm giá thể, gạch được đập vụn ra từng thanh nhỏ
bằng ngón tay cái Khuyết điểm của gạch là dễ mọc rêu và nang, vi vay it ai trong Lan với giá thê là gach không thôi, mà trộn lẫn với vài giá thể khác như than gỗ hay vỏ
cây hoặc xơ dừa, mỗi thứ một ít
đd Vỏ cây: Trong các loại cây như vú sữa, sao, me, thông, thì vỏ thơng là loại vỏ cây được ưa chuộng nhật vì trong vỏ thơng có chât resin là chat sát khuân cao, lâu mục, không đóng rêu, ít có mâm bệnh nên trông lan rât tôt
Vỏ thông được lấy tir cay thong 2 1a (Pinus merkussi) hoac cay thong 3 14 (Pinus khasya) có nhiêu ở Bảo Lộc và Đà Lạt
Cây lan được trồng bằng vỏ cây thời gian đầu phát triển tốt Sau 1 năm vỏ bị phân huỷ thành mùn, gây úng nước, thối rÊ và cũng là mơi trường thích hop cho sy xuat hién một số lồi cơn trùng can pha rễ Vì vậy khi trồng bằng vỏ cây, cây lan phải được thay chậu thường xuyên
e Dớn: dớn là chất liệu làm giá thể trồng lan mới được sử dụng gần đây thôi Don là chất trồng được lấy từ thân và rễ của cây Dương xi Giống cây thảo này được mọc nhiều ở cao nguyên Đà Lạt Ưu điểm của dớn là giữ âm tốt
Có hai loại dớn: dớn sợi và dớn vụn
- Thứ được ưa chuộng nhất là đớn sợi do thân rễ cây dương xỉ già tạo nên Dớn sợi thích hợp cho việc trơng Lan xứ nóng vì nó có độ thơng thống
Trang 20âm độ thấp, nên phải tưới nudc nhiéu, dén vun bi bit dé lam théi ré lan Ngoi ra diéu kiện nóng âm rât thuận lợi cho một sô loại côn trùng và nâm bệnh chọn dớn làm mục tiêu căn phá
# Rong biễn: rất được ưu chuộng đối với lan Hồ điệp Tuy nhiên, loại giá thể này hút nước nhiêu và giữ âm cao nên hêt sức cân thận khi sử dụng
ø Rễ lục bình: có khắp nơi và rất dễ kiếm Rễ lục bình có độ hút ẩm cao, có nhiều đạm giúp cây ra rễ và tăng trưởng rất mạnh trong thời gian đầu, nhưng dé bị mục
rã nên mắc các khuyết điểm như xơ dừa và đớn vụn
h Phụ phẩm nông nghiệp: vỏ hạt cà phê, vỏ đậu phộng 1.3 Lan rừng Việt Nam
Hiện ở Việt Nam có hai thứ lan: lan bản xứ (lan rừng) và lan lai Rừng Việt Nam
có nhiều loại lan bản xứ rất đẹp, có trữ lượng cao nhưng chưa được điều tra chính xác
Các loại lan rừng Việt Nam phân bố từ đồng bằng đến cao nguyên và cả trên cây bóng
mát ở Tp.HCM (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)
Việt Nam là một trong những nước có lan nhiều trên thế giới, và lan rừng nước ta có rất nhiều lồi q do màu sắc đẹp, hương thơm nồng nàn Đây là ưu điểm chính của lan rừng Việt Nam Mặc dù lan rừng Việt Nam có nhược điểm là mau tàn và kích thước nhỏ hơn các loài lan lai, nhưng vẫn hấp dẫn được nhiều người yêu lan nhờ đa số đều có hương thơm nồng nàn, quyến rũ như Giả hạc, Ngọc điểm, Mỹ đung dạ hương,
Đuôi cáo, Thanh ngọc,
Bảng 1.1 Các loại lan rừng có trữ lượng nhiều hoa đẹp được thị trường nước ngoài ưa chuộng
Stt Tên Việt Nam Tên khoa học
1 Hồng lan Da Lạt Cymbidium insigne 2 Hoang lan Da Lạt Cymbidium iridioides 3 Héng hoang Da Lat C.insigne x C.iridioides 4 Bac lan Da Lat C.eburnum var erythrostylum
5 Tuyét ngọc Coelogyne mooreana
6 Kim hai Paphipedium villosum
7 Vân hài Paphipedium callosum
8 Huyết nhung Renanthera imschootiana 9 My dung da hương Vanda denisoniana
10 Gia hac Dendrobium anosmum
11 Long tu Dendrobium primulinum
12 Kim điệp Dendrobium capillies
Trang 2115 Thuỷ tiên mỡ gà Dendrobium densiflorum 16 Thuỷ tiên tím Dendrobium amabile 17 Thuỷ tiên cam Dendrobium thhyrsiflorum 18 Nhat diém hong Dendrobium draconis 19 Lua vang Dendrobium heterocarpum 20 Hoang phi hac Dendrobium signatum 21 Ý thảo Dendrobium gratiossimum 22 Toc tiên Holeolossum subulifolium 23 Hac dinh Phaius tankervilliae 24 Hoa hoang Ascocentrum miniatum 25 Ngoc diém Rhynchostylis gigantea 26_ Đuôi cáo Aerides multiflora 27 Đại ý thảo Dendrobium aphyllum 28 Lan qué Aerides odorata
29 Long nhãn kim điệp Dendrobium fimbriatum 30 Long chau Papilionanthe pedunculatta 31 Huyết nhung giún Renanthera coccinea 32 Bocap tia Arachnis annamensis 33 Bach vi hd Rhynchostylis retusa 34 Cam bdo Hygrochilus parishii 35_ Uyên ương Christensonia vietnammica
(Nguồn: Nguyễn Công Nghiệp, 2004)
Một số loài lan rừng Việt Nam rat quý, được nước ngoài biết đến và đặt mua với số lượng lớn nhưng ta chưa gây trồng mà chủ yếu khai thác trong tự nhiên nên không đáp ứng được nhu cầu của khách hàng, đồng thời lại vi phạm các điều khoản của Hiệp ước CITES Ví dụ như loài Tuyết ngọc Coelogyne mooreana Sander ex Rolfe, Thanh đạm Coelogyne cristata Lindl., Thanh lan Cymbidium cyperifolium Wall ex Lindl (một trong những loài lan đẹp nhất thế giới), Mạc lan Cymbidium ensifolium (L.) Sw., Gia hac Dendrobium anosmum Lindl., Van hai Paphyopedilum callosum (Reichenb.f.) Stein, Hai dd Paphyopedilum delenatii Guillaume, Kim hài Paphyopedilum villosum (Lindl.) Stein, La gam Ludisia discolor (Ker-Gawl.) A Rich (Nông Văn Duy, Nguyễn Thị Lang và ctv, 2001)
1.4 Hiện trạng canh tác hoa lan ở Việt Nam và trên Thế giới
Thị trường phong lan ngày nay đã trở thành một mặt hàng lớn trên quốc tế, thu rất nhiều ngoại tỆ Ở các nước phát triển như: Anh, Mỹ, Đức, Ý, Singgapore, Hồng Kông, đều nhập khẩu rất nhiều phong lan, Thái Lan là nước xuất khẩu phong lan
Trang 22nhiéu nhất Đông Nam Á Việt Nam chúng ta cũng có nhiều triển vọng kinh doanh xuất
khâu phong lan (Huỳnh Văn Thới, 2005)
