Xây dựng quy trình tái sinh giống sa nhân tím (Amomun Longiligulare T.L.Wu) bằng phương pháp nuôi cấy mô

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi cây sa nhân tím Sau 45 ngày nuôi cấy .... Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thíc

ĐÀO DUY HƯNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH GIỐNG SA NHÂN

TÍM (Amomum Longiligulare T.L.Wu) BẰNG PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY MÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2013

ĐÀO DUY HƯNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH GIỐNG SA NHÂN TÍM

(Amomum Longiligulare T.L.Wu) BẰNG PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY MÔ

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Mã số : 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học PGS TS Ngô Xuân Bình

Thái Nguyên - 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực, chưa được công bố trong bất kỳ công trình hay tạp chí nào khác ở trong nước cũng như ở nước ngoài

Thái Nguyên, ngày 19 tháng 8 năm 2013

Học viên

Đào Duy Hưng

Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Ngô Xuân Bình là thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình

nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cám ơn:

- Tập thể các anh chị đồng nghiệp Bộ môn Công nghệ tế bào - Viện Khoa học Sự sống đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành công việc nghiên cứu của mình

- Tập thể các thầy cô giáo Bộ môn Khoa học sự sống, trường Đại học khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian sinh hoạt học tập tại Bộ môn

Cuối cùng tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình đã luôn khuyến khích, động viên cũng như chia sẻ những khó khăn với tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành nghiên cứu của mình

Xin chân thành cảm ơn!

Học viên

Đào Duy Hưng

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây sa nhân 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây sa nhân 3

1.1.1.1 Nguồn gốc và phân bố cây sa nhân 3

1.1.1.2 Phân loại cây sa nhân tím 4

1.1.2 Đặc điểm thực vật học 4

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái 4

1.1.2.2 Đặc điểm sinh thái 6

1.1.2.3 Đặc điểm sinh lý 7

1.1.3 Tiêu chuẩn chất lượng và giá trị 9

1.1.3.1.Tiêu chuẩn chất lượng 9

1.1.3.2 Giá trị 9

1.2 Tình hình nghiên cứu về cây sa nhân 11

1.2.1 Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây sa nhân bằng nuôi cấy mô trên thế giới 11

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây sa nhân bằng nuôi cấy mô ở Việt Nam 11

1.3 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 12

1.3.1 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật 12

1.3.2 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 14

1.3.3 Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào 15

1.3.4 Một số công trình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ở trong nước 17

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 20

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 20

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 20

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 20

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.2.1 Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu 21

2.2.2.2 Giai đoạn tái sinh chồi 23

2.2.2.3 Giai đoạn nhân nhanh cụm chồi 25

2.2.2.4 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 27

2.2.2.5 Giai đoạn vườn ươm 29

2.2.3 Xử lý số liệu 30

2.2.4 Điều kiện thí nghiệm 30

2.2.4.1 Thí nghiệm in vitro 30

2.2.4.2 Thí nghiệm thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên 30

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất đến khả năng vô trùng mẫu sa nhân tím làm vật liệu khởi đầu 31

3.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của H 2 0 2 20% đến khả năng vô trùng mẫu 31

3.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl 2 0,1% đến khả năng vô trùng mẫu 33

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi cây sa nhân tím (Sau 45 ngày nuôi cấy) 35

3.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả năng tái sinh chồi 35

3.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi 37

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến hiệu quả nhân chồi cây sa nhân tím 38

3.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi 39

3.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả nhân chồi 41

3.3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả nhân chồi 43 3.3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả nhân chồi 45 3.3.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA đến hiệu quả nhân chồi 47

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra rễ chồi sa nhân tím 49

3.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi sa nhân tím 49 3.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi sa nhân tím 51

3.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến sự thích ứng cây sa nhân tím in vitro ngoài điều kiện tự nhiên 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

Bảng 3.3 Ảnh hưởng BAP đến khả năng tái sinh chồi 35

Bảng 3.4 Ảnh hưởng Kinetin đến khả năng tái sinh chồi 37

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi 39

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả nhân chồi 41

Ảnh hưởng của giá thể đến sự thích ứng cây sa nhân

Hình 3.1 Ảnh hưởng của H202 20% đến khả năng vô trùng mẫu 32 Hình 3.2 Ảnh hưởng của HgCl2 0.1% đến khả năng vô trùng mẫu 33 Hình 3.3 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi

35

Hình 3.4

Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi; A:

Hình 3.5 Ảnh hưởng Kinetin đến khả năng tái sinh chồi 37

Hình 3.6

Ảnh hưởng của Kinetinđến khả năng tái sinh chồi cây

sa nhân tím; A: Công thức đối chứng ; B: Công thức 5 38

Hình 3.7 Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi 39

Ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả nhân chồi; A:

Hình 3.11 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả

Hình 3.16 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA đến hiệu quả

nhân chồi; A: công thức đối chứng; B: Công thức 3 48

Hình 3.17 Ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi sa nhân

Hình 3.18 Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi sa nhân

Hình 3.19

Ảnh hưởng riêng rẽ của NAA và IBA đến hiệu quả ra

rễ chồi sa nhân tím; A: Bổ sung 0,6 mg NAA/l; B: Bổ sung 0,6 mg/l IBA

52

Hình 3.20 Ảnh hưởng của giá thể đến sự thích ứng cây sa nhân

Hình 3.21

Ảnh hưởng của giá thể đến sự thích ứng cây sa nhân tím in vitro ngoài điều kiện tự nhiên; A: Giá thể đất phù sa (ĐC); B: Giá thể đất phù sa + trấu hun (4:1) 54

