2.2.1. Nội dung nghiờn cứu
- Nghiờn cứu ảnh hƣởng của húa chất và thời gian khử trựng đến tỉ lệ sống của mẫu sa nhõn tớm
- Nghiờn cứu ảnh hƣởng của cỏc chất kớch thớch sinh trƣởng đến khả năng tỏi sinh của chồi sa nhõn tớm
- Nghiờn cứu ảnh hƣởng của cỏc chất kớch thớch sinh trƣởng đến khả năng nhõn nhanh chồi cõy sa nhõn tớm
- Nghiờn cứu ảnh hƣởng của cỏc chất kớch thớch sinh trƣởng đến khả năng ra rễ của chồi sa nhõn tớm
- Nghiờn cứu loại giỏ thể phự hợp cho sự thớch ứng cõy sa nhõn tớm in vitro ngoài điều kiện tự nhiờn
2.2.2. Phƣơng phỏp nghiờn cứu 1
2.2.2.1. Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu
Vật liệu khử trựng: Đoạn thõn củ chứa chồi bờn sa nhõn tớm.
Phƣơng phỏp xử lý mẫu: (i) Cõy sa nhõn non đƣợc rửa sạch bằng xà phũng dƣới vũi nƣớc chảy, cắt bỏ ngọn, gọt sạch phần rễ và vỏ ở phần củ; (ii) xịt cồn đƣa mẫu vào trong tủ cấy vụ trựng, tiếp tục tỏch bẹ để lấy phần đỉnh sinh trƣởng bờn trong; (iii) Phần đỉnh sinh trƣởng đƣợc lắc qua cồn 700
trong Giai đoạn tỏi sinh chồi Mẫu: Chồi sa nhõn tớm Giai đoạn tạo vật liệu
khởi đầu Mẫu: chồi bờn, thõn
củ sa nhõn tớm
Giai đoạn nhõn nhanh cụm chồi Mẫu: Chồi invitro
Giai đoạn tạo cõy hoàn chỉnh Mẫu: Chồi in vitro Giai đoạn vƣờn ƣơm
Mẫu: Cõy con in vitro
Cõy sa nhõn tớm nuụi cấy
mụ
vũng 30 giõy đến 1 phỳt; (iv) Trỏng mẫu (đỉnh sinh trƣởng)1-2 lần bằng nƣớc cất vụ trựng; (v) Lắc mẫu nuụi cõy (đỉnh sinh trƣởng) trong húa chất khử trựng với thời gian khử trựng theo nội dung từng cụng thức cụ thể; (vi) Trỏng sạch mẫu 4 – 5 lần bằng nƣớc cất vụ trựng; (vii) Cấy mẫu đó khử trựng vào mụi trƣờng nuụi cấy (Cỏc thao tỏc từ bƣớc ii đến bƣớc vii đƣợc thực hiện trong điều kiện vụ trựng).
Hoỏ chất khử trựng: H2O2 và HgCl2
Mụi trƣờng nuụi cấy: MS (Murashige & Skoog , 1962) [32], bổ sung saccharose 30 g/lớt; agar 6,8 g/lớt; inositol 100 mg/l, pH = 5,8.
Cỏc cụng thức đƣợc bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, 90 mẫu/ 1 cụng thức.
* Cỏc thớ nghiệm tiến hành
Thớ nghiệm 1: Nghiờn cứu ảnh hưởng của H202 nồng độ 20% đến khả năng vụ trựng mẫu
Thớ nghiệm 2: Nghiờn cứu ảnh hưởng của HgCl2 nồng độ 0,1% đến khả năng vụ trựng mẫu
Cụng thức thớ nghiệm Thời gian và nồng độ khử trựng Cụng thức thớ nghiệm Thời gian và nồng độ khử trựng
CT1 Khụng xử lý CT 2 20% + 5 phỳt CT 3 20% + 10 phỳt CT 4 20% + 15 phỳt CT5 20% + 20 phỳt CT6 20% + 25 phỳt
CT1 Khụng xử lý CT 2 0,1% + 5 phỳt CT 3 0,1% + 10 phỳt CT 4 0,1% + 15 phỳt CT5 0,1% + 20 phỳt CT6 0,1% + 25 phỳt
* Cỏc chỉ tiờu theo dừi ( theo dừi sau 20 ngày) + Tỷ lệ mẫu nhiễm:
Tổng số mẫu nhiễm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = 100 Tổng số mẫu nuụi cấy
+ Tỷ lệ mẫu sạch:
Tổng số mẫu sạch
Tỷ lệ mẫu sạch (%) = 100 Tổng số mẫu nuụi cấy
+ Tỷ lệ mẫu chết do húa chất
Tổng số mẫu chết do húa chất
Tỷ lệ mẫu chết (%) = 100 Tổng số mẫu nuụi cấy
Mẫu nuụi cấy đƣợc sử dụng ở đõy là chồi nỏch. Cỏc chồi này đƣợc cấy vào mụi trƣờng tỏi sinh cú mụi trƣờng nền là MS bổ sung saccharose 30g/l; agar 6,8g/l; inositol 100 mg/l, pH = 5,8 và chất điều tiết sinh trƣởng đƣợc sử dụng là BAP, Kinetin. Cỏc cụng thức đƣợc bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 3 lần nhắc lại mỗi lần nhắc lại 30 mẫu, 90 mẫu/ 1 cụng thức.