Theo điểm tin trên tạp chí Hoa cánh số 10/2008, thì số loại hoa xuất khẩu đi Nhật Bản từ 12 — 19/9/2008: Hoa cúc 0,21 USD/cành, kim ngạch 65.622 USD; Hoa lan 1,50 USD/cành, kim ngạch 8.595 USD; Hoa Hồng 0,15 USD/cành, kim ngạch 6.882 USD (Minh Tú, 2008) Cũng theo bản tin thì ngồi thị trường lớn là Nhật Bản, Trung Quốc cũng là thị trường lớn tiêu thụ hoa tươi Việt Nam nhất là hoa Hồng, Cẩm chướng, Ly ly, Lan, Trung bình thị trường Trung Quốc tiêu thụ gần 576.000 USD hoa tươi của Việt Nam/năm (Minh Tú, 2008) Ngoài ra, Việt Nam cịn có thị trường xuất khâu hoa sang các nước như Đài Loan, Hàn Quốc, Singapore, Tuy nhiên ta lại không có đủ lượng hoa để xuất cho họ, nhất là hoa lan
1.5 Thành tựu nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam
1.5.1 Trên thế giới
Nuôi cấy mô trên thế giới đã có từ rất lâu đời và đến nay đã có các thành tựu rất đáng kể như: vào năm 1978, Melchers lai tạo thành công cây lai giữa Khoai tây và Cà
chua bằng dung hợp tế bảo chất; năm 1990, Vasil và cộng sự tái sinh cây lúa mì hồn chỉnh từ nuôi cây tế bào trần Vasil và cộng sự (1991) báo cáo về tạo cây lúa mì chuyển
gen bằng súng bắn gen vào các phôi non; hay như năm 1994, cây cà chua Favr-savr chuyển gen được chấp nhận cho buôn bán ở Hoa Kỳ,
1.5.2 Ở Việt Nam
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật được phát triển ở Việt Nam ngay sau khi chiến
tranh kết thúc (1975) Phịng ni cấy mô và tế bào thực vật đầu tiên được xây dựng tại viện sinh học, Viện khoa học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu Bước đầu chỉ nghiên cứu sự phát triển của túi phấn, mô sẹo và protoplast, nhưng sự thành cơng thì chỉ có ở 2 cây là lúa và khoai tây Tiến đến những năm 80 trở lại đây thì ni cấy mơ phát triên khá mạnh mẽ và kêt quả khích lệ đã đạt được ở các giông: chi, dứa, mía, hơng, cúc, phong lan, (Nguyễn Đức Thành, 2000) Như kỹ thuật tạo cây lan Cymbidium giống sạch bệnh bằng xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của Nguyễn Văn Uyễn
và ctv (1984) Bước đầu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân
giống lan Hồ điệp của Cung Hoàng Phi Phượng và cv, trích trong Hội nghị khoa học —
Công nghệ sinh học thực vật trong công tác và chọn tạo giống hoa của Dương Tấn Nhựt
(2007) Tiến xa hơn là tạo ra giống lan mới bằng kỹ thuật gây đột biến nhân tạo hoa lan cắt cảnh Dendrobium bằng tia gamma của Lê văn Hòa và ctv, trích trong Hội nghị khoa học — Công nghệ sinh học thực vật trong công tác và chọn tạo giống hoa của Dương Tấn Nhựt (2007) Chuyển gen phát sáng GFP (Green Flourescent Protein) vao cAy Lilium
oriental hybrid “siberia” nho vi khuan Agrobacterium tumefaciens cia Nguyén Thi Ly
Anh va ctv, trích trong Hội nghị khoa học — Công nghệ sinh học thực vat trong công tác và chọn tạo giống hoa của Dương Tấn Nhựt (2007)
1.6 Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Phương pháp này có ý nghĩa vơ cùng to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống
Trang 23* Về mặt thực tiễn sản xuất: Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng q, có giá trị kinh tế cao Hiện nay phương pháp này đã trở thành phổ biến và áp dụng trong công tác chọn ¡giống cây trồng Ngoài ra, bằng phương pháp này chỉ sau thời gian ngăn chúng ta có thể tạo được sinh khối lớn có hoạt chất sinh học được tạo ra vẫn giữ nguyên được hoạt tính của mình (NĐ guyen Đức Lượng, 2002)
1.7 Những khó khăn và lợi ích trong nhân giống in vitro
1.7.1 Khó khăn
Tuy nhân giống ¡z viro đạt được những thành tựu to lớn nhưng cạnh đó đã gặp
khơng ít khó khăn, theo Nguyên Văn Uyên và ctv (1984) thì có một sơ khó khăn sau: - Nhân giống trên môi trường agar thì giá thành sản xuất vẫn còn cao và thời gian nhân giông dài
- - Khi sản xuất ở qui mơ cơng nghiệp thì chỉ phí cho năng lượng và nhân cơng
vân cịn ở mức cao
- Đôi khi xảy ra biến dị soma trong q trình ni cấy, đặc biệt là tái sinh thông
qua mô sẹo
` - Giới hạn sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống do cây con tạo ra thường đồng nhât về mặt di truyền
- Quá trình nhân giống phức tạp
Tính bất định về mặt di truyền
Nhân giống in viro là tạo quần thể đồng nhất với số lượng lớn Tuy nhiên trong một số trường hợp phương pháp này cũng tạo ra biến dị soma, mà tế bào mơ sẹo thì có nhiều biến dị hơn so với đỉnh chồi Những nhân tố thường gây ra biến đị soma là:
+ Kiểu di truyền: các lồi cây khác nhau thì tạo ra các biến dị khác nhau, nói chung cây càng có mức độ bội thê cao thì càng dê biên di
+ Số lần cấy truyền: số lần cấy truyền càng nhiều thì độ biến đị càng cao Amstrong và Phillips (1988) khi nuôi cây dài hạn thường gây ra biên dị nhiễm sắc thê
Ngoài ra, khi cấy truyền nhiều lần, môi trường phát triển các chồi ngang có thé chuyển sang tạo ra các bất định (adventitious Shoots) Kết quả là có thể tạo ra các biến dj té bao soma Vì vậy cây con tạo ra không đồng nhất Đối với mục đích vi nhân giống, sự tạo chồi ngang là kỹ thuật thích hợp đang được sử dụng Theo nguyên tắc, cách này tạo ra đúng kiểu cây (Debergh, 2006)
Trang 24
Hình 1.3 Sự tạo thành chồi ngang (a) va chéi bat dinh (b) (Debergh, 2006)
1.7.2 Những lợi ích
Theo Bùi Bá Bồng (1995), nhân giéng in vitro có những ưu điểm sau: - Tạo các cây con đồng nhất và giống cây mẹ