18-Quả sa nhân chứa tinh dầu với nhiều hợp chất hóa học giá trị như: camphen, β-pinen, limonen, camphor; borneol, saponin [12] Tinh dầu sa nhân có tác dụng kháng khuẩn và nấm [21], [26], [30], [36] Sa nhân được sử dụng trong nhiều bài thuốc đông y như: Chữa có thai bị lạnh bụng, đầy hơi, tiểu tiện không thông; chữa tiêu chảy; chữa ăn không tiêu, nôn mửa, đau bụng; chữa đau nhức răng; chữa tê thấp…[11] Ngoài ra, sa nhân được biết đến là loại gia vị đắt thứ ba trên thế giới sau Saffron và vanilla [22]

Cây sa nhân đang bị khai thác tự do nên ngày càng bị thu hẹp về diện tích, giống sa nhân tím cũng bị mất dần và thoái hóa Nếu không kịp thời trồng mới, khoanh nuôi bảo vệ và tác động những biện pháp tích cực thì những nguồn gen cây trồng có giá trị cao cũng dần bị mất Hiện nay, Việc trồng và phát triển diện tích cây sa nhân tím đang được triển khai ở nhiều địa phương tạo được thu nhập cao cho người nông dân Với giá 8.000 – 10.000 đ/kg quả sa nhân tươi, sau khi phơi là 150.000 - 200.000 đ/kg quả khô thì sau trồng 2 năm đã cho thu nhập 6 - 8 triệu đồng/ha và những năm tiếp theo còn cao hơn [15]

Để giải quyết vấn đề phát triển cây dược liệu, khắc phục những khó khăn trên đòi hỏi phải có một hệ thống giải pháp toàn diện về quản lý, quy hoạch vùng nguyên liệu, qui trình công nghệ Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào cho hệ số nhân giống cao mà các phương pháp nhân giống khác

khó có thể đạt được, cây giống đồng đều, sức sinh trưởng cao và sạch bệnh [25], [31] đã thực sự trở thành giải pháp cần thiết trong công tác giống cây trồng, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn cây dược liệu

Xuất phát từ yêu cầu thực tế, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy

trình tái sinh giống Sa Nhân tím (Amomum Longiligulare T.L.Wu) bằng phương pháp nuôi cấy mô”

Mục đích nghiên cứu

Xây dựng thành công quy trình tái sinh giống sa nhân tím có năng suất cao bằng phương pháp nuôi cấy mô nhằm góp phần bảo tồn tài nguyên di truyền thực vật và làm cơ sở cho việc nhân nhanh loài cây dược liệu này, cung cấp nguồn cây giống chất lượng cao để mở rộng vùng dược liệu sa nhân trong nước

Ý nghĩa của đề tài:

- Ý nghĩa khoa học

+ Kết quả nghiên cứu đưa ra một số quy trình kỹ thuật vi nhân nhân giống cây sa nhân tím bằng phương pháp in vitro Từ đó, đánh giá được tác động của một số chất điều tiết sinh trưởng trong nhân giống cây sa nhân tím

+ Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo phục vụ nghiên cứu, giảng dạy và sản xuất giống sa nhân tím thương phẩm có năng suất cao

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây sa nhân

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây sa nhân

1.1.1.1 Nguồn gốc và phân bố cây sa nhân

Nhìn chung các loài sa nhân (trong đó có sa nhân tím) chỉ thấy ở vùng có khí hậu nhiệt đới, chủ yếu ở Châu Á

Theo cách phân chia tiểu vùng khí hậu theo quan điểm địa lý thực vật thì sa nhân tím mọc tự nhiên ở Việt Nam (chủ yếu ở các tỉnh phía Nam) nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm, với hai mùa mưa và khô khá rõ rệt Mùa mưa tập trung vào vụ hè hay vụ hè – thu, mùa khô ở các điểm có sa nhân tím mọc tự nhiên ở các tỉnh phía Nam thường trùng với các tháng là mùa đông và xuân ngoài miền Bắc Trong tổng số 4 –

5 tháng mùa khô đó, có 2 – 3 tháng hoàn toàn không có mưa, nhưng do sống trong môi trường rừng ẩm, Sa nhân tím vẫn sinh trưởng phát triển tốt Đặc biệt là vụ hoa cuối tháng 3 đầu tháng 4, do không bị mưa, trời luôn có nắng nên tỷ lệ đậu quả của cây khá cao

Từ năm 1992 đến nay, sa nhân tím đã được thu thập đưa ra trồng ở một số địa phương ở các tỉnh phía Bắc (Tân Lạc- Hoà Bình, Chân Mộng - Đoan Hùng – Phú Thọ, huyện Bảo Thắng và thị xã Lào Cai – Lào Cai, Đại Từ – Thái Nguyên) Mặc dù cây được trồng ở môi trường khí hậu – thời tiết hơi khác với nơi mọc tự nhiên, nhưng sa nhân tím vẫn sinh trưởng phát triển tốt và ra hoa kết quả nhiều

Đặc trưng khí hậu ở những địa điểm trồng sa nhân tím kể trên là: Khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, có mùa đông lạnh, mưa tập trung vào mùa hè – thu và mỗi năm cũng có 1 – 2 tháng được coi là

khô hạn Tuy nhiên mức độ khô hạn ở đây không đến mức cực đoan như ở các tỉnh phía Nam

Tóm lại, đặc điểm cơ bản về khí hậu đối với sa nhân tím là nền khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm, nhiệt độ trung bình năm vào khoảng trên 230C Cây đem trồng ở các tỉnh phía Bắc mặc dù có mùa đông lạnh tương đối kéo dài, nhưng vẫn sinh trưởng phát triển tốt Điều đó chứng tỏ,

sa nhân tím có khả năng thích nghi khá cao với điều kiện thời tiết ở các vùng tiểu khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm tại Việt Nam [17]

