Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh và chuyển gen sử dụng Agrobacterium Tumefaciens cho đối tượng cây bạch đàn urô (Eucalyptus Urophylla)

i VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  LÊ THỊ MẬN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN SỬ DỤNG AGROBACTERIUM TUMEFACIENS CHO ĐỐI TƢỢNG CÂY BẠCH ĐÀN URÔ (EUCALYPTUS UROPHYLLA) L L U U Ậ Ậ N N V V Ă Ă N N T T H H Ạ Ạ C C S S Ĩ Ĩ K K H H O O A A H H Ọ Ọ C C HÀ NỘI, 2013 ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà - Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Bùi Văn Thắng - Viện Công nghệ sinh học lâm nghiệp - Trường đại học Lâm nghiệp đã tạo mọi điều kiện, chỉ bảo và hướng dẫn tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS. TS. Lê Trần Bình, TS. Lê Văn Sơn, TS. Phạm Bích Ngọc cùng toàn thể các cán bộ, chuyên viên nghiên cứu trong phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong thời gian thực tập. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Thị Đỗ Loan - Viện Sinh thái & Tài nguyên sinh vật đã tạo mọi điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện luận văn này. Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. Đề tài luận văn được thực hiện từ nguồn kinh phí của đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu tạo giống bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) sinh trưởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen” do ThS. Bùi Văn Thắng làm chủ nhiệm, thuộc Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020. Xin trân trọng cảm ơn. Hà Nội, ngày 12 tháng 11 năm 2013 Học viên Lê Thị Mận iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề 1 Mục tiêu 2 Ý nghĩa của đề tài 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Tổng quan về bạch đàn nói chung và bạch đàn Urô nói riêng 4 1.2. Tình hình trồng và năng suất bạch đàn Urô ở Việt Nam 6 1.2.1. Tình hình phát triển diện tích trồng bạch đàn Urô ở Việt Nam 6 1.2.1. Năng suất của cây bạch đàn Urô ở Việt Nam 8 1.3. Các hướng cải thiện giống bạch đàn bằng ứng dụng Công nghệ sinh học 10 1.3.1. Nhân giống vô tính in vitro cây bạch đàn 10 1.3.2. Nghiên cứu phát triển và sử dụng các chỉ thị phân tử trong chọn tạo và lai giống 11 1.3.3. Nghiên cứu tạo giống bạch đàn chuyển gen 12 1.4. Gen GA20 trong chu trình sinh tổng hợp gibberellin và ứng dụng trong cải tiến giống cây trồng sinh trưởng nhanh 18 1.4.1. Vai trò của gibberellin trong đời sống thực vật 18 1.4.2. Sinh tổng hợp gibberellin và vai trò của gen GA20 trong sự sinh tổng hợp gibberellin 19 1.4.3. Ứng dụng của chuyển gen GA20 trong việc cải tiến giống cây trồng sinh trưởng nhanh 23 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Vật liệu nghiên cứu 24 2.1.1. Vật liệu thực vật 24 2.1.2. Vật liệu di truyền và các chủng vi khuẩn 24 2.2. Nội dung nghiên cứu 24 2.3. Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1. Nuôi cấy mô 25 2.3.2. Chuyển gen vào cây bạch đàn Urô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 27 2.3.3. Phân tích thể nhận gen, mô sẹo, chồi và cây chuyển gen bằng phương pháp hóa sinh 29 2.3.4. Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp phân tử 29 2.3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm 31 2.3.6. Các chỉ tiêu theo dõi 31 2.3.7. Xử lý số liệu 32 iv Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Xây dựng quy trình tái sinh cây bạch đàn Urô thông qua mô sẹo 33 3.1.1. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo mô sẹo 33 3.1.2. Ảnh hưởng của BAP, NAA và Kinetin đến khả năng tạo chồi từ mô sẹo 36 3.1.3. Ảnh hưởng của NAA và IBA đến khả năng ra rễ 39 3.2. Xây dựng quy trình chuyển gen vào cây bạch đàn Urô thông qua Agrobacterium tumefaciens 43 3.2.1. Xác định ngưỡng nồng độ chất chọn lọc kanamycin 43 3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy tới khả năng biến nạp gen 47 3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn tới khả năng biến nạp gen 49 3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy tới khả năng biến nạp gen 51 3.2.5. Ảnh hưởng của chủng Agrobacterium tumefaciens đến khả năng biến nạp gen 53 3.2.6. Ảnh hưởng của nguồn mẫu tới khả năng biến nạp gen 54 3.3. Chuyển gen GA20 vào cây bạch đàn Urô thông qua Agrobacterium tumefaciens 59 3.3.1. Đánh giá khả năng tái sinh chồi sau chuyển gen 59 3.3.2. Đánh giá khả năng ra rễ và kiểm tra PCR cho chồi sau chuyển gen 61 Chƣơng 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 4.1. Kết luận 64 4.2. Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC 72 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AS : Acetosyringone BAP : 6 - Benzylaminopurine cs : Cộng sự ĐC : Đối chứng GA : Gibberellin GA20 : Gen mã hóa cho enzym GA20 - oxidase gus : Gen mã hóa cho enzym β - glucuronidase IAA : Indole - 3 acetic acid IBA : Indole - 3 butyric acid Km : Kanamycin MS : Murashige và Skoog (1962) NAA : - naphthaleneacetic acid ND : Nước dừa TNC : Tiền nuôi cấy vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách các nghiên cứu về chuyển gen trên đối tượng Eucalyptus 14 Bảng 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn A. tumefaciens 28 Bảng 2.2: Thành phần dung dịch đệm tách chiết 30 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng nhân gen GA20 31 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo mô sẹo 35 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP, NAA và Kinetin 37 Hình 3.2. Chồi tái sinh từ mô sẹo trên môi trường C1 38 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của NAA và IBA tới hiệu quả ra rễ 40 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của kanamycin tới khả năng sống của thân mầm 44 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kanacycin đến khả năng ra rễ 46 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen 48 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến khả năng biến nạp gen 50 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen 52 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của chủng A. tumefaciens đến khả năng biến nạp gen 54 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen 55 Bảng 3.11. Khả năng tái sinh của mẫu chuyển gen 60 Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra khả năng ra rễ của chồi sau chuyển gen 62 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Rừng bạch đàn Urô tại Brazil 5 Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp GA và vị trí hoạt động của enzym 21 Hình 2.1. Vectơ pBI121 24 Hình 3.1. Hình thái các loại mô sẹo 36 Hình 3.2. Chồi tái sinh từ mô sẹo trên môi trường C1 38 Hình 3.3. Chồi tái sinh trên các công thức môi trường sau 4 tuần nuôi cấy 38 Hình 3.4. Chồi tái sinh từ mô sẹo trên môi trường C1 và trên môi trường C4 sau 4 tuần nuôi cấy 39 Hình 3.5. Chồi ra rễ trên các môi trường sau 4 tuần nuôi cấy 41 Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến sức sống 46 Hình 3.7. Biểu hiện gen gus trên các mẫu thí nghiệm 57 Hình 3.8. Chồi chuyển gen gus tái sinh 57 Hình 3.9. Chồi chuyển gen GA20 tái sinh trên môi trường chứa Km 150 mg/l 61 Hình 3.10. Cây chuyển gen GA20 trên môi trường ra rễ 62 Hình 3.11. Cây chuyển gen được trồng ngoài nhà lưới 63 Hình 3.12. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen GA20 63 1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) là một trong những loài bạch đàn chính được trồng chủ yếu ở Việt Nam. Đây cũng là loài cây chủ lực trong dự án trồng mới 5 triệu hecta rừng đã được triển khai trong cả nước giai đoạn 1998 - 2010. Các nghiên cứu về tỷ trọng gỗ, hàm lượng xenlulozơ, chiều dài sợi gỗ, đã được thực hiện, kết quả thu được cho thấy các tính trạng sinh trưởng và chất lượng gỗ ảnh hưởng lớn đến hiệu suất bột giấy cho ngành công nghiệp giấy. Các đánh giá về sinh trưởng của bạch đàn Urô tại Việt Nam cũng cho thấy tỷ lệ sinh trưởng của bạch đàn Urô tại Việt Nam chậm hơn so với các nước khác như Trung Quốc, Brazil. Vì vậy, các chương trình chọn giống bạch đàn ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào tăng khả năng sinh trưởng, cải thiện chất lượng gỗ và tăng sức chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi. Hiện nay, diện tích rừng tự nhiên ngày càng bị thu hẹp do nạn khai thác bừa bãi, đất đai bị hoang hóa và tác động tiêu cực gây ra bởi biến đổi khí hậu. Trong khi nhu cầu nguyên liệu cho ngành chế biến gỗ và công nghệ bột giấy đang dần gia tăng và tương lai có thể thiếu hụt trầm trọng nếu không có những giải pháp cụ thể và tích cực. Do đó, vấn đề cải thiện giống