- So với kiểu nhân giống thông thường (chiết cảnh, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thê nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong
một thời gian ngắn
- Không chiếm nhiều điện tích
- Có thể cung cấp cây giống bất cứ thời điểm nào vì chủ động được, do không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh
- Có thể tạo ra các cây con sạch bệnh bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kết hợp xử lý nhiệt và vi ghép trong ơng nghiệm
- Có thể tạo và nhân được các giống mới bằng kỹ thuật cứu phôi, chuyền gen - Một số cây quí có thể nhân nhanh để đưa vào sản xuất và việc trao đổi giống được dễ dàng
Ngoài ra, kỹ thuật ni cấy mơ cịn giúp cho việc nhân giống hữu tính các đối
tượng quí mà với kỹ thuật nhân giống thơng thường khó thực hiện được (như trường
hợp gieo hạt lan) Bởi vì như chúng ta biết, trái lan có tới hàng triệu hạt Tuy nhiên hạt lan không chứa albumin và có một phơi chưa phân hố vì thé su nay mam cua hat rat khó khăn trong điều kiện tự nhiên, tỉ lệ nây mầm rat thap (khoang 1 phan triệu) Do đó để nhân giống lan bằng hạt có 3 phương pháp: nẫy mầm cộng sinh nắm, nây mầm không cộng sinh và hiện nay người ta dùng phương pháp gieo hạt hoàn toàn mới đó là phương pháp gieo hạt xanh (sau khi thụ tinh trái lan sẽ được đem vào phịng thí nghiệm khử trùng và mồ trái trong điều kiện vô trùng, vỏ quả được tách ra bằng một dụng cụ đã khử trùng và gieo hạt trực tiếp lên môi trường cây) Ngày nay đã có nhiều công thức môi trường gieo hạt cho từng loại lan (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)
Trang 25Thành phần của môi trường Knudson C (1946) Hoá chất Lượng (g.Ï) Ca(NO2);.4H;O 1,000 (NH4)2SO4 0,500 MgSO¿.7H;O 0,250 KH2PO¿ 0,250 FeSO4.7 HạO 0,025 MnSO, 0,0075 (Nguyễn Thiện Tịch va ctv, 2006)
1.8 Các yếu tố liên quan đến phương pháp vỉ nhân giống
Vi nhân giống là một phương pháp nhân giống hiện đại hay nhân giống vơ tính
trong phịng thí nghiệm
Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây (true-to-type) của một kiểu gen được tuyển chọn bằng cách sử dụng kỹ thuat in vitro Vi nhân giống thông thường là phương pháp nhân nhanh và giảm giá thành Hình 1.3 trình bày một sơ đồ tổng quát quy trình vi nhân giống
mn mau R » thuần
Cây mẹ — (cấy ~> vinhângiông = 907Ẻ am dưỡng =e Cây lớn
many t® Mr KT “ty = x } | 1 ~ 0o mm |” TR ee phan q nhỏ Nuư
cua đạt được đạt được cày
GÀ nhiều chỏi con ra rễ
in vivo in vivo
Cấy in vitro Ex vitro (mơi trường bên ngồi)
Hình 1.4 Các bước cơ bản của vi nhân giống (Nguyễn Báo Toàn, 2004)
Trang 261.8.1 Qui trình vi nhân giống
Qui trình vi nhân giống đã được Debergh và Zimmerman (1991) chia thành 4
giai đoạn khác nhau, môi giai đoạn có một chức năng riêng Sự thành công của công
việc vi nhân giông tuỳ thuộc vào tât cả các giai đoạn (Nguyên Bảo Toàn, 2004)
Invwivo — Giai đoạn 0: Sự chuẩn bị của cây mẹ In viro — Giai đoạn 1: Bắt đầu tiệt trùng
Giai đoạn 2: Nhân
Giai đoạn 3a: Kéo dài
Giai đoạn 3b: Tạo rễ và tiền thuần dưỡng Invwivo — Giai đoạn 4: Thuần dưỡng
Giai đoạn 0 (chuẩn bị của cây mẹ): là chọn cây mẹ hoàn toàn sạch bệnh, tốt
nhât là chọn cây mẹ trong nhà kính Mâu thì lây vào giai đoạn tăng trưởng mạnh nhat
(Nguyên Đức Lượng, 2002)
Giai đoạn này còn được hiểu là cải thiện điều kiện vệ sinh của cây mẹ Phương pháp tưới nhỏ giọt của cây mẹ cho phép cải thiện tình trạng sinh lý của cây me, dé mau cấy tuân thủ theo qui trình cấy Tình trạng sinh lý của cây mẹ cũng như nguồn dùng làm mẫu cấy có thể được cải thiện bởi một số kỹ thuật như ghép nhiều tầng (Nguyễn Bảo
Toàn, 2004)
Giai đoạn 1: Mục đích là thực hiện thao tác cấy Nó là một sự kết hợp giữa một phương pháp tiệt trùng đầy đủ và một tỉ lệ sống cao của mẫu cấy và không bị nhiễm Thơng thường khó đạt thành công 100% trong kỹ thuật vô trùng mâu
Khử trùng mẫu cấy thường được sử dụng các chất diệt nắm bệnh, sản phẩm dùng để khử trùng tốt nhất là các sản phẩm rẻ tiền, không độc với mẫu cũng như đối với người thao tác và hiệu quả loại các vi sinh vật trong một phạm vi rộng (Nguyễn Bảo
Toàn, 2004)
Giai đoạn 2: Q trình kích thích các trung tâm mô phân sinh như đỉnh sinh
trưởng, chơi chính, chơi bên Có nhiêu kiêu tăng tôc độ nhân như cây mắt Trong kỹ
thuật này có hai kiểu tạo chồi, một kiểu tạo chồi từ một mẫu cấy chỉ có một mắt hoặc mẫu cấy có nhiều mắt Cả hai điều tạo ra số chồi nhiều và hệ số nhân tuỳ thuộc vào các đoạn chồi mới tạo thành Phương pháp nhân giống này thường được ứng dụng trên những cây khơng có mầm bệnh (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Phương pháp khác để gia tăng số chồi ở giai đoạn 2 là cấy đỉnh sinh trưởng (meristem culture) hoặc cấy đỉnh chồi (shoot tip culture) Dinh sinh trưởng hoặc chéi có
thể được lấy từ chồi chính hoặc chồi ngang Theo cách cấy này hai kiểu dạng chỗi có thể được tạo thành là chồi dai va cum chéi Ở chéi đài, các chi phát triển lóng dài và
các chồi ngang cũng đài Vì vậy, cây con được tạo ra từ chỗi này có dạng bình thường
Trong khi d6 cum chi tạo ra nhiều chỗi nhưng lóng ngắn nên cây con được tạo ra có thể là cây con hoặc cụm cây con (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Trang 27giống như sự thừa nước, tạo thành bụi rậm, biến đị vơ tính, các vấn đề về rễ và chậm ra hoa (Nguyên Bảo Toàn, 2004)