1.1.1.2 Phân loại cây sa nhân tím

Cây sa nhân tím có tên khoa học là Amomum longiligulare T.L.Wu

các lá vảy màu nâu Lá mọc so le, xếp thành 2 dãy, mọc xiên hướng lên phía trên Lá gần như không có cuống, mọc so le, xếp thành hai dãy Phiến

lá hình elip dài 20 – 40 cm, rộng 5 - 8 cm, gốc lá hình nêm, mặt trên màu lục đậm, mặt dưới nhạt hơn, nhẵn, cuống lá dạng bẹ, dài 5 – 10 cm hoặc hơn Lưỡi bẹ nhỏ, hình mác nhọn dài 1,5 – 4,0 cm, màu nâu nhạt hoặc xám trắng, mỏng

Cụm hoa bông, mọc từ thân rễ và từ gốc; cuống cụm hoa dài 3 – 6

cm, gồm nhiều đốt, có vảy màu nâu Có 5 – 8 hoa trên một cụm, màu trắng; cuống hoa rất ngắn Lá bắc ngoài hình bầu dục, màu nâu, dài 2,0 – 2,5 cm, rộng 0,8 cm, mép nguyên; lá bắc trong dạng ống, màu nâu nhạt, dài 1,5cm, đầu chia thành 2 thuỳ nông Đài hoa dạng ống, dài 1,5 cm hoặc hơn, màu trắng hồng, đầu xẻ 3 thuỳ Tràng hoa hình ống, dài 1,6 – 1,7 cm, mặt ngoài có lông thưa, gồm 3 thuỳ, thuỳ giữa dài 1,6 cm, rộng 0,4 cm, lớn hơn

2 thuỳ bên Cánh môi hình thìa, dài 1,7 - 1,8 cm, rộng 2,0 – 2,2 cm, đầu cánh môi thường cuộn ra phía sau; vệt giữa cánh môi màu vàng, kéo dài lên đến đầu cánh môi, có 3 sọc tím hồng Bộ nhị dạng bản, dài 0,6 – 0,7 cm, rộng 0,3 cm, nhẵn; bao phấn 2 ô; trung đới có mào, chia thành 3 thuỳ Bầu hình trứng thuôn, dài 0,4 – 0,5 cm; vòi nhuỵ mảnh (dạng chỉ) dài 2,0 – 2,5 cm; đầu nhụy dạng phễu

Quả dạng quả nang, hình trứng hay gần hình cầu, dài 1,3 – 1,6 cm, đường kính 1,2 – 1,3 cm; chia thành 3 múi nông; vỏ ngoài có gai ngắn, dày; màu tím nâu; khi già gai ngắn bớt và chuyển sang màu tím đen Hạt nhiều gồm từ

13 – 28 hạt xếp thành 3 ô, có áo hạt màu trắng, vị hơi ngọt Hạt hình đa cạnh, màu nâu đen, cắn vỡ có vị cay, mùi thơm của tinh dầu [2], [4]

1.1.2.2 Đặc điểm sinh thái

* Đặc điểm sinh thái chung của cây sa nhân tím: Cây ưa ẩm, hơi

ưa sáng và chịu bóng Thường mọc tụ tập thành đám dày đặc trên đất ẩm

ở ven rừng kín thường xanh còn nguyên sinh hay đã trở nên thứ sinh; ven

bờ các khe suối hay trên các nương rẫy thấp đã bỏ hoang, liền kề với rừng

Sa nhân tím mọc tự nhiên trong các quần xã thứ sinh kể trên ở các tỉnh phía Nam, thường có độ tán che từ 10 – 60%; độ cao dưới 600 m Thuộc vùng có khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm; nhiệt độ trung bình khoảng hơn 230C; lượng mưa từ gần 1.600 đến 3.300 mm/năm; độ ẩm không khí trung bình trên 80%

Cây sinh trưởng phát triển gần như quanh năm, nhưng mạnh nhất vào mùa mưa ẩm Sa nhân tím ra hoa quả đều hàng năm Tái sinh tự nhiên chủ yếu bằng hạt và bằng cách mọc chồi từ thân rễ

Sa nhân tím là cây có biên độ sinh thái rộng, dễ trồng và có thể trồng được ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, từ vùng núi thấp đến trung du

và cả ở đồng bằng [17]

* Thổ nhưỡng đất đai: Sa nhân tím mọc tự nhiên ở các tỉnh phía

Nam nhìn chung là ở trên loại đất nâu - đỏ phát triển trên bazan hoặc nâu

đỏ phát triển trên bazan có mùn tích tụ ở chân núi (K’Bang – Gia Lai, Vĩnh Thạch – Bình Định, Sơn Hoà - Phú Yên…) Đặc điểm chung của loại đất này là có tầng đất mặt sâu, tỷ lệ hạt sét cao, tơi xốp, dễ thấm nước Tuy nhiên, sa nhân tím là cây thường mọc ở chỗ đất thấp (ven rừng, thung lũng, gần hành lang ven suối), nên ở đây loại đất nâu - đỏ bazan kể trên ít nhiều đã có sự thay đổi, do quá trình thường xuyên được tích luỹ thêm bởi lớp thảm mục nên ở tầng đất mặt có màu nâu xám và nâu đen Hàm lượng mùn và lân tổng số khá cao, nhưng kali lại thấp

Sa nhân tím trồng ở Tân Lạc – Hoà Bình; Chân Mộng – Đoan Hùng

– Phú Thọ; Quân Chu - Đại Từ – Thái Nguyên; ngoại ô thị xã Lào Cai – Lào Cai… loại đất ở đây thuộc nhóm feralit vàng – đỏ hay đỏ – vàng Về cấu tượng cơ bản cũng có tỷ lệ hạt sét cao, tơi xốp, dễ thấm nước, dễ bị rửa trôi như loại đất đỏ – nâu hay nâu - đỏ trên bazan Song điểm khác biệt cơ bản của các loại đất ở các điểm kể trên thường nghèo về mặt dinh dưỡng, với hàm lượng mùn, kali và lân tổng số thấp hơn (khoảng 30%) so với đất nâu - đỏ hay đỏ – nâu trên bazan

