tumefaciens
2.3.2.1. Xác định nồng độ chất chọn lọc kanamycin
* Xác định ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến tỷ lệ sống của bạch đàn Urô Các đoạn thân mầm được cấy lên môi trường tái sinh tốt nhất (đã thu được ở mục 2.3.1.1.) có bổ sung thêm kháng sinh kanamycin ở các nồng độ khác nhau: 0 mg/l, 10 mg/l, 50 mg/l, 75 mg/l, 100 mg/l, 150 mg/l, 200 mg/l. Sau 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần nuôi, đếm số mẫu sống, xác định tỷ lệ mẫu sống ở mỗi công thức thắ nghiệm.
28
Chồi có chiều cao từ 1,5 - 2,0 cm (đã được tạo ra từ thắ nghiệm tái sinh) được cấy lên môi trường ra rễ tốt nhất (đã thu được ở thắ nghiệm trên) có bổ sung kanamycin ở các nồng độ khác nhau: 0 mg/l, 10 mg/l, 50mg/l, 75mg/l, 100mg/l. Sau 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần nuôi cấy, đếm số mẫu ra rễ, xác định tỷ lệ mẫu ra rễ ở mỗi công thức thắ nghiệm.
2.3.2.2. Tạo vật liệu trước khi chuyển gen
Thân mầm, thân thật được cắt thành những đoạn dài 0,5 - 1,0 cm. Lá mầm giữ lại cuống lá được nuôi cấy trên môi trường tái sinh ở các khoảng thời gian: Cảm ứng 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ trước khi nuôi cấy cộng sinh.
2.3.2.3. Tạo dịch huyền phù
Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: Lấy khuẩn A. tumefaciens chủng C58/gus, EHA101/
gus, LBA4404/gus, C58/GA20 được bảo quản trong glycerol ở - 850C, cấy trải lên môi trường LB đặc bổ sung 50mg/l kanamycin, 50 mg/l rifamycin. Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ 280
C trong 3 ngày.
Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: Chọn một khuẩn cho vào 2ml môi trường LB lỏng bổ sung 50mg/l kanamycin và 50mg/l rifamycin. Nuôi lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 280
C, trong 14 - 16 giờ. Sau đó hút 1 ml dịch vi khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng bổ sung 50mg/l kanamycin và 50mg/l rifamycin. Nuôi lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 280
C, trong 4 Ố 5 giờ. Dịch vi khuẩn được ly tâm lạnh ở tốc độ 5.000 vòng/phút, trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn vi khuẩn trong 1/2 MS lỏng, pha loãng cho tới khi dịch có OD600 đạt ≈ 0,5, sau đó bổ sung 200 M acetosyringone. Dịch huyền phù này có thể dùng biến nạp ngay hoặc giữ ở 4oC trong 1 - 2 giờ.
Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn A. tumefaciens
Môi trƣờng Thành phần hóa học
LB đặc 5g/l Yeast extract + 10g/l NaCl + 10g/l
Trypton + 15g/l Bactor agar, pH =7
LB lỏng 5g/l Yeast extract + 10 g/l NaCl +
10g/l Tryptone, pH = 7 Dịch lỏng tạo dịch huyền phù vi khuẩn Môi trường cơ bản 1/2 MS
29
2. 3.2.4. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy
Mẫu sau xử lý, chuẩn bị cho biến nạp như mục 2.3.2.2, được ngâm trong dung dịch huyền phù vi khuẩn với các khoảng thời gian: 0 phút, 5 phút, 10 phút, 15 phút và 20 phút. Sau đó thấm khô mẫu bằng giấy thấm vô trùng. Chuyển mẫu sang môi trường nuôi cấy cộng sinh (thành phần môi trường phụ thuộc vào các thắ nghiệm tái sinh trên). Môi trường nuôi cộng sinh được bổ sung thêm acetosyringone với nồng độ 200ÌM. Nuôi cấy cộng sinh ở nhiệt độ 250C, trong buồng tối trong 24, 48, 96 giờ.
2. 3.2.5. Diệt khuẩn và tái sinh chồi chuyển gen
Các mẫu sau khi đồng nuôi cấy, được rửa bằng nước cất vô trùng 2 lần. Sau đó ngâm mẫu trong dung dịch 1/2 MS có bổ sung 500mg/l cefotaxim trong 10 phút, rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng. Thấm khô mẫu, chuyển lên môi trường nuôi diệt khuẩn và tái sinh chồi chuyển gen.
Môi trường diệt khuẩn và tái sinh có bổ sung kháng sinh cefotaxim với nồng độ 400mg/l và chất chọn lọc kanamycin (nồng độ phụ thuộc vào thắ nghiệm mục 2.3.2.1) để chọn lọc chồi chuyển gen.