Mẫu thân mầm và lá mầm được nuôi tiền cảm ứng trên môi trường S1 cho thân mầm và S5 cho lá mầm trong 48 giờ trước khi nhiễm với A. tumefaciens C58. Mẫu sau khi nhiễm khuẩn trong 10 phút được nuôi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy 3 ngày cho lá mầm và thân mầm có bổ sung 200 ÌM acetosyringone. Sau 3 ngày đồng nuôi cấy tiến hành rửa khuẩn với dung dịch cefotaxim 500mg/l và cấy chuyển lên môi trường tạo mô sẹo tương ứng cho thân mầm và lá mầm mới có bổ sung 400mg/l cefotaxim, nuôi trong 4 ngày dưới điều kiện tối. Sau đó mẫu được chuyển sang môi trường có thành phần tương tự nhưng bổ sung thêm chất chọn lọc kanamycin ở nồng độ 150 mg/l (giai đoạn này mẫu được nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu 1000 lux). Sau 4 tuần các mẫu mô sẹo cứng, có màu xanh/ hồng được cấy sang môi trường tái sinh chồi có bổ sung 150 mg/l kanamycin để sàng lọc chồi chuyển gen. Kết quả chồi tái sinh thu được trên môi trường chứa chất chọn lọc kanamycin 150 mg/l được thể hiện trong bảng 3.11.
60
Bảng 3.11. Khả năng tái sinh của mẫu chuyển gen Vật liệu Số lần lặp Số mẫu TN Số mẫu sống tái sinh chồi (mẫu)
Tỷ lệ mẫu sống tái sinh chồi (%) Số chồi tái sinh (chồi) ĐC 1 52 - - - 2 57 - - - 3 60 - - - TB Thân mầm 1 275 15 5,5 54 2 256 13 5,1 46 3 264 14 5,3 51 TB 5,3 Lá mầm 1 262 14 5,3 57 2 267 11 4,1 49 3 283 14 4,9 57 TB 4,8
Trên môi trường tái sinh có chứa kanamycin 150 mg/l, thân mầm cho tỷ lệ mẫu sống tái sinh chồi đạt 5,3% trên tổng số mẫu thắ nghiệm; với lá mầm thì tỷ lệ này trung bình đạt 4,8% trên tổng số mẫu. Trong khi ở công thức đối chứng (công thức sử dụng vật liệu chưa được chuyển gen) thì không có mẫu nào tái sinh chồi trên môi trường có kháng sinh kanamycin 150 mg/l. Như vậy, hiệu quả chọn lọc của kháng sinh kanamycin ở nồng độ 150 mg/l đối với bạch đàn Urô đã tìm ra ở quy trình chuyển gen gus là khá thắch hợp cho việc sàng lọc mẫu giai đoạn đầu.
Kết quả mẫu sống tái sinh chồi thu được trên môi trường chứa kanamycin ở nồng độ 150 mg/l thu được thấp hơn rất nhiều với cũng tỷ lệ này trên môi trường tái sinh không chứa kháng sinh của các mẫu không chuyển gen (đã tìm ra ở mục 3.1.). Giải thắch nguyên nhân sự sụt giảm này là do ảnh hưởng của các kháng sinh chọn lọc, kháng sinh diệt khuẩn và vi khuẩn Agrobacterium dư thừa tồn đọng trong môi trường nuôi cấy đã tác động đến hiệu quả tái sinh chồi sau biến nạp. Các kháng sinh vừa có tác dụng diệt khuẩn hoặc chọn lọc mẫu nhưng cũng gây độc cho mẫu cấy nếu sử dụng ở nồng độ cao. Chủng vi khuẩn Agrobacterium dư thừa tồn đọng trong môi trường nuôi cấy có chứa các gen gây độc vir cũng có khả năng ức chế sự sinh
61
trưởng và phát triển của tế bào giống như các loại kháng sinh chọn lọc và kháng sinh diệt khuẩn, thậm chắ gây chết tế bào, hoặc chúng còn ảnh hưởng rất lâu dài đến sự sinh trưởng phát triển của cây con sau này.
Số chồi tái sinh trên môi trường có bổ sung 150 mg/l kanamycin ở 3 lần lặp thu được tổng cộng được 314 chồi (151 chồi từ thân mầm và 163 chồi từ lá mầm). Các chồi này là những chồi sống sót, hình thái bình thường (sau 2 chu kì được cấy chuyển trên môi trường kháng sinh chọn lọc).
Hình 3.9. Chồi chuyển gen GA20 tái sinh trên môi trƣờng chứa Km 150 mg/l
a,b: chồi chuyển gen tái sinh từ thân mầm; c,d: chồi chuyển gen tái sinh từ lá mầm