Ngoài ra, sa nhân tím đem trồng thí nghiệm trên đất phù sa sông Hồng (Trung tâm Nghiên cứu Lâm đặc sản và Trung tâm Cây thuốc Hà Nội

ở Thanh Trì - thuộc Viện Dược liệu), cây vẫn sinh trưởng phát triển bình thường và ra hoa kết quả nhiều Điều đó chứng minh, sa nhân tím cũng có khả năng thích nghi cao đối với một số loại đất có quá trình lập địa khác nhau [17]

1.1.2.3 Đặc điểm sinh lý

* Nhu cầu nước và độ ẩm: Nước và độ ẩm không khí là một nhân

tố sinh thái quan trọng đối với quá trình sinh trưởng phát triển của cây sa nhân tím Nhờ có nước, rễ sa nhân tím mới hấp thụ được các chất hữu cơ và chất khoáng hoà tan trong nước để thực hiện quá trình đồng hoá Trong những tháng mùa khô ở các tỉnh phía Nam, cây sa nhân mọc tự nhiên ở rừng vẫn thực hiện thoát hơi nước để mát lá và sinh trưởng phát triển tốt là do nước ngầm và độ ẩm trong không khí từ quần xã rừng cung cấp

Nhu cầu nước đối với cây sa nhân khi mới trồng là rất quan trọng Nước tưới sẽ làm cho đất ở gốc được lèn chặt hơn (so với không tưới) Mặt khác, nước làm cho đất ẩm, duy trì cho các nhánh sa nhân tím luôn được tươi, tạo điều kiện ra rễ và mọc chồi Sau khi cây sa nhân tím đã mọc

và cho đến suốt quá trình sinh trưởng về sau, mặc dù không cần tưới,

nhưng do có hệ thống rễ chùm phát triển rất mạnh nên có khả năng hút được nhiều nước ngầm trong đất Đặc biệt khi sa nhân tím đã phát triển thành thảm dày đặc (sau 2 năm tuổi), chúng còn có khả năng giữ nước cho đất

Tuy nhiên, cây sa nhân tím không chịu được ngập úng lâu ngày Vào thời kỳ ra hoa, nếu gặp trời mưa sẽ ảnh hưởng tới khả năng thụ phấn và tỷ lệ kết quả Điều đó có thể giải thích một phần tại sao vụ hoa tháng 4 – 5 thu được nhiều quả gấp 4 lần so với vụ hoa tháng 7 – 8 có mưa nhiều (cây trồng ở các tỉnh miền Bắc)

* Nhu cầu ánh sáng: Ánh sáng đối với sa nhân tím cũng là

một nhân tố sinh thái cần và đủ Có ánh sáng cây mới thực hiện được quá trình quang hợp và đồng hoá Trong môi trường tự nhiên, sa nhân tím thường mọc xen dưới tán những cây bụi và cây gỗ, với độ tàn che từ

10 – 60%; thậm chí có chỗ tới 70% Tuy nhiên, ở độ tàn che trên 40% cây sinh trưởng mạnh về chiều cao

Ánh sáng là nhân tố cần thiết của cây Song với độ tán che từ 10 – 20% (hoặc 30%) có lẽ là thích hợp nhất cho sa nhân tím sinh trưởng phát triển mạnh Trong trường hợp có những đám sa nhân tím mọc dày đặc, không có cây che bóng trực tiếp mà vẫn sinh trưởng phát triển tốt là do ở xung quanh đó (ở đường biên) có những cây gỗ hay cây bụi Vấn đề quan trọng nhất ở đây chính là môi trường đất còn đủ ẩm Vì thế chưa bao giờ thấy sa nhân tím xuất hiện ở những nơi đất khô cằn

* Nhu cầu về dinh dưỡng khoáng: Cây sa nhân tím mọc tự

nhiên cũng như trồng đều cần các chất hữu cơ và chất khoáng để cho cây sinh trưởng và phát triển Những chất này là do lớp thảm mục và các sản phẩm thứ cấp từ động vật rừng cung cấp

Vấn đề này còn phụ thuộc vào các nhân tố khác, nhưng chắc chắn nhu

cầu lân (P2 O5) là quan trọng đối với quá trình đậu quả và cho quả có hạt chắc Sa nhân là cây trồng lấy quả, bởi vậy trong quá trình chăm sóc cần chú ý cung cấp thêm các chất hữu cơ, chất khoáng trong đó không thể thiếu phân lân [17]

1.1.3 Tiêu chuẩn chất lượng và giá trị

1.1.3.1 Tiêu chuẩn chất lượng

* Tiêu chuẩn chất lượng:

Theo dược điển Việt Nam III (2002) [8]

- Hạt khô còn nguyên cả khối, hình trứng hay hình gần tròn, màu nâu đen Tỷ lệ hạt rời ra dưới 10% Độ ẩm còn lại dưới 14%

- Quan sát từng hạt rời riêng rẽ thấy bề mặt hạt nhẵn (nếu hạt lấy từ quả non sẽ có bề mặt nhăn nheo), màu nâu đen; có vị cay, mùi thơm của tinh dầu

- Hàm lượng tinh dầu trong hạt đạt tỷ lệ trên 1,5%

* Thành phần hoá học:

Trong sa nhân có chừng 2-3% tinh dầu Thành phần chủ yếu của tinh dầu là d.bocneola (19%), d.campho (33%), axetat bocnyla (26,5%), d.limonen (7%), camphen (7%), phelandren (2,3%), parametoxyetylxinamat (1%), pinen (1,8%), linalola, nerolidola ….Năm 1958, hệ dược Viện y học Bắc Kinh có nghiên cứu thấy loài sa nhân Amomum villosum Lour có saporin với tỷ lệ 0,69% [11]