* Cỏc thớ nghiệm tiến hành:
Thớ nghiệm 3: Nghiờn cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tỏi sinh chồi Cụng thức thớ nghiệm Nồng độ BAP (mg/l) CT 1 0,0 CT 2 0,5 CT 3 1,0 CT 4 1,5 CT 5 2,0 CT6 2,5
Thớ nghiệm 4: Nghiờn cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tỏi sinh chồi Cụng thức thớ nghiệm Nồng độ Kinetin (mg/l) CT 1 0,0 CT 2 0,5 CT 3 1,0 CT 4 1,5 CT 5 2,0 CT6 2,5
* Cỏc chỉ tiờu theo dừi ( theo dừi sau 45 ngày)
Tổng số mẫu phỏt sinh chồi
+ Tỷ lệ phỏt sinh chồi (%) = 100 Tổng số mẫu đƣa vào
Tổng số chồi thu đƣợc
+ Hệ số phỏt sinh chồi (lần) = Tổng số mẫu phỏt sinh chồi
+ Chất lƣợng chồi:
Chồi sinh trƣởng tốt: Chồi mập, lỏ xanh thẫm. Chồi sinh trƣởng trung bỡnh: Chồi hơi gầy, lỏ xanh.
Chồi sinh trƣởng kộm: Chồi gầy, lỏ xanh nhạt hoặc chồi bi dị dạng.
2.2.2.3. Giai đoạn nhõn nhanh cụm chồi
Cỏc chồi sinh trƣởng và phỏt triển bỡnh thƣờng cú đầy đủ thõn lỏ (Chỳ ý là khụng bị dị dạng) đƣợc sử dụng làm vật liệu cấy chuyển sang mụi trƣờng nhõn nhanh. Trong giai đoạn này tiến hành nghiờn cứu ảnh hƣởng của cỏc chất điều tiết sinh trƣởng (BAP, Kinetin, IAA, IBA,NAA) đến hệ số nhõn của chồi sa nhõn tớm. Mụi trƣờng nền đƣợc sử dụng là MS bổ sung saccharose 30 g/lớt; agar 6,8 g/lớt; inositol 100 mg/l, pH = 5,8.
Cỏc cụng thức đƣợc bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, 90 mẫu/ 1 cụng thức.
Thớ nghiệm 5: Nghiờn cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhõn chồi Cụng thức thớ nghiệm Nồng độ BAP (mg/l) CT 1 0,0 CT 2 0,5 CT 3 1,0 CT 4 1,5 CT 5 2,0 CT6 2,5
Thớ nghiệm 6: Nghiờn cứu ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả nhõn chồi Cụng thức thớ nghiệm Nồng độ Kinetin (mg/l) CT 1 0,0 CT 2 0,5 CT 3 1,0 CT 4 1,5 CT 5 2,0 CT6 2,5
Sau khi thực hiện và đỏnh giỏ xong thớ nghiệm 5, 6 ta chọn ra cụng thức tốt nhất trong hai thớ nghiệm để tiến hành cỏc thớ nghiệm tiếp theo. Ta ký hiệu cụng thức đú là CT*
.