Giai đoạn 3: Được chia thành hai giai đoạn là giai đoạn kéo dài (3a), kích thích
tạo rễ và tiền thuần dưỡng (3b) Giai đoạn (3a) Kéo dài: Trong nhiều trường hợp sự kéo dài là một yêu cầu cho sự tạo rễ đầy đủ Môi trường kéo dài thường không chứa
cytokinin hoặc một cytokinin yếu hơn cytokinin đã được sử dụng trong giai đoạn 2;
Giai đoạn (3b) Kích thích rễ và tiền thuần dưỡng: Auxin thường được sử dụng để kích
thích tạo rễ Tạo rễ tốt nhất thường đạt được trên môi trường với hàm lượng khống
thấp (ví dụ môi trường Knop 1⁄2) (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
Giai đoạn 4: Nhằm làm giảm tối thiểu sự chết cây con, khi chuyên tir in vitro sang nhà lưới hoặc điều kiện ngoài đồng Trong giai đoạn này các yếu tố cân được quan tâm là tình trạng cây con khi chuyển ra môi trường trồng, và các yêu tố về môi trường như nhiệt độ, âm độ, ánh sáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)
1.8.2 Các thành phần trong môi trường nuôi cấy mô thực vật a/ Khoáng đa lượng: Đạm (N), Lan (L), Kali (K), Magie (Mg), Calci (Ca), Sat (Fe) Nhu cầu khống của mơ, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên (N:; guyén Đức Lượng, 2002)
b/ Khoáng vi lượng: Nhu cầu vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật là lĩnh vực rất ít được nghiên cứu Tuy nhiên nó được chứng minh là không thể thiếu đối với sự phát triển của mô và tế bào Tuy nhiên có những trường hợp, một số khoáng vi lượng là không cần thiết Các nguyên tố vi lượng thường dùng trong nuôi cấy mô là manganese,
boron, kẽm, đồng, cobalt, idodine, molypdenum (Nguyễn Đức Lượng, 2002)
c/ Carbon va nguồn năng lượng: Nguồn carbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp té bao phan chia, tang sinh khối không phải là do quá trình quang hợp cung cấp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường Hai dạng đường thường gặp trong nuôi cấy in vitro là glucose va sucrose Cac nguồn carbohydrate khác cũng được thử nghiệm nhưng hiệu quả kém hơn glucose và
sucrose (Nguyễn Đức Lượng, 2002)
d/ Vitamin: Thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát
triển của chúng để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Các vitamin thường
được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là thiamine (BI), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6), và myo-inositol (Nguyễn Đức Lượng, 2002)
e/ Các hợp chất hữu cơ bố sung không xác định: Các chất bổ sung này là
protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nắm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước
cam, nước cà chua Nhưng hiện nay người ta thường dùng dịch chuối và protein
hydrolysate hơn (Nguyễn Đức Lượng, 2002)
Chat có hoạt tính trong nước dừa được chứng minh là myo-inositol và một số các acid amin khác, lượng nước dừa (lấy từ trái dừa già) dùng trong môi trường thường khá lớn từ 15 — 20% thể tích mơi trường (Nguyễn Văn Uyên va ctv, 1984)
Trong dịch chuối xiêm chín hồn tồn thì có sự chuyển hoá tinh bột thành đường gần như hoàn tồn, ngồi ra cịn có các chất Ca, Fe, P và các vitamin B, C Vì vậy dịch
chuối xiêm chín là nguồn cung cấp đường, khống, vitamin cho mơi trường nuôi cấy
(Nguyễn Tấn Đàm, 1990)
Trang 28f Cac chat diéu hda sinh truéng 6 thwe vat: Theo Dang Phuong Tram (2005),
thì chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật được chú ý vào năm 1928 khi Went phát hiện vai trò của Auxin lên khả năng phát triển tế bào của lúa mạch, đã mở đầu cho việc phát
hiện, ứng dụng chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật vào nuôi cấy mô
Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật là cách gọi chung cho những hợp chất hữu
Cơ có tác dụng kích thích hay ngăn cán đến sự phát triển sinh lý của thực vật, ở một
nồng độ rất thấp (Mai Trần Ngọc Tiếng và ctv, 1991 trích theo Đặng Phương Trâm, 2005 Các chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật có tác đụng điều tiết các quá trình sinh
trưởng và phát triển của cây từ lúc tế bào trứng thụ tỉnh, phát triển thành phôi cho tới
khi cây ra hoa, kết quả là hình thành cơ quan sinh sản, dự trữ và kết thúc chu kỳ sống của mình (Vũ Văn Vụ, 1999 trích theo Đặng Phương Trâm, 2005) Trong nhân giống in vitro ta thường sử đụng hai chất điều hịa sinh trưởng đó là Auxin va Cytokinin
Auxin: Trong môi trường nuôi cấy thì Auxin được kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng để kích thích tạo mô sẹo, huyền phù tế bào và phát sinh hình
thái, đặc biệt là khi sử dụng kết hgp voi Cytokinin (N guyên Đức Lượng, 2002) Trong
quá trình phát sinh hình thái, sự di chuyển của Auxin có vai trò trong việc thiết lập tính hữu cực của cơ quan thực vật và tác động theo nồng độ trong sự phát sinh cơ quan (Bùi
Trang Việt, 2001)
Các Auxin được dùng phổ biến: + 2,4-D (2,4- Dichlorophenoxyacetic) + IAA (indole 3- aceticacid)
+ IBA (indole 3- butyric acid) + NAA (1-naphhalene acetic acid)
Trong đó 2,4-D là một đạng Auxin mạnh rất cần thiết trong sự biệt hố để tạo
mơ sẹo, tuỳ theo mục đích mà 2,4-D được sử dụng riêng lẽ hay kêt hợp với các Auxin khác (Nguyên Văn Uyên và ctv, 1984)
Cytokinin: Trong nuôi cấy mơ thực vật Cytokinin có tác dụng làm phân chia tế bào, nó ảnh hưởng rõ rệt lên sự phát sinh choi, kích thích phân chia chôi và định hướng phân hoá tê bào Khi trong mơi trường có chứa nơng độ Cytokinin thích hợp thì các