1.1.3.2 Giá trị

* Giá trị kinh tế:

Sa nhân là loại dược liệu có giá trị sử dụng trong nước và xuất khẩu cao Hàng năm, từ nguồn sa nhân mọc tự nhiên ở Việt Nam đã khai

thác thu mua được khoảng 100-300 tấn (quả khô) sử dụng trong nước và vài trăm tấn xuất khẩu

Giá thu mua sa nhân tại chỗ trung bình từ 30.000 đ đến 40.000 đ/kg quả khô (cả vỏ) Giá xuất khẩu 90.000đ đến 120.000 đ/ kg khô (7/năm 2006) [17]

* Tác dụng dược lý:

Tinh dầu sa nhân (các loài trên) có tác dụng ức chế hoạt động của

các loại vi khuẩn: Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Dipcoccus

pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Protues vulgaris, Shigella dysenteriae, Salmonella typhi; diệt amíp trên Entamoeba moshkowskii với

nồng độ ức chế thấp Ngoài ra, sa nhân còn có tác dụng làm hạ sốt

Theo quan niệm của y học cổ truyền (Lính nam bản thảo của Hải Thượng Lãn Ông thế kỷ 18), sa nhân có vị cay, mùi thơm, tính ấm; tác dụng vào 3 kinh thận, tỳ, vị; tác dụng ôn trung, hành khí, chỉ thống, khai

vị, tiêu thực, an thai

* Công dụng làm thuốc:

Sa nhân được sử dụng nhiều để làm thuốc trong y học cổ truyền, nhằm kích thích tiêu hoá; chữa ăn uống không tiêu, bị nôn mửa, đau dạ dày, đau bụng do lạnh, ỉa chảy, kiết lỵ, sẩy thai, bệnh cao huyết áp, cao cholesterol máu…

Lượng dùng 3 – 6 gam một ngày và thường phối hợp với các vị thuốc khác Hiện đã thống kê được khoảng 60 bài thuốc khác nhau có sử dụng sa nhân

Ngoài ra, hạt sa nhân còn được dùng làm gia vị Tinh dầu sa nhân dùng trong kỹ nghệ mỹ phẩm [2] [4], [5]

1.2 Tình hình nghiên cứu về cây sa nhân

1.2.1 Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây sa nhân bằng nuôi cấy mô trên thế giới

Trên thế giới có một số công trình nghiên cứu nhân giống in vitro chi sa nhân (Amomum) Sajina và cộng sự (1997) bước đầu đã xây dựng quy trình nhân giống Amomum subulatum Roxb, đây là loài có giá trị kinh

tế quan trọng nhất ở Bengal - Ấn Độ [37] Rao và đồng tác giả (2003) đã

nuôi cấy in vitro Amomum longiligulare T.L.Wu, kết quả số chồi thu được

tương đối thấp, chỉ đạt 3,7 chồi/mẫu [35] Một loài có giá trị khác thuộc chi

sa nhân là Amomum villosum Lour cũng đã được Ping (2004), Hong và Na (2005) nhân giống in vitro từ chồi rễ [28], [33] Amomum krervanh Pierre

ex Gagnep là cây dược liệu phổ biến ở Thái Lan và Campuchia đã được

nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu nhân giống in vitro từ chồi nách [34], [38] Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire đã được Hongdong (2006) nuôi in vitro và nhân nhanh từ chồi đỉnh [27]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây sa nhân bằng nuôi cấy mô

ở Việt Nam

Ở Việt Nam, có rất ít công trình công bố kết quả nghiên cứu nuôi

cấy in vitro cây sa nhân Vịnh và cộng sự (2006) đã nghiên cứu áp dụng

công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong nhân nhanh sa nhân Tuy nhiên kết quả còn hạn chế[22] Đặng Ngọc Phúc và cộng sự (2011) đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây sa nhân tím thu được kết quả cụ thể như sau: Đỉnh sinh trưởng và đoạn thân mang chồi nách từ thân rễ của cây tự nhiên được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian từ 5-18 phút Thời gian khử trùng

12 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất, đạt 91,11% đối với đỉnh sinh trưởng và 86,67% đối với đoạn thân Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung riêng lẻ chất kích thích sinh trưởng BAP, kinetin Sau 8 tuần nuôi cấy, khả

năng tái sinh chồi tốt nhất đạt được trên môi trường bổ sung BAP 1,0 mg/l (1,36 chồi/đỉnh sinh trưởng;1,40 chồi/ đỉnh sinh trưởng bổ đôi; 1,04

chồi/đoạn thân) Đoạn thân in vitro được cấy lên môi trường nhân nhanh bổ

sung riêng lẻ hay kết hợp các chất kích thích sinh trưởng BAP, kinetin và NAA Sau 10 tuần nuôi cấy, môi trường bổ sung BAP 1,5 mg/l kết hợp NAA

0,25 mg/l cho số chồi lớn nhất đạt 7,40 chồi/mẫu Chồi in vitro được cảm

ứng rễ trên môi trường MS bổ sung NAA hay IBA Rễ được cảm ứng tốt nhất

trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA (18,42 rễ/chồi) Cây con in

vitro được huấn luyện thích nghi và trồng ở vườn ươm với tỷ lệ sống sót

93,14% [14]

1.3 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.3.1 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trong nhiều thập kỉ qua, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển mạnh

mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới Có thể nói đây là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học

Nhờ áp dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô như: nuôi cấy mô phân sinh, callus, nuôi cấy phôi, nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy tế bào trần… con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn, gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên Điều này sẽ góp phần tạo ra hàng loạt các cá thể mới giữ nguyên các tính trạng di truyền của cơ thể mẹ và rút ngắn thời gian để đưa một giống mới và sản xuất với quy mô lớn [10], [23]

