Trong nghiên cứu quy trình chuyển gen vào thực vật, việc lựa chọn được vật liệu mảnh lá, đoạn thân, mô sẹo hay phôi hạt thắch hợp cho chuyển gen là rất cần thiết. Đối
55
với từng loại cây trồng, tuỳ thuộc vào hệ thống tái sinh mà người ta lựa chọn vật liệu thắch hợp. Chuyển gen vào cây lúa, ngô, bông, cây đu đủ,...sử dụng mô sẹo là thắch hợp nhất, mang lại hiệu quả chuyển gen. Chuyển gen vào cây cà chua, thuốc lá, bạch dương,Ẩ, sử dụng mảnh lá lại mang lại kết quả. Chuyển gen vào cây thông sử dụng phôi hạt. Chuyển gen vào cây cam quýt sử dụng đoạn thân. Ngay trong cùng chi bạch đàn thì vật liệu sử dụng thắch hợp cho chuyển gen cũng khá khác nhau (lá mầm, thân mầm, thân thật, chồi đỉnh, chồi sơ cấp, lá non). Trong đó hai loại vật liệu được sử dụng phổ biến là lá mầm và thân mầm (Tournier và cs, 2003; Tibok và cs, 1990; Quisen và cs, 2007; Dibax và cs, 2010; Sarotoretto và cs, 2002; Gonzalez và cs, 2002; Cheng và cs, 2006; Ho và cs, 1998; Prakash và Gurumurthi, 2009) [35], [41], [45], [70], [71], [82].
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành khảo sát cho 3 nguồn mẫu chắnh: Thân mầm, lá mầm và thân thật và đánh giá ảnh hưởng của các vật liệu này đến khả năng chuyển gen. Từ đó nhằm tìm ra vật liệu thắch hợp nhất cho quá trình biến nạp gen. Kết quả chuyển gen được đánh giá qua biểu hiện tạm thời của gen gus (nhuộm X - gluc) của các mẫu chuyển gen và chồi tái sinh sau chuyển gen.
Các mẫu thân mầm, lá mầm, thân thật được tiền nuôi cấy trong 2 ngày sau đó được nhiễm với A. tumefaciens C58 mang vectơ pBI 121 trong các thời gian 10 phút. Sau 3 ngày đồng nuôi cấy trên môi trường MS* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 200 mg/l AS (thân mầm, thân thật) và MS* + 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 200 mg/l AS (lá mầm) trong điều kiện tối, tiến hành diệt khuẩn với cefotaxim 500mg/l và nuôi cấy mẫu trên môi trường trên bổ sung 400 mg/l cefotaxim. Tỷ lệ mẫu biểu hiện tạm thời gen gus được trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen
CT Vật liệu
Tỷ lệ mẫu biểu hiện tạm
thời gen gus
(%)
Tỷ lệ chồi biểu hiện gen gus/chồi
tái sinh (%)
Tỷ lệ chồi biểu hiện gen gus/tổng
mẫu thắ nghiệm (%) 1 Thân mầm 48,1 13,1 2,5 2 Lá mầm 49,1 24,6 2,9 3 Thân thật 22,7 8,3 0,6 F 34,5 2,3 4,9 F crit 5,1 5,1 5,1
56
Như vậy, khi khảo sát 3 nguồn mẫu sử dụng cho chuyển gen thì từ kết quả thu được trong bảng 3.10 chúng tôi nhận thấy: Vật liệu là thân mầm và lá mầm cho tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus là khá cao, tương ứng là 48,1% và 49,1% trong khi tỷ lệ này ở thân thật chỉ là 22,7%.
Kết quả thắ nghiệm cũng cho thấy, lá mầm có tỷ lệ chồi chuyển gen/chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc cao hơn so với biến nạp gen vào đoạn thân mầm; với tỷ lệ chồi biểu hiện gen gus/chồi tái sinh đạt 24,6% và 2,9% chồi biểu hiện gen gus/tổng số mẫu thắ nghiệm; trên thân mầm thì tỷ lệ này tương ứng đạt được 13,1% chồi biểu hiện gen gus/chồi tái sinh và 2,5% chồi biểu hiện gen gus trên tổng số mẫu thắ nghiệm. Hiệu quả tạo chồi chuyển gen giảm rõ rệt trên đối tượng thân thật, trung bình có 8,3% chồi trong số chồi chuyển gen là có biểu hiện gen gus, và tỷ lệ này chỉ là 0,6% so với tổng số mẫu thắ nghiệm.
Xét tổng thể cả về mẫu biểu hiện gen gus tạm thời và chồi tái sinh sau chuyển gen có biểu hiện gen gus thì thân mầm và lá mầm cho hiệu quả chuyển gen cao hơn hẳn so với thân thật. Giải thắch điều này là do độ non trẻ của mẫu thắ nghiệm; mẫu càng non trẻ thì khả năng biến nạp, tái sinh càng thuận lợi; trong khi đó ở các mẫu trưởng thành còn sự tồn tại của các mô phân sinh khác do vậy khả năng biến nạp và tái sinh là thấp hơn (Teulieres và cs, 1994; Macrae và Van Staden, 1999) [63], [79].
Kết quả này phù hợp với các báo cáo được đưa ra khi nghiên cứu hệ thống tái sinh và chuyển gen cho bạch đàn Urô và loài lai của nó E. grandis x E. urophylla (Sarotoretto và cs, 2002; Gonzalez và cs, 2002; Cheng và cs, 2006) [35], [45]. Như vậy cả hai nguồn mẫu là thân mầm và lá mầm đều có thể sử dụng để chuyển gen cho đối tượng bạch đàn Urô.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Tỉ lệ (%)
Mẫu biểu hiện tạm thời gen gus
Chồi biểu hiện gen gus plus/ Chồi tái sinh
Chồi biểu hiện gen gus plus/mẫu thắ nghiệm
Thân mầm Lá mầm Thân thật
57
Hình 3.7. Biểu hiện gen gus trên các mẫu thắ nghiệm
a, b, c: mẫu cấy biểu hiện tạm thời gen gus; d, e, f: mô sẹo biểu hiện tạm thời gen gus; g, h: chồi mới hình thành biểu hiện gen gus; i: chồi đối chứng
Hình 3.8. Chồi chuyển gen gus tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc 150 mg/l kanamycin
g i b e h d f a c
58
Sơ đồ 3.2. Tóm tắt quy trình chuyển gen vào cây bạch đàn Urô (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cây mầm bạch đàn Urô
Tiền nuôi cấy 2 ngày Thân mầm: S1, lá mầm: S5
Lây nhiễm trong 10 phút với chủng A. tumefaciens C58/gus
Đồng nuôi cấy trong 3 ngày, trong tối Thân mầm: S1 + 200 ÌMAS
Lá mầm: S5 + 200ÌM AS
Rửa khuẩn, cấy lên môi trường tạo mô sẹo Thân mầm: S1 + 400 mg/l cefotaxim
Lá mầm: S5 + 400 mg/l cefotaxim
Cấy chuyển sang môi trường:
Thân mầm: S1 + 400 mg/l cefotaxim + 150 mg/l kanamycin Lá mầm: S5 + 400 mg/l cefotaxim + 150 mg/l kanamycin
Cấy chuyển sang môi trường tạo rễ R5 có bổ sung 75 mg/l kanamycin
Cấy chuyển sang môi trường tạo chồi C1 có bổ sung 150 mg/l kanamycin Đoạn thân mầm 0,5 - 1,0 cm Lá mầm 7 ngày 4 ngày 4 tuần 8 tuần
59