mâm bên của đỉnh chôi sẽ phát triên thành chôi (Đặng Phương Trâm, 2005)
Nếu tỷ lệ Auxin/Cytokinin thấp thì sẽ kích thích thành lập chỗi, ngược lại thì sẽ hình thành rễ, còn nếu ở một mức độ cân bằng thì thuận lợi cho sự phát triển mơ sẹo Vì
vậy chúng ta có thê sử dụng Cytokinin kêt hợp với Auxin theo một tỷ lệ nào đó đề thu được các sản phâm như mong muôn (Nguyên Đức Thành, 2000)
Các Cytokinin phổ biến dùng để phân hóa chéi thân mầm và chồi rễ mam: + BAP (6 - benzyl - aminopurine)
+ Zea (zeatin) + Kinetine
Từ lâu người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng giữa tỉ lệ Auxin và Cytokinin có ý nghĩa rât quyết định trong quá trình phát sinh hình thái của nuôi cây m6 in vitro cũng như trên cây nguyên vẹn Nêu Auxin cao hơn Cytokinin thì kích thích sự tạo rễ
cịn ngược lại thì kích thích sự tạo chi (Vũ Văn Vụ, 2001 trích theo Nguyễn Đức
Trang 29Thí nghiệm về hiệu quả của sự tương tác NAA và BA trên cây Bowiea volubilis NAA mg/l 0 0.1 1 40 0 0.1 BA mgíI 1 10
Hình 1.5 Hiệu quả của sự tương tác NAA và BA trên cây Bowiea volubilis (Debergh,
2006)
Theo các nghiên cứu của nhiều tác giả đã cho thấy tỉ lệ auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự thành lập tạo chồi và rễ Một tỉ lệ cao cytokinin và auxin thấp thích hợp cho sự tạo chổi Trong khi tỉ lệ cao auxin va cytokinin thấp thích hợp cho sự tạo rễ, mức độ trung gian giữa hai tỉ lệ này thích hợp tạo callus Hình 1.5 là thí nghiệm các mức độ BA và NAA khác nhau trên sự thành lập chổi và rễ trên cây Bowiea volubilis
2 Mô tả các phương pháp nghiên cứu liên quan đã được thực hiện
Có rất nhiều các nơi thực hiện kỹ thuật gieo cấy hạt lan như Công ty Long Đỉnh (Tp Hồ Chí Minh), Cơng ty Tân Xuân, hay như trong sách Nuôi Cây Mô - tập 3 của Dương Công Kiên (2006), sách Kỹ Thuật Nuôi Trông Hoa Lan của Nguyễn Thiện Tịch (2006), nhưng chỉ là qui trình gieo cây do các tác giả thực hiện mà ít có thí nghiệm dé so sánh
Tuy nhiên, sau khi gieo hạt lên chỗi rồi thì đây là nguồn vật liệu được các công trình nghiên cứu tiệp theo sử dụng rât phô biên (Dương Công Kiên, 2006) như:
- Gandewijaja (1980), sử r dụng chéi đỉnh dai tir 1- 1,5 mm của cây con gieo hạt in viiro sẽ tạo cụm chdi và tạo rễ Áp dụng cho giống Dendrobium phalaenosis (Dương Công Kiên, 2006)
- Vij va Pathak (1989), dùng chồi bên lấy từ giả hành của cây gieo hạt in vifro được 40 tuân tuôi Sau một thời gian quan sát thây có sự tạo chôi và tạo thành cây từ choi bên Cây con được tái sinh từ chỗi bên có tính tê bào ôn định (Dương Công Kiên,
2006)
Trang 30- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường, vitamin, và điều kiện thống khí lên sự tăng trưởng của cụm chôi lan Dendrobium Burana Fancy nuôi cây ïn vifro (Dương Công Kiên, 2006)
- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của đường, loại giá thể (agar hoặc Cocobi) và điều kiện chiêu sáng (tự nhiên hay nhân tạo) lên sự tăng trưởng cua lan Dendrobium Burana
Fancy (Dương Công Kiên, 2006)
- Vi nhân giống lan Dendrobium Sonia: (1) khử mẫu là chéi lan Dendrobium
Sonia, (2) tao cây con in vitro tt choi than, (3) Tao cụm chôi và protocorm từ chôi đỉnh,
(4) nhân giông nhanh protocorm (Dương Công Kiên, 2006)
Ngoài ra, theo Nguyễn Van Uyén (1984), ông cùng với một số ctv đã nghiên cứu
nhân giống lan Cymbidium bằng kỹ thuật nuôi cây đỉnh sinh trưởng; và tạo thé chéi lan Spathoglotis từ hạt trên môi trường nuôi cấy là Knudson C không có chất sinh trưởng
Sau 12 tuần có các khối tế bào trắng mọc từ hạt
Hay như tại Phân viện Sinh học tại Đà Lạt, Vũ Quốc Luận và Dương Tấn Nhựt (2007), bước đầu nghiên cứu kha nang tao chdi hoa Dendrobium Mild Yumi ¡trong nuôi cay in vitro Dau tién ông cũng cho tự thụ trái lan, sau đó khử trùng và cấy hạt hình
thành protocorm và lên chồi tạo cây hoàn chỉnh Và chỗồi lan được sử dụng bố trí thí
nghiệm tạo chồi hoa với các môi trường MSI đến MS9 có sự thay đổi thành phần khoáng Sau 90 ngày kết thúc thí nghiệm thì có một số mơi trường có sự tạo nụ hoa tốt, trong khi một số khác không tạo nụ hoa (Dương Tân Nhựt, 2007)
Tại Trường Đại học Cần Thơ, Lê Văn Hòa và một số ctv (2007), có cơng trình
nghiên cứu khả năng gây đốt biến nhan tao lan Dendrobium udormsri bang tia gamma
(Duong Tan Nhut, 2007)
IV PHUONG TIEN VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU
1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm
Thời gian Địa điểm Công việc
Tháng 2/2006 -— Phịng Ni cấy mô thuộc Nhân giống lan Dendrobium
tháng 7/2007 Khoa Nong nghiép & TNTN - anosmum Trường Đại học An Giang
Tháng 2/2006 -— Phịng Ni cấy mô thuộc Nhân giống lan Dendrobium
tháng 2/2007 Khoa Nông nghiệp & TNTN- mini Trường Đại Học An Giang
Tháng 2/2007 - Vườn lan Khoa Nông nghiệp Thử nghiệm ra cây lan tháng 2/2008 & TNTN - Trường Đại học Dendrobium mini trên các loại
An Giang
2 Phương tiện nghiên cứu
a Dụng cụ
giá thể khác nhau
- Ống đong, ống hút, đũa thủy tỉnh, kẹp dài 25 — 30 em, kéo cắt mẫu cấy
- Dao cắt mẫu cấy (loại số 10)
Trang 31- Đèn cồn, bình tia, bình xịt đựng cồn, giấy thanh trùng
- Cốc thủy tinh chia vạch: 50ml, 100ml, 200ml, 1000ml
b Thiết bị
Cân phân tích, máy đo pH, bếp điện, tủ cấy vô trùng, tủ sấy, tủ lạnh dùng để trữ