Ngoài ra, dựa vào kĩ thuật nuôi cấy, có thể duy trì và bảo quản được nhiều giống cây trồng quý hiếm, hoặc loại bỏ các mầm bệnh của những loài thực vật sinh sản sinh dưỡng Sử dụng kĩ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần có thể tạo ra những con lai về mặt di truyền mà phương pháp lai giống cổ điển không thực hiện được Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu đã thu nhận các chất trao đổi thứ cấp từ tế bào nuôi cấy, dẫn đến sự ổn

định và ñộc lập hơn, ít lệ thuộc vào sản xuất của thực vật ngoài tự nhiên "

mở ra triển vọng sử dụng kĩ thuật này ñể nuôi cấy sinh khối lớn có khả năng tổng hợp những chất sinh học để thu nhận các hợp chất trên quy mô công nghiệp " [9]

Ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong điều kiện in vitro để

sản xuất các hợp chất thứ cấp:

+ Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo

mà không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý Không cần thiết để vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô

+ Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất sản phẩm bằng cách loại bỏ những trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của nguyên liệu thô, sự đồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá trình vận chuyển và bảo quản

+ Một số sản phẩm trao đổi chất được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh [10]

+ Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống vô tính cổ điển như dâm cành, dâm chồi, chiết, ghép, tách dòng… một

kỹ thuật tiến bộ với những ưu thế như tính khả thi rộng, tốc độ nhân giống cực kỳ cao và có tiềm năng công nghiệp hóa [1]

Một ý nghĩa không kém phần quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật là

mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như:

cơ chế tổng hợp các chất, sinh lý phân tử, di truyền – đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở các tế bà thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác…[23]

1.3.2 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

* Tính toàn năng (Totipotence ) của tế bào

Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng

Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Ông nhận thấy, mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một

cơ thể hoàn chỉnh

Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham Unio) đã thành công khi thực nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế bào Thành công trên đã tạo ra công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu [24]

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh

từ một tế bào riêng rẽ

* Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Ví dụ:

Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm nhiệm vụ vận chuyển nước và chất dinh dưỡng

Quá trình phân hoá tế bào được biểu diễn ở sơ đồ sau:

Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào chuyên hoá

Mặc dù các tế bào đã chuyển hoá thành các mô chức năng nhưng chúng vẫn không mất đi khả năng phân chia của mình Trong điều kiện thích hợp, các tế bào lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó được gọi là phản phân hoá tế bào (ngược lại với quá trình phân hoá tế bào) Sơ đồ hoá như sau:

Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, phân hoá gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hoá (mà trước đây bị ức chế) để cho biểu hiện trạng thái mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào Mặt khác, khi tế bào nằm trong khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các

tế bào xung quanh Khi tách riêng tế bào tạo điều kiện thuận lợi cho các gen được hoạt hoá Quá trình phân hoá được xảy ra theo một chương trình định sẵn [24]

1.3.3 Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào

Theo tác giả Lê Trần Bình và cs [1]: Trong nuôi cấy mô, tế bào gồm 5 giai đoạn sau:

- Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống invitro Mục đích của giai đoạn này là tạo được vật liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy

Mẫu đưa từ bên ngoài vào đảm bảo các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp;

tỷ lệ sống cao; tốc độ sinh trưởng nhanh

Phản phân hoá tế bào Phân hoá tế bào

Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ

- Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của mô nuôi cấy Quá trình này điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi cấy Thường các mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những mô

đã chuyển hoá

- Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi

Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất Chính vì thế giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy Để tăng hệ số người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm mem… kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp Tuỳ thuộc vào đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính

- Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi trường ra rễ Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, là nhóm hoocmon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2.4-D được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi

- Giai đoạn 5: Giai đoạn đưa cây ra đất

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng dụng của quá trình nhân giống invitro trong thực tiễn sản xuất Đây là giai đoạn chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất

1.3.4 Một số công trình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy

mô tế bào thực vật ở trong nước

Năm 2010 Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây ba kích tím và thu được kết quả, tái sinh chồi in vitro trên môi trường cơ bản MS bổ sung 0,25 mg/L kinetin Đoạn thân (khoảng 1cm) của cây Ba kích in vitro được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS bổ sung các chất kích sinh trưởng khác nhau cho cảm ứng nhân nhanh chồi Số chồi in vitro đạt lớn nhất trên môi trường cơ bản MS bổ sung 3,5 mg/L BA + 0,2 mg/L IBA (với 15,00 chồi/mẫu cấy) Chồi được tạo rễ trên môi trường MS bổ sung IBA hoặc NAA, hình thành rễ tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 0,2-0,25 mg/L IBA Cây in vitro đưa ra nhà lưới, 97,9% cây sống và thích nghi với điều kiện tự nhiên [20]

Lan Dendrobium fimbriatum Hook (Hoàng thảo Long nhãn) là loài lan đẹp được sử dụng làm cảnh và làm thuốc, đang đe dọa tuyệt chủng Nguyễn Thị Sơn và cộng sự (2012), tiến hành nghiên cứu nhân in vitro với mục đích bảo tồn và phát triển nguồn gen loài lan quý Kết quả nghiên cứu đã chỉrõ: Nguyên liệu sử dụng là quả lan 3 tháng tuổi; Môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là môi trường MS + 100ml ND + 10g saccharoza + 6,0g agar/lít môi trường; Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là môi trường KC + 100ml ND + 10g sacaroza + 60g khoai tây + 6,0g agar/lít môi trường; Môi trường MS + 100ml ND + 20g sacaroza + 60g chuối chín +6,0g agar/lít môi trường là thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi in vitro;

Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE + 10g sacaroza + 1g THT + 6,0g agar/lít môi trường [16]