Thớ nghiệm 7: Nghiờn cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP (Kinetin) và IBA đến hiệu quả nhõn chồi
Cụng thức thớ nghiệm Nồng độ BAP (Kinetin) (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l) CT 1 CT* 0,0 CT 2 CT* 0,1 CT 3 CT* 0,2 CT 4 CT* 0,3
CT 5 CT* 0,4
CT6 CT* 0,5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thớ nghiệm 8: Nghiờn cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP (Kinetin) và IAA đến hiệu quả nhõn chồi
Cụng thức thớ nghiệm Nồng độ BAP (Kinetin) (mg/l) Nồng độ IAA (mg/l) CT 1 CT* 0,0 CT 2 CT* 0,1 CT 3 CT* 0,2 CT 4 CT* 0,3 CT 5 CT* 0,4 CT6 CT* 0,5
Thớ nghiệm 9: Nghiờn cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP (Kinetin) và NAA đến hiệu quả nhõn chồi
Cụng thức thớ nghiệm Nồng độ BAP (Kinetin) (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) CT 1 CT* 0,0 CT 2 CT* 0,1 CT 3 CT* 0,2 CT 4 CT* 0,3 CT 5 CT* 0,4 CT6 CT* 0,5
* Cỏc chỉ tiờu theo dừi ( theo dừi sau 45 ngày)
Tổng số chồi tạo thành + Hệ số nhõn chồi (lần) = Tổng số chồi nuụi cấy
Tổng chiều cao chồi
Tổng số chồi theo dừi + Chất lƣợng chồi:
Chồi sinh trƣởng tốt: Chồi mập, lỏ xanh thẫm. Chồi sinh trƣởng trung bỡnh: Chồi hơi gầy, lỏ xanh.
Chồi sinh trƣởng kộm: Chồi gầy, lỏ xanh nhạt hoặc chồi bi dị dạng.
2.2.2.4. Giai đoạn tạo cõy hoàn chỉnh
- Mẫu nuụi cấy: Chồi sa nhõn tớm khoẻ mạnh cú từ 3-5 lỏ thu đƣợc từ quỏ trỡnh nhõn nhanh.
- Mụi trƣờng nền đƣợc sử dụng là 1/2MS bổ sung saccharose 30 g/lớt; agar 6,8 g/lớt; inositol 100 mg/l, pH = 5,8.
- Cỏc cụng thức đƣợc bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, 90 mẫu/ 1 cụng thức.
* Cỏc thớ nghiệm tiến hành:
Thớ nghiệm 10: Nghiờn cứu ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ Cụng thức thớ nghiệm Nồng độ NAA (mg/l) CT 1 0,0 CT 2 0,2 CT 3 0,4 CT 4 0,6 CT 5 0,8 CT6 1,0
Thớ nghiệm 11: Nghiờn cứu ảnh hưởng của IBAđến hiệu quả ra rễ
CT 1 0,0 CT 2 0,2 CT 3 0,4 CT 4 0,6 CT 5 0,8 CT6 1,0
* Cỏc chỉ tiờu theo dừi ( theo dừi sau 45 ngày)
Tổng số chồi bật rễ
+ Tỷ lệ chồi ra rễ ( ) = 100 Tổng số chồi cấy
Tổng số rễ ra
+ Trung bỡnh rễ /cõy (rễ) = Tổng số cõy theo dừi
2.2.2.5. Giai đoạn vườn ươm
- Vật liệu là cõy sa nhõn tớm con sau nuụi cấy mụ.
- Phƣơng phỏp ra cõy: Trƣớc khi đƣa cõy con ra trồng ngoài tự nhiờn ngƣời ta thƣờng tiến hành huấn luyện để cõy quen dần với điều kiện mụi trƣờng bờn ngoài. Thời gian này cú thể kộo dài khoảng 7 ngày và tăng dần cƣờng độ vào những ngày cuối để tăng nhanh khả năng thớch nghi của cõy. Cõy con trong bỡnh cấy đƣợc rửa sạch những phần thạch hoặc đƣờng bỏm vào vỡ chỳng thƣờng là mụi trƣờng thớch hợp cho nấm bệnh phỏt triển hoặc cụn trựng tấn cụng. Tiếp đú ngõm cõy vào nƣớc để trỏnh hiện tƣợng mất nƣớc, rồi đem trồng vào giỏ thể.
- Chế độ chăm súc cõy con trong giỏ thể: Trong thời gian cõy ở trong giỏ thể, hàng ngày tiến hành tƣới phun bằng nƣớc sạch 2 lần/ngày (giữ ẩm độ giỏ thể khoảng 75%-80%).