hóa chât, nơi hâp thanh trùng môi trường cây mô (autoclave)
c Các hóa chất
- Khoáng đa lượng: KNO;, NH,NO3;, CaCl).2H20, MgSO¿.7H:O, FeSOx.7H;O,
NaaEDTA
- Khoang vi luong: MnS0O4.4H20, ZnSOx4.7H20, H;BO:, KI, CuSO,.5H20,
CuSO¿.5H;O, CoClh.6H20, Na 2Mo0Qy4.2H20
- Vitamin và các chất hữu cơ: Glycine, Thiamine HCI, Pyridoxin HCI, Acid nicotinic
- Duong saccharose va Agar
d Phịng ni mẫu: phịng kín có kệ để các mẫu cấy; hệ thống đèn non chiếu
sáng cho mâu cây 16/24 giờ; phòng được găn máy lạnh nuôi mau cây ở nhiệt độ 26 — 28°C
3 Phương pháp nghiên cứu
3.1 Lan Dendrobium anosmum
3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát một số môi trường gieo hạt thích hợp cho hat lan Dendrobium anosmum
Vật liệu: Trái lan Dendrobium anosmum dugc thy phan tir cay lan giống tại 'Vườn lan Khoa Nông nghiệp & TNTN Trường Đại Học An Giang
b c
Hình 1.6 Hoa và trái lan lan Dendrobium anosmum dugc thụ 4 thắng
Trang 32Qui trình khử trùng và gieo hạt: Trái lan được thụ phấn khoảng 3 - 5 tháng chín sẽ được cắt đem lên phịng Ni cấy mô khử trùng bằng xà phòng 5 phút > rita dưới vòi nước chảy 15 phút > ngâm cồn 70° trong 1 phút (trong tủ cấy vô trùng) —> rữa 3 lần với nước cất 2 lần (trong tủ cấy) —> sau đó ngâm trong clorox 15 phút (trong tủ cấy) —> rữa 5 lần với nước cất | 2 lần (trong tủ cấy) —> Gắp trái ra và xẻ lấy hạt cấy vào môi trường đã được chuẩn bị sẵn (Qui trình khử trái và gieo hạt theo như hình 1.7)
Hình 1.7 Qui trinh khir trai va gieo hat lan Dendrobium anosmum (2.2a: ngâm trái lan trong dung dich clorox; 2.2b,c,d,e: gắp trái ra và xẻ lấy hạt cấy vào
Trang 33Môi trường cấy hạt: Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) (xem phụ chương) với các kích thích tơ BA và NAA với các nông độ và tỷ lệ khác nhau
Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, môi lân lặp lại là một keo
Bảng 1.2 Ký hiệu các nghiệm thức theo môi trường cấy hạt lan
Nông độ BA Nông độ NAA (mg.T) (mg) 0,0 0,2 1,0 0,0 NTI NT4 NT6 1,0 NT2 NTS 2,0 NT3
Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát và ghi nhận ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự nây mâm của hạt lan thông qua các chỉ tiêu: ngày xuât hiện màu xanh; ngày hạt nây chôi; tỷ lệ nây chôi
Thời gian lấy chí tiêu: 30, 45, 60, 75, 90 ngày sau khi cấy
3.1.2 Thi nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng BA (6 - Benzyl - aminopurine) lên sự nhân choi lan Dendrobium anosmum
Vật liệu: Chọn chai có hạt lên mầm tốt ở thí nghiệm 1 cấy sang môi trường nhân chổi đã chuẩn bị sẵn Chỗồi có chiều cao khoảng 10 mm
Môi trường nhân chồi sử dụng là môi trường cơ bản MS, với chất kích thích tố
BA ở nông độ 0; 1; 2; 5, 10 (mg.T)
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức bôn lân lặp lại là 4 keo, mỗi keo cây 4 chôi
Bảng 1.3 Ký hiệu các nghiệm thức nhân chồi lan Dendrobium anosmum
Nông độ BA (mg.I) 0 1 2 5 10 Nghiệm thức A0 AI A2 A3 A4
Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát và ghi nhận ảnh hưởng của chất điều hòa sinh
trưởng BA lên sự nhân chôi lan thông qua các chỉ tiêu:
- Số chồi: lấy trung bình của số chồi mới tạo thành
Trang 34- Chiéu cao chéi (mm): lay trung binh chiéu cao cla cdc chồi mới tạo thành - Số lá: trung bình của tổng số lá trên các chồi mới tạo thành
Thời gian lấy chỉ tiêu: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ngày sau khi cấy _ Xử lý số liệu: SỐ liệu thí nghiệm được tính bằng Microsoft Excel, và xử lý thông kê băng phân mêm MSTATC
3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh
truéng NAA (Naphthalene acetic acid) lén su tao ré cho lan Dendrobium anosmum
Vật liệu: Chọn những chồi có chiều cao khoảng 1,5 cm và số lá 4 - 5 đạt tiêu chuân cây sang môi trường tạo rê đã chuân bị săn
Môi trường tạo rễ sử dụng là môi trường MS với các kích thích tố NAA ở nồng d6 0; 0,5; 1; 2 (mg/l)
Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức được bó trí theo thể thức ngẫu nhiên với bồn lần
lặp lại là 4 keo, môi keo cây 4 chôi
Chỉ tiêu theo dõi: - Số lá trên chồi chính - Số lượng rễ trên chỗi - Chiều đài rễ trung bình (cm) - Số chồi mới tạo thành - Chiều chồi chính (cm)
Thời gian lấy chỉ tiêu: 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 ngày sau khi cấy
_ Xử lý số liệu: SỐ liệu thí nghiệm được tính bằng Microsoft Excel, và xử lý thông kê băng phân mêm MSTATC
3.2 Lan Dendrobium mini
3.2.1 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu môi trường nuôi cấy mơ thích hợp
cho việc nhân chôi lan Dendrobium mini
Vật liệu: Lan Dendrobium mini (dòng D1) được đặt mua từ Công ty TNHH Long Đỉnh dưới dạng chai mô
Chai mô sau khi đem về sẽ được khử trùng cồn và đặt trong phịng ni cấy mô
khoảng 5 - 7 ngày cho ổn định, sau đó được bố trí cấy mẫu vào môi trường nuôi cấy
thích hợp để nhân nhanh chdi
Chọn những chỗi có chiều cao trung bình 1,0 cm bố trí cấy mẫu vào mơi trường nhân chôi đã được chuân bị săn
Môi trường nuôi cấy: Môi trường cơ bản MS va MS/2, với các nồng độ BA
thay đôi từ 0 - 2 (mg.T)
Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí trong phịng ni cấy theo thể thức hồn toàn ngẫu nhiên với 5 lần lặp lại, mỗi lần là 1 keo thủy tinh, mỗi keo được cấy vào
Trang 35Bảng 1.4 Ký hiệu các nghiệm thức nhân chồi lan Dendrobium mini
Môi trường nuôi Nông độ BA (mg.])