Lô hội (Aloe vera L.) là cây dược liệu dùng cho cả đông y và tây y

Chất gel trong cây Lô hội còn được sử dụng để sản xuất các loại mỹ phẩm Vì vậy cần phát triển các vùng trồng cây Lô hội làm nguyên liệu Nguyễ n Thị Kim Thanh, Dư ơ ng Huyề n Trang (2008), đã nghiên cứu nhân giống

vô tính in vitro cây Lô hội nhằm nhân nhanh cây giống cho các vùng nguyên

liệu là cần thiết Từ kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng: để tạo vật liệu khởi đầu

in vitro cây Lô hội nên sử dụng mẫu ở vụ xuân, khử trùng bằng HgCl2 0,1%

trong 7 phút cho hiệu quả khử trùng cao (68,5%) Môi trường MS bổ sung 2,5 mg/l BAP cho hệ số nhân cao (5,3 lần/ 3 tuần), chất lượng chồi tốt Bổ sung than hoạt tính 1,5 - 2,0 g/l cho khả năng ra rễ đạt cao nhất Tỷ lệ ra rễ đạt

100%, chất lượng rễ tốt Giá thể ra cây Lô hội invitro thích hợp là cát mịn, tỷ

lệ sống cao (81,4%), cây sinh trưởng phát triển tốt Thời vụ không ảnh hưởng

đáng kể đến hiệu quả ra cây Lô hội in vitro [18]

Trong y học cổ truyền, hà thủ ô đỏ có tác dụng thông tiểu, giải độc, bổ gan thận, ích tinh huyết, tăng lực, chữa đau mỏi chân tay, tóc khô hay rụng, sớm bạc, làm đen tóc và kéo dài tuổi thọ, mặt khác, giúp cho sự sinh trưởng phát dục của cơ thể diễn ra thuận lợi hơn Hoàng Thị Kim Hồ ng (2011)

đã nghiên cứ u; môi trường MS có bổ sung BAP 4,0 mg/l và NAA 0,1 mg/l kích thích đoạn thân của chồi in vitro cây hà thủ ô đỏ tái sinh cụm chồi tốt nhất, với trung bình 8,54 chồi trên một mẫu Các đoạn thân in vitro này cũng có khả năng tạo cụm chồi tốt trên môi trường có BAP 4,0 mg/l và NAA 0,2 mg/l hoặc BAP 0,5 mg/l và NAA 0,3 mg/l nhưng một số mẫu còn có khả năng phân hóa thành callus Chồi đơn tách từ cụm chồi in vitro tạo rễ, sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l [6]

Phùng Văn Phê, Nguyễ n Thị Hồ ng Gấ m, Nguyễ n Trung Thành (2010), đã nghiên cứ u nhân giống in vitro câylan Kim tuyến Đỉnh sinh trưởng và đoạn thân mang chồi nách (2,0 - 3,0 cm) của cây tự nhiên được khử trùng bằng HgCl2 0,1% thời gian khử trùng là 10 phút là thích hợp nhất,cho tỷ lệ mẫu sống 86,1% đối với đỉnh sinh trưởng và 84,77% với đoạn thân mang chồi nách Với mẫu là quả lan Kim tuyến (40 ngày tuổi) khử trùng bằng HgCl2 0,2% trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất, đạt 75,62% Môi trường MS cơ bản bổ sung 1,0 mg/l kinetin thích hợp cho đỉnh sinh trưởng và đoạn thân mang chồi nách tái sinh chồi sau 8 tuần nuôi cấy (khoảng 1,42 chồi/đỉnh sinh trưởng;1,5 chồi/đoạn thân) và thích hợp cho hạt lan nảy mầm đạt tỷ lệ 88,3% sau 12 tuần nuôi cấy.Cụm protocorm (2,0 × 2,0 mm) sau khi hình thành từ hạt được cấy chuyển lên môi trườngMS cơ bản bổ sung 1,0 mg/l kinetin cho 5,62 chồi/ cụm protocorm sau 12 tuần nuôi cấy Đoạn thân (1,0 - 2,0 cm) từ chồi in vitro nhân chồi tốt nhất trên môi trường MS cơ bản cóbổ sung 1,0 mg/l kinetin và 0,3 mg/l NAA, đạt 4,6 chồi/mẫu sau12 tuần nuôi cấy Chồi in vitro tạo rễ tốt nhất trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 0,3mg/l NAA đạt 3,1 rễ/chồi sau 8 tuần nuôi cấy Cây in vitro hoàn chỉnh sau khi huấn luyện được trồng trên giá thể với tỷ lệ sống sót 70% [13]

Hoàng Xuân Chiến và cộng sự (2011), đã tiến hành nghiên cứ u

mộ t số yế u tố tạ o củ sâm ngọ c linh (Panax Vietnamensis

Ha Et Grushv.) in vitro và xác đị nh hàm lư ợ ng saponin trong cây tạ o từ củ trồ ng thử nghiệ m ở núi Ngọ c Linh Kế t quả thu đư ợ c; Các phứ c hợ p củ a GA3/BAP và auxin/cytokinin trong quá trình hình thành củ cũng đã đư ợ c khả o sát, nồ ng

độ BAP thích hợ p nhấ t cho quá trình tạ o củ là 3,0 mg/l;

GA3 ứ c chế khả năng tạ o củ in vitro cây sâm Ngọ c Linh; Các chồ i cây sâm Ngọ c Linh in vitro đư ợ c cả m ứ ng để

tạ o củ thành công trên môi trư ờ ng SH có bổ sung NAA 1,0 mg/l và BAP 2,0 mg/l trong điề u kiệ n chiế u sáng 16 giờ /ngày Nồ ng độ đư ờ ng saccharose tố t nhấ t cho quá trình tạ o củ sâm là 50 g/l Hàm lư ợ ng saponin trong củ

củ a nhữ ng cây 17 tháng tuổ i nuôi trồ ng ngoài tự nhiên cũng đã đư ợ c xác đị nh là G-Rb1 (0,21%), G-Rg1 (0,17%), MR2(0,77%) [3]