cây trồng lấy gỗ phục vụ ngành chế biến gỗ và công nghệ bột giấy đang là vấn đề cấp bách. Công nghệ gen là một giải pháp quan trọng và rất hữu hiệu trong trường hợp này. Thông qua việc sử dụng các kĩ thuật trong công nghệ gen cho phép tạo ra những giống cây trồng mới; đột phá về năng suất, chất lượng cũng như khả năng chống chịu. Không những thế cây trồng tạo ra từ công nghệ gen có nhiều đặc tính ưu việt mà cây trồng hoang dại ban đầu không có được. Để chuyển thành công các gen có giá trị vào cây bạch đàn Urô cần phải có một quy trình tái sinh cây hiệu quả cao từ mô sẹo thông qua tạo đa chồi trực tiếp hoặc tạo phôi soma. Quy trình tái sinh cây một số loài bạch đàn phục vụ chuyển gen đã được các nhà khoa học đầu tư nghiên cứu: Bandyopadhyay và cs (1999) tiến hành tái sinh thành công hai loài bạch đàn E. nitens và E. globules từ vật liệu mảnh cấy của cây mầm [26]; Cid và cs (1999) đã tiến hành tái sinh loài bạch đàn lai E. grandis x E. urophylla từ vật liệu cuống lá cây mầm [36]; nghiên cứu tái sinh loài bạch đàn E. tereticornis thông qua phôi soma cũng đã được Parakash và cs (2005) 2 công bố. Dibax và cs (2010) tái sinh loài bạch đàn E. cammaldulensis; Huang và cs (2010) đã xây dựng thành công quy trình tái sinh cho loài bạch đàn E. urophylla từ đỉnh thân mầm [41], [52]. Cho đến nay, nhiều loài bạch đàn đã được nghiên cứu tái sinh thành công thông qua tạo đa chồi hoặc phôi soma từ các vật liệu là mảnh lá, thân cây mầm. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu thu được cho thấy ở mỗi loài bạch đàn, thậm chí ở các dòng trong cùng một loài thì khả năng tái sinh là rất khác nhau (Ho và cs, 1998; Dibax và cs, 2005; Gonzales và cs, 2002; Tournier và cs, 2003) [40], [84]. Trên cơ sở các quy trình tái sinh được xây dựng, một số quy trình chuyển gen vào nhiều loài bạch đàn đã được các nhà khoa học thực hiện thành công bằng việc chuyển các gen chỉ thị, gen chọn lọc và đang áp dụng hiệu quả để chuyển các gen có giá trị. Tetsukawazu và cs (2003) đã được cấp bằng sáng chế về quy trình chuyển gen gus vào loài bạch đàn E. camaldulensis, E. globulus, E. grandis, E. grandis x E. urophylla và E. urophylla từ các mẫu cấy sinh dưỡng lấy từ cây bạch đàn trưởng thành; Cheng và cs (2006) cũng đã được cấp bằng sáng chế về quy trình chuyển gen và chọn lọc cây chuyển gen cho loài bạch đàn E. urophylla. Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng các loài bạch đàn, dòng bạch đàn khác nhau thì cho hiệu suất chuyển gen khác nhau. Do vậy để chuyển gen hiệu quả vào từng loài bạch đàn và từng dòng bạch đàn cụ thể cần có một quy trình thích hợp. Xuất phát từ cơ sở trên tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh và chuyển gen sử dụng Agrobacterium tumefaciens cho đối tượng cây bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla)” nhằm cung cấp cơ sở cho việc tạo giống bạch đàn Urô biến đổi gen sinh trưởng nhanh. Mục tiêu - Xây dựng được quy trình tái sinh cây bạch đàn Urô thông qua mô sẹo. - Xây dựng được quy trình chuyển gen vào cây bạch đàn Urô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. - Tạo được cây bạch đàn Urô chuyển gen mang gen GA20. Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về khả năng tạo cây bạch đàn Urô biến đổi gen, sinh trưởng nhanh ở Việt Nam. 3 Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo cho việc giảng dạy về phương pháp chuyển gen gián tiếp ở bạch đàn. Ý nghĩa thực tiễn: Xây dựng thành công quy trình chuyển gen ở bạch đàn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sẽ làm cơ sở cho việc tạo giống bạch đàn biến đổi gen sinh trưởng nhanh. [...]