cây
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
MS co Cl C2 C3 C4
MS/2 D0 DI D2 D3 D4
Chỉ tiêu theo dõi:
- Số chồi: trung bình số chồi mới tạo thành
- Chiều cao chồi (cm): trung bình chiều cao chồi con cao nhất
- Đặc điểm chồi: đánh giá bằng cảm quan
Thời gian lấy chỉ tiêu: 20, 30, 45, 60 ngày sau khi cấy
_ Xử lý số liệu: Số liệu thí nghiệm được tính bằng Microsoft Excel, và xử lý
thong ké bang phan mém MSTATC
3.2.2 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu sự ảnh hướng của NAA véi hai loại môi trường cơ bản là MS và MS/2 lên sự tạo rễ từ chôi lan
. Vật liệu: Chọn những chỗi có chiều cao khoảng 1,5 em và số lá 4 - 5 đạt tiêu chuân cây sang môi trường tạo rê đã chuân bị săn
_ Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với bốn lần lập
lại, mỗi lân I bình, mỗi bình 4 mâu
Bảng 1.5 Ký hiệu các nghiệm thức thí nghiệm tao ré lan Dendrobium mini
Môi trường nuôi Nong độ NAA (mg.I) cây
0 0,2 0,5 0,7 1,0 MS NTI NT2 NT3 NT4 NTS MS/2 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10
Chỉ tiêu theo dõi:
- Số rễ: Đếm tắt cả các rễ đã hình thành
- Chiều dài rễ: Lấy trung bình 5 rễ dài nhất và đơn vị tính là cm - Ghi nhận đặc điểm chéi: đánh giá cảm quan
Thời gian lấy chỉ tiêu: 15, 30, 45, 60 ngày sau khi cấy Xứ lý số liệu: Dùng Microsoft Excel và phần mềm MSTATC
Trang 363.2.3 Thi nghiém 6: Thi nghiém ra cay lan Dendrobium mini trén
các loại giá thể khác nhau
Vật liệu: Các chdi lan sau khi được cấy vào môi trường tạo rễ khoảng 2 - 3 tháng thành cây hoàn chỉnh (đủ chiêu cao, lá, rê, sức lớn) sẽ đem ra ngồi trơng
Cây lan con có chiều cao từ cổ rễ đến đỉnh thân là 1cm (nếu tính từ cổ rễ đến chóp lá là 3 — 4 cm); cây có từ 4 — 5 lá
Thơng thường thì ta không ra cây ngay mà các keo có cây con được chọn sẽ đưa ra ngồi phịng ni mẫu một thời gian 1 — 2 tuần Sau đó dùng kẹp gắp lôi cây con ra, rữa sạch môi trường agar, đặt cây con lên rổ cho ráo nước, đem ra vườn ươm để ươm
khoảng 3 - 4 tuần (đây là giai đoạn trung gian trước khi bố trí cây con trồng vào chậu thí
nghiệm) Giai đoạn này chú ý che nước tốt cho cây con, tránh đề cây con bị úng nước sẽ
dẫn đến thối rễ và thối thân Sau đó bố trí cây lan con vào chậu đất nung, mỗi chậu một
cây
Bảng 1.6 Các giá thể chọn làm thí nghiệm trồng lan
Nghiệm thức Giá thể trồng lan Cách chuẩn bị giá thê trồng
Tl Dớn Thanh trùng ở nhiệt độ sơi
T2 ®ối chứng) Than Chặt nhỏ ~> ngâm nước
T3 Than + Don (1 : 1)
T4 Vỏ dừa miếng Chặt nhỏ —> ngâm nước vôi —> thanh
trùng ở nhiệt độ sôi
T5 Vỏ dừa xé sợi Ngâm nước
` Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí với 6 nghiệm thức là 6 loại giá thể trồng, với 5 lần lặp lại là 5 chậu, mỗi chậu trồng một cây
Chăm sóc lan:
Tưới nước: mỗi ngày tưới 2 lần
Ánh sáng: thời gian đầu giữ cây trong bóng râm, che mưa cho cây Sau một
tháng chuyền cây ra sáng (ánh sáng 75 — 85%)
Bon phan: sử dụng phân bón lá Đầu Trâu chuyên cho hoa lan (Đầu Trâu 501) tưới môi tuân/lân; phân vi sinh (phân cá) tưới 1 tháng/lân; BI tuân/lân
Chỉ tiêu theo dõi:
- Số lá trên cây: đếm số lá trên chồi chính
- Chiều đài lá (cm): dùng thước đo từ đầu đến chót lá
- Số chồi: đếm số chồi mới hình thành
Trang 37Thời gian lấy chí tiêu: 15, 30, 45, 60, 90, 195 ngày sau khi trồng
Xứ lý số liệu: Các số liệu được thống kê và xử lý theo chương trình Excel và
MSTATC
Hình 1.8 Chuẩn bị vật liệu trồng và bố trí thí nghiệm
(a: giá thể than; b: giá thể đừa; c: Cây con được gắp ra khỏi chai mô; d: Cây con đủ tiêu chuẩn trồng; e: Cây con dạng bụi; £: Cây con được thuần dưỡng trong khay 1 thang; g,
h, i: Cay lan con được trồng vào chậu đất với các loại giá thể khác nhau)
Trang 38CHUONG II
KET QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ PHÂN TÍCH KÉT QUÁ
I Lan Gia hac (Dendrobium anosmum)
1 Thí nghiệm 1: Khao sat một số môi trường gieo hạt thích hợp cho hạt lan Dendrobium anosmum
Hat lan được xem là nguồn vật liệu nhân giống rất có ý nghĩa Bởi vì, hạt là nơi sạch tương đối trên 95% Vì hạt là phôi, là nơi mà các tác nhân gây bệnh hại khó có thể tấn cơng tới, ngay cả các bệnh hai do vi khuẩn hay virus Do đó, khi nhân giống từ hạt sẽ tạo ra nguồn cây giống tương đối sạch bệnh
Tuy nhiên, việc nhân giống bằng hạt cũng có mặt hạn chế Đó là cây con tạo ra không được xác định chắc chăn về kiểu hình (đối với hạt lai) Nhưng việc nghiên cứu mơi trường gieo hạt góp phần rất lớn cho các nghiên cứu khác về gieo hat lai tạo, nham đáp ứng nhu cầu thị trường hiện nay là tạo ra các giống, loài hoa lan mới có những đặc
tính mà người ta mong muốn
Trái lan sau khi được khử trùng, xẻ lấy hạt cấy vào môi trường cơ bản MS có bổ