- Cỏc cụng thức đƣợc bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 40 mẫu / cụng thức
* Cỏc cụng thức thớ nghiệm:
Thớ nghiệm 12: Nghiờn cứu nghiờn cứu ảnh hưởng của giỏ thể đến sự thớch ứng cõy sa nhõn tớm in vitro ngoài điều kiện tự nhiờn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CT1: Đất phự sa
CT2: Đất phự sa + cỏt (4:1) CT3: Đất phự sa + trấu hun (4:1)
CT4: Đất phự sa + cỏt + trấu hun (4:1:1)
* Cỏc chỉ tiờu theo dừi (sau 45 ngày)
Tổng số cõy sống
+ Tỷ lệ cõy sống ( ) = 100 Tổng số cõy ra bầu
Tổng chiều cao cõy + Chiều cao trung bỡnh cõy (cm) =
Tổng số cõy theo dừi
2.2.3. Xử lý số liệu
- Tớnh cỏc giỏ trị trung bỡnh đƣợc thực hiện trờn phần mềm Excel
- Xử lý số liệu bằng phần mềm IRISTAT (CV% độ tin cậy thớ nghiệm và LSD% sự sai khỏc cú ý nghĩa)
2.2.4.1. Thớ nghiệm in vitro
Cỏc thớ nghiệm in vitro đƣợc tiến hành trong điều kiện nhõn tạo, cỏc yếu tố vật lý nhƣ: ỏnh sỏng, nhiệt độ, độ ẩm luụn đƣợc duy trỡ ổn định.
+ Ánh sỏng: Cỏc mẫu đƣợc nuụi cấy dƣới ỏnh đốn Neon với cƣờng độ chiếu sỏng 1500 lux, thời gian chiếu sỏng 10-12 giờ/ ngày.
+ Nhiệt độ: Nhiệt độ phũng nuụi cấy đƣợc duy trỡ trong khoảng 20- 220C (đờm) và 25-270
C (ngày).
+ Độ ẩm: Phũng nuụi cấy cú độ ẩm 70% độ ẩm bóo hoà.
2.2.4.2. Thớ nghiệm thớch ứng cõy in vitro ngoài điều kiện tự nhiờn
Thớ nghiệm đƣợc tiến hành tại khu nhà kớnh và khu trồng thực nghiệm của Viện khoa học Sự sống - Đại học Nụng Lõm Thỏi Nguyờn.
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiờn cứu ảnh hƣởng của húa chất đến khả năng vụ trựng mẫu sa nhõn tớm làm vật liệu khởi đầu mẫu sa nhõn tớm làm vật liệu khởi đầu
Cụng tỏc vụ trựng mẫu làm vật liệu nuụi cấy mụ là một khõu hết sức quan trọng quyết định sự thành cụng của cả quy trỡnh nhõn giống vụ tớnh của bất kỳ đối tƣợng thực vật. Việc lựa chọn loại húa chất khử trựng, nồng độ và thời gian khử trựng hết sức quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu quả của cụng tỏc vụ trựng. HgCl2 0,1% là một loại húa chất khử trựng rất hiệu quả nhƣng lại gõy độc cho ngƣời thao tỏc, H2O2 20% là loại húa chất mới đƣợc sử dụng nờn chƣa phổ biến, với ƣu điểm khỏ hiệu quả, ớt gõy độc cho ngƣời thao tỏc nờn cú thể trong tƣơng lai sẽ đƣợc dựng nhiều. Trong cỏc thớ nghiệm, chỳng tụi tiến hành nghiờn cứu thử nghiệm hai loại húa chất HgCl2 ở nồng độ 0,1% và H2O2
3.1.1. Kết quả nghiờn cứu ảnh hƣởng của H202 20% đến khả năng vụ trựng mẫu
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của H202 20% đến khả năng vụ trựng mẫu
Cụng thức Nồng độ H2O2 (%) Thời gian khử trựng (phỳt) Tổng số mẫu ban đầu (chồi) Tỷ lệ mẫu sạch (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết do húa chất (%) 1(đc) 0 5 90 0 100 0 2 20 5 90 10,00* 85,56 4,44 3 20 10 90 24,44* 64,44 11,11 4 20 15 90 35,56* 48,89 15,56 5 20 20 90 44,44* 37,78 17,78 6 20 25 90 32,22* 34,44 33,33 LSD0,5 2,93 CV% 6,6
Ghi chỳ: ns: sự sai khỏc khụng cú ý nghĩa; *: sự sai khỏc cú ý nghĩa
Hỡnh 3.1. Ảnh hƣởng của H202 20% đến khả năng vụ trựng mẫu
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tỷ l ệ (% ) ĐC CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 Cụng thức thớ nghiệm Tỷ lệ mẫu sạch (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết do húa chất (%)
Húa chất H2O2 20% diệt vi khuẩn, nấm trờn mẫu khử trựng theo nguyờn lý phỏ vỡ màng tế bào gõy mất nƣớc đột ngột làm cho tế bào của nấm, vi khuẩn chết. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khi sử dụng H2O2 20% khử trựng mẫu sa nhõn tớm (bảng 3.1), thay đổi thời gian khử trựng từ 5-25 phỳt tỷ lệ mẫu sạch dao động từ 10% - 44,44%, tỷ lệ mẫu sạch tăng dần khi tăng thời gian khử trựng từ 5-20 phỳt, cao nhất ở cụng thức 5 đạt 44,44% và bắt đầu giảm ở cụng thức 6 khi tăng thời gian khử trựng lờn 25 phỳt đạt 32,22%. Việc tăng dần thời gian khử trựng 5-25 phỳt làm cho tỷ lệ mẫu chết tăng tƣơng ứng từ 4,44% - 33,33% và tăng nhiều nhất khi tăng thời gian từ 20 – 25 phỳt tới 15,55%. Cụng thức tốt nhất trong thớ nghiệm là cụng thức 5 cho tỷ lệ mẫu sạch đạt cao nhất 44,44%, sai khỏc cú ý nghĩa so với đối chứng và tỷ lệ mẫu chết do húa chất khụng quỏ cao đạt 17,78%.