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu là mẫu xử lý từ chồi đỉnh hoặc chồi bên của cây sa nhân tím đang sinh trưởng tốt, cho năng suất cao, không sâu bệnh, được thu thập tại tỉnh Thái Nguyên

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Tế bào – Viện Khoa học Sự sống – Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Từ tháng 8/2012 đến 8/2013

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng đến tỉ lệ sống của mẫu sa nhân tím

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh của chồi sa nhân tím

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây sa nhân tím

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra rễ của chồi sa nhân tím

- Nghiên cứu loại giá thể phù hợp cho sự thích ứng cây sa nhân tím in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

1

2.2.2.1 Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu

Vật liệu khử trùng: Đoạn thân củ chứa chồi bên sa nhân tím

Phương pháp xử lý mẫu: (i) Cây sa nhân non được rửa sạch bằng xà phòng dưới vòi nước chảy, cắt bỏ ngọn, gọt sạch phần rễ và vỏ ở phần củ; (ii) xịt cồn đưa mẫu vào trong tủ cấy vô trùng, tiếp tục tách bẹ để lấy phần đỉnh sinh trưởng bên trong; (iii) Phần đỉnh sinh trưởng được lắc qua cồn 700

Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh Mẫu: Chồi in vitro

Giai đoạn vườn ươm

Mẫu: Cây con in

vitro

Cây sa nhân tím nuôi cấy

mô

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

vòng 30 giây đến 1 phút; (iv) Tráng mẫu (đỉnh sinh trưởng)1-2 lần bằng nước cất vô trùng; (v) Lắc mẫu nuôi cây (đỉnh sinh trưởng) trong hóa chất khử trùng với thời gian khử trùng theo nội dung từng công thức cụ thể; (vi) Tráng sạch mẫu 4 – 5 lần bằng nước cất vô trùng; (vii) Cấy mẫu đã khử trùng vào môi trường nuôi cấy (Các thao tác từ bước ii đến bước vii được thực hiện trong điều kiện vô trùng)

Công thức thí nghiệm Thời gian và nồng độ khử trùng

Công thức thí nghiệm Thời gian và nồng độ khử trùng

Tổng số mẫu nuôi cấy

2.2.2.2 Giai đoạn tái sinh chồi

Mẫu nuôi cấy được sử dụng ở đây là chồi nách Các chồi này được cấy vào môi trường tái sinh có môi trường nền là MS bổ sung saccharose 30g/l; agar 6,8g/l; inositol 100 mg/l, pH = 5,8 và chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng là BAP, Kinetin Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại mỗi lần nhắc lại 30 mẫu, 90 mẫu/ 1 công thức

* Các chỉ tiêu theo dõi ( theo dõi sau 45 ngày)

Tổng số mẫu phát sinh chồi

Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá xanh thẫm

Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi hơi gầy, lá xanh

Chồi sinh trưởng kém: Chồi gầy, lá xanh nhạt hoặc chồi bi dị dạng

2.2.2.3 Giai đoạn nhân nhanh cụm chồi

Các chồi sinh trưởng và phát triển bình thường có đầy đủ thân lá

(Chú ý là không bị dị dạng) được sử dụng làm vật liệu cấy chuyển sang môi

trường nhân nhanh Trong giai đoạn này tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của

các chất điều tiết sinh trưởng (BAP, Kinetin, IAA, IBA,NAA) đến hệ số nhân

của chồi sa nhân tím Môi trường nền được sử dụng là MS bổ sung saccharose

30 g/lít; agar 6,8 g/lít; inositol 100 mg/l, pH = 5,8

Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần

nhắc lại, 90 mẫu/ 1 công thức

* Các thí nghiệm tiến hành:

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi

Công thức thí nghiệm Nồng độ BAP (mg/l)

Tổng số chồi nuôi cấy

Tổng chiều cao chồi + Chiều cao TB của chồi(cm) =

Tổng số chồi theo dõi

+ Chất lượng chồi:

Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá xanh thẫm

Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi hơi gầy, lá xanh

Chồi sinh trưởng kém: Chồi gầy, lá xanh nhạt hoặc chồi bi dị dạng

2.2.2.4 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

- Mẫu nuôi cấy: Chồi sa nhân tím khoẻ mạnh có từ 3-5 lá thu được từ quá trình nhân nhanh

- Môi trường nền được sử dụng là 1/2MS bổ sung saccharose 30 g/lít; agar 6,8 g/lít; inositol 100 mg/l, pH = 5,8

- Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, 90 mẫu/ 1 công thức

Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ

Công thức thí nghiệm Nồng độ IBA (mg/l)

Tổng số chồi cấy

Tổng số rễ ra + Trung bình rễ /cây (rễ) =

Tổng số cây theo dõi

2.2.2.5 Giai đoạn vườn ươm

- Vật liệu là cây sa nhân tím con sau nuôi cấy mô

- Phương pháp ra cây: Trước khi đưa cây con ra trồng ngoài tự nhiên người ta thường tiến hành huấn luyện để cây quen dần với điều kiện môi trường bên ngoài Thời gian này có thể kéo dài khoảng 7 ngày và tăng dần cường độ vào những ngày cuối để tăng nhanh khả năng thích nghi của cây Cây con trong bình cấy được rửa sạch những phần thạch hoặc đường bám vào

vì chúng thường là môi trường thích hợp cho nấm bệnh phát triển hoặc côn trùng tấn công Tiếp đó ngâm cây vào nước để tránh hiện tượng mất nước, rồi đem trồng vào giá thể