sung BA va NAA voi cac nong độ khác nhau Hạt lan mới gieo sẽ rất mịn và có màu trắng Sau 30 ngày gieo cấy thì hạt bắt đầu chuyển hóa và có màu xanh (hình 2.3 b), và 75 ngày sau khi gieo (NSKG) thì tất cả các hạt lan đều nay chéi thanh cay con (hinh 2.3c) Ta có kết quả trình bày theo bang 2.1
Bảng 2.1 Kết quả gieo hat lan Dendrobium anosmum
Nghiệm NAA BA Ngày bắt đầu Hạt có Hat nay Hat nay
thức xuấthện màuxanh chồi75 chồi90
(mg) (mgl) màu xanh 60 NSKG NSKG NSKG (NSKG) NTI 0 30 + + +++ NT2 1 30 + + + NT3 2 30 +++ ++ +++ NT4 0,2 0 30 +++ ++ ++ NT5 0,2 1 30 ++++ ++ ++++ NT6 1 0 30 ++++ ++ ++++ Ghi chu:
+ : Hạt có màu xanh, hat nay chồi < 50 % ++ : Hạt có màu xanh, hạt nay chdi 50 % - 69%
Trang 39Ta thấy rằng đối với nghiệm thức NT5 (môi trường MS + I mg BA + 0,2 mg
NAA) va NT6 (MS + 1 mg.I NAA) thi sau 60 NSKG déu cho tỷ lệ hạt có màu xanh là cao nhất, và cũng cho tỷ lệ hạt nây chồi cao nhất ở 90 NSKG là > 85 % Bên cạnh đó nghiệm thức NT2 (MS + 1 mg.F BA) cho tỷ lệ hạt có màu xanh ở 60 NSKG thấp nhất, và tỷ lệ hạt nây chồi cũng thấp hơn các nghiệm thức khác Điều này chứng tỏ môi trường MS có BA và NAA kết hợp với tỷ lệ thích hgp (5 : 1) sé cho hat nay chéi tốt hơn Và với môi trường MS có NAA cao ở mức 1 mg.I cũng cho kết quả tương tự
Mặt khác, đối với nghiệm thức NTI thì ban đầu kết quả cho hạt lan nay chéi không tốt (thấp nhất), nhưng sau đó đến thời gian 90 NSKC thì lại cho kết quả thay đổi Tỷ lệ nay chéi ở 90 NSKC của hạt là ở khoảng 70 - 84% Điều này do trong một số keo
trong nghiệm thức NTI đột nhiên tăng trưởng vượt lên làm cho số liệu chênh lệch so với ban đầu Có lẽ do hạt trong keo này bản thân có khả năng thích ứng cao, sinh trưởng
mạnh hơn, và qua thời gian lâu dài (3 tháng trong keo cấy) đã thích nghỉ tốt và thê hiện
đặc tính rõ hơn Tuy nhiên, do giới hạn của đề tài nên khơng có điều kiện nghiên cứu sâu vào hiện tượng này
Tóm lại, nghiệm thức NTS (môi trường MS + 1 mg BA + 0,2 img NAA) va NT6 (MS + 1 mg NAA) là hai mơi trường thích hợp nhât cho hạt lan nây mâm
2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng BA (6 — Benzyl - aminopurine) lên sự nhân nhanh choi lan Dendrobium anosmum
Với các mẫu chồi của hạt lan Gia hac nay mam, cdc chéi có chiều dài ban đầu
trung bình khoảng 1,0 cm cấy vào môi trường MS bổ sung BA có nồng độ biến thiên từ 0— 10 mg.T Ở thời điểm 10 ngày sau khi cấy (NSKC), chồi mới đã bắt đầu xuất hiện ở các nghiệm thức, tuy nhiên sự khác biệt là không đáng kể Do mẫu mới cấy nên mới bắt đầu cảm ứng được với môi trường mới, việc xuất hiện chồi mới có khả năng là do cây
có chứa hàm lượng cytokinin nội sinh cao, nên tự có khả năng nây chéi
Vào thời điểm 70, 80, 90 NSKC, chồi mới đã xuất hiện đầy đủ ở các nghiệm thức, với sự khác biệt về số chồi, hình dạng chồi và số lá
Bảng 2.2 Ảnh hướng của nồng độ BA đến sự nhân choi cia lan Gia hac (Dendrobium anosmum) vao thoi diém 70 NSKC
Nghiệm thức BA (mg.I) Số chồi Số lá Chiều cao
chôi (mm) A0 0 1,33 b 2,00 c 10,21 Al 1 2,08 ab 4,17 a 14,67 A2 2 2,83 a 3,6 ab 14,67 A3 5 1,67 b 2,67 be 17,00 A4 10 1,17b 2,00 10,00 F * * ns CV (%) 27,4 37,57 21,8
Ghi chú: Các nghiệm thức trong cùng một cột theo sau cùng chữ giống nhau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%; *: khác biệt ở mức ý nghĩa 5%
Trang 40Kết qua thống kê tất cả các nghiệm thức ở 70 NSKC cho thấy đã có sự khác biệt Về chỉ tiêu số chồi, nghiệm thức A2 có số chồi cao nhất là 2,83 chồi, khác biệt so với các nghiệm thức còn lại ở mức ý nghĩa 5%, nhưng không khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức A1 Nghiệm thức A4 là nghiệm thức cho số chôi trung bình thấp nhất 1,17 chồi, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức khác Đồng thời, nghiệm thức A1 lại là nghiệm thức cho số lá trung bình cao nhất 4,17 lá, không khác biệt thống kê so với nghiệm thức A2 (3,6 lá), khác biệt so với các nghiệm thức còn lại
Và nghiệm thức A4 cũng là nghiệm thức có số lá trung bình thấp nhất 2,00 lá, bằng với nghiệm thức A0, và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức A1, A2
Về chiều cao trung bình, mặc dù ta thấy nghiệm thức A3 có chiều cao chồi là
cao nhất 17,00 mm, trung bình là nghiệm thức A2 và A1 (14,67 mm), trong khi nghiệm thức A4 và A0 có chiều cao chồi rất thấp, thấp nhất là nghiệm thức A4 (10,00 mm) Tuy nhiên, giữa các nghiệm thức lại khơng có sự khác biệt về mặt thống kê
Bảng 2.3 Ảnh hướng của nồng độ BA đến sự nhân chồi của lan Giả hac (Dendrobium anosmum) vao thoi diém 80 NSKC
Nghiém thire BA(mgl) Số chồi Số lá Chiều cao chỗi
(mm) A0 0 133 b 217 c 12,75 Al 1 2,08 ab 4,00 a 19,40 A2 2 2,88 a 3,57 ab 17,60 A3 5 1,67 b 2,80 b 14,10 A4 10 1,17 b 2,67_be 13,50 F * * ns CV (%) 27,86 16,74 21,17
Ghi chú: Các nghiệm thức trong cùng một cột theo sau cùng chữ giống nhau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%; *: khác biệt ở mức ÿ nghĩa 5%