3.1.2. Kết quả nghiờn cứu ảnh hƣởng của HgCl2 0,1% đến khả năng vụ trựng mẫu
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của HgCl2 0.1% đến khả năng vụ trựng mẫu
Cụng thức Nồng độ HgCl2 (%) Thời gian khử trựng (phỳt) Tổng số mẫu ban đầu (chồi) Tỷ lệ mẫu sạch (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết do húa chất (%) 1(đc) 0 5 90 0 100 0 2 0,1 5 90 20,00* 77,78 2,22 3 0,1 10 90 50,00* 41,11 8,89 4 0,1 15 90 74,44* 12,22 13,33 5 0,1 20 90 67,78* 11,11 21,11 6 0,1 25 90 53,33* 10,00 36,67 LSD0,5 5,03 CV% 6,3
Ghi chỳ: ns: sự sai khỏc khụng cú ý nghĩa; *: sự sai khỏc cú ý nghĩa
Hỡnh 3.2. Ảnh hƣởng của HgCl2 0.1% đến khả năng vụ trựng mẫu
Kết quả bảng 3.2 và hỡnh 3.2 cho thấy, khi khụng sử dụng húa chất khử trựng thỡ toàn bộ mẫu đó bị nhiễm sau thời gian nuụi cấy, khi tiến hành dựng
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tỷ l ệ (% ) ĐC CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 Cụng thức thớ nghiệm Tỷ lệ mẫu sạch (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết do húa chất (%)
HgCl2 0,1% khử trựng mẫu với thời gian tăng dần từ 5 – 15 phỳt thỡ tỷ lệ mẫu sạch cũng tăng tƣơng ứng từ 20,00% đến 74,44%, tiến hành tăng thời gian khử trựng lờn 20 và 25 phỳt thỡ tỷ lệ mẫu sạch lại giảm tƣơng ứng lần lƣợt là 67,78% và 53,33%. Mặt khỏc, khi tăng thời gian khử trựng từ 5 – 25 phỳt thỡ tỷ lệ mẫu chết tăng từ 2,22% - 36,67%, bắt đầu tăng mạnh từ 13,33% ở cụng thức 4 lờn đến 36,67% ở cụng thức 6. Điều này chứng tỏ, mẫu tiếp xỳc với HgCl2 0,1% với thời gian thớch hợp sẽ cho tỷ lệ mẫu sạch cao và thời gian tiếp xỳc với húa chất khử trựng càng lõu thỡ tỷ lệ mẫu chết càng cao. Cụng thức 4 là cụng thức tốt nhất trong thớ nghiệm với thời gian khử trựng là 15 phỳt cho tỷ lệ mẫu sạch cao đạt 74,44%, sai khỏc cú ý nghĩa với đối chứng và tỷ lệ mẫu chết do húa chất khụng quỏ cao đạt 13,33%.
* So sỏnh khả năng vụ trựng mẫu của HgCl2 nồng độ 0,1% và H2O2
nồng độ 20%:
Cụng thức tốt nhất trong thớ nghiệm khử trựng mẫu bằng H2O2 nồng độ 20% là cụng thức 5 cho tỷ lệ mẫu sạch đạt 44,44%, tỷ lệ mẫu chết do húa chất đạt 17,78%.
Cụng thức 4 là cụng thức tốt nhất trong thớ nghiệm khử trựng mẫu bằng HgCl2 nồng độ 0,1% với thời gian khử trựng là 15 phỳt cho tỷ lệ mẫu sạch cao đạt 74,44%, tỷ lệ mẫu chết do húa chất khụng quỏ cao đạt 13,33%.
So sỏnh giữa hai cụng thức tốt nhất trong mỗi thớ nghiệm thỡ cú thể thấy