... giống bạch đàn mới với những tính trạng mong muốn Tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu về sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bạch đàn như ở bạch đàn Urô (Trần Hồ Quang, 2010), bạch đàn lai (Nguyễn Việt Cường và cs, 2013) cho kết quả khả quan [15], [6] 1.3.3 Nghiên cứu tạo giống bạch đàn chuyển gen Đến nay trên thế giới, phương pháp chuyển gen vào bạch đàn phổ biến nhất được sử dụng là chuyển gen. .. năng tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo và xác định môi trường thích hợp cho tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo; 24 + Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA đến khả năng ra rễ và xác định môi trường thích hợp cho ra rễ - Xây dựng quy trình chuyển gen vào bạch đàn Urô + Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh đến khả năng chọn lọc và xác định nồng độ kháng sinh thích hợp cho chọn lọc; + Nghiên cứu. .. bạch đàn biến đổi gen là có thể nhưng hiệu quả chuyển gen thấp ngăn cản sự tổ hợp của một gen mong muốn vào nhiều kiểu gen [50] Vì vậy rất cần các nghiên cứu cải thiện hệ thống tái sinh và hiệu quả biến nạp gen cho các loài bạch đàn 13 Bảng 1.1 Danh sách các nghiên cứu về chuyển gen trên đối tƣợng Eucalyptus 14 15 16 17 Tại Việt Nam, nghiên cứu tạo giống bạch đàn bằng công nghệ chuyển gen hầu như vẫn... Valerio và cs, 2003; Kawaoka và cs, 2006), gen codA chịu mặn (Xiang và cs, 2009; Yamada Watanabe và cs, 2003) , gen Drebl A chịu hạn (Kondo và cs, 2003; Suzuki và cs, 2004) và gen CecropinD kháng bệnh gây ra bởi Pseudomonas solanaceanum (Shao và cs, 2002) đã nghiên cứu chuyển thành công vào nhiều loài bạch đàn [33], [54], [59], [74], [77], [87] Một số công trình nghiên cứu về chuyển gen trên đối tượng bạch. .. oxidase trong các cây chuyển gen GA20 có tác động rõ rệt đến sự kéo dài thân cây do vậy các cây chuyển gen GA20 có sự vượt trội về chiều cao cây so với những cây không chuyển gen, ngược lại những cây chuyển antisense của gen GA20 thì chiều cao cây thấp hơn hẳn những cây không chuyển gen (Carrera và cs, 2000) [30] Việc chuyển gen GA20 có nguồn gốc khác loài vẫn có thể làm thực vật chuyển gen tăng trưởng... (2010) Đây cũng là một trong những nghiên cứu nhằm phục vụ công tác chuyển gen vào cây trồng Qua đó cho thấy, các nghiên cứu ở trong nước cũng tập trung vào gen GA20 nhằm tạo cây có khả năng sinh trưởng nhanh [10] 23 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu thực vật Hạt giống bạch đàn Urô dòng 20 và dòng 55 được Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học lâm... pBI121 Gene GA20 CaMV 35S promoter Xba Sma I I BamH I NOSter Sac I EcoR I Hình 2.1 Vectơ pBI121 a: pBI121 chứa gen gus; b: pBI121 chứa gen GA20 2.2 Nội dung nghiên cứu - Xây dựng quy trình tái sinh cây bạch đàn Urô thông qua giai đoạn mô sẹo + Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp NAA và BAP đến khả năng tạo mô sẹo và xác định môi trường thích hợp cho tạo mô sẹo; + Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin... nguyên sản, gỗ bạch đàn Urô được sử dụng với rất nhiều mục đích như: Gỗ xây dựng, làm đồ dùng trong gia đình, gỗ trụ mỏ, Tuy nhiên, cho đến nay bạch đàn Urô vẫn được xem như là nguyên liệu chính cho công nghiệp sản xuất giấy trên thế giới và Việt Nam 1.2 Tình hình trồng và năng suất bạch đàn Urô ở Việt Nam 1.2.1 Tình hình phát triển diện tích trồng bạch đàn Urô ở Việt Nam Bạch đàn được nhập vào Việt Nam... đàn là loài cây thân gỗ trồng rộng rãi thứ hai trên thế giới Nó là một cây gỗ cứng thương mại quan trọng đối với ngành công nghiệp giấy và gỗ Do vậy nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo, giống bạch đàn hiện nay đang rất được quan tâm Các hướng chính đang được thực hiện bao gồm: 1.3.1 Nhân giống vô tính in vitro cây bạch đàn Tái sinh in vitro cây bạch đàn đã được nghiên cứu từ những... các nghiên cứu về chuyển gen cho bạch đàn Chúng bao gồm các tế bào trần, phôi vô tính, cây mầm, lá mầm, thân mầm, cuống lá của cây trưởng thành, lá của cây nhân giống in vitro, phân đoạn thân thật của bạch đàn Hiệu quả biến nạp và tái sinh của bạch đàn cho hiệu quả tốt hơn với các nguồn vật liệu như lá mầm, trụ dưới lá mầm (thân mầm) (Tibok, 1990; Ho và cs, 1998; Sarotoretto và cs, 2002; Tournier và . VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  LÊ THỊ MẬN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN SỬ DỤNG AGROBACTERIUM TUMEFACIENS CHO ĐỐI TƢỢNG CÂY BẠCH ĐÀN URÔ (EUCALYPTUS. trình tái sinh cây bạch đàn Urô thông qua mô sẹo. - Xây dựng được quy trình chuyển gen vào cây bạch đàn Urô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. - Tạo được cây bạch đàn Urô chuyển gen. loài bạch đàn và từng dòng bạch đàn cụ thể cần có một quy trình thích hợp. Xuất phát từ cơ sở trên tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh và chuyển gen sử dụng Agrobacterium