Thời gian tiền nuôi cấy là khoảng thời gian mà mẫu cấy được nuôi cấy trên môi trường tái sinh trước khi tiến hành quá trình lây nhiễm vi khuẩn, trong qua thời gian này các tế bào, mô tiến hành quá trình phân chia mạnh mẽ. Vi khuẩn
A.tumefaciens có khả năng chuyển gen tốt hơn đối với các tế bào, mô đang phân chia. Nhưng khoảng thời gian tiền nuôi cấy là bao nhiêu thì tốt nhất để cho khả năng biến nạp gen của vi khuẩn vào mô, tế bào cao nhất lại cần được nghiên cứu.
Mẫu thân mầm, lá mầm được cắt theo kắch thước thắch hợp và cấy lên môi trường tiền nuôi cấy tương ứng (môi trường tiền nuôi cấy là môi trường tái sinh thắch hợp nhất đã tìm ra ở trên tương ứng cho từng loại vật liệu). Mẫu thực vật được nuôi cấy cảm ứng ở các khoảng thời gian: 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ trước khi thực hiện biến nạp trong 10 phút. Kết quả biểu hiện gen gus tạm thời sau 2 tuần biến nạp được thể hiện trong bảng 3.6.
48
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen CT Thời gian
TNC (giờ)
Tỷ lệ mẫu thân mầm biểu hiện tạm thời gen gus (%)
Tỷ lệ mẫu lá mầm biểu hiện tạm thời gen gus (%)
ĐC 0 15,9 16,2 1 24 24,5 27,0 2 48 46,1 47,4 3 72 38,9 38,7 4 96 28,6 28,5 F 40,5 21,0 F crit 3,5 3,5
Thời gian tiền nuôi cấy có tác động trực tiếp tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn thông qua chỉ tiêu tỷ lệ mẫu cấy biểu hiện tạm thời của gen gus. Ở công thức đối chứng, không thực hiện tiền nuôi cấy, tỷ lệ mẫu có biểu hiện tạm thời của gen
gus ở thân mầm chỉ đạt 15,9%, con số này ở lá mầm là 16,2%. Tỷ lệ mẫu biểu hiện gen gus tạm thời tăng mạnh khi có tác động của thời gian tiền nuôi cấy, dao động từ 24,5% - 46,1% ở thân mầm, 27,0% - 47,4% ở lá mầm. Hiệu quả cao nhất là công thức 2 (thời gian tiền nuôi cấy là 48 giờ), tuy nhiên khi tiếp tục tăng thời gian tiền nuôi cấy lên 72 và 96 giờ, mẫu có xu hướng tạo mô sẹo dẫn tới tỷ lệ biểu hiện gen
gus giảm xuống (chỉ còn 28,6% ở thân mầm và 28,5% ở lá mầm khi thời gian tiền nuôi cấy là 96 giờ). Sở dĩ có sự sụt giảm về tỷ lệ biểu hiện gen gus như vậy là bởi khi thời gian tiền nuôi cấy mẫu là 72 giờ, 96 giờ thì lúc này mẫu cấy có xu hướng phát sinh mô sẹo ở vị trắ vết cắt dẫn đến giảm hiệu quả chuyển gen, do vi khuẩn
Agrobacterium có đặc tắnh là xâm nhiễm qua vết thương.
Quan sát mức độ biểu hiện màu khi nhuộm với thuốc nhuộm X-gluc cho thấy, ở công thức ĐC chỉ xuất hiện các chấm xanh nhỏ rải rác ở thân mầm, lá mầm; trong khi đó ở các mẫu tiền nuôi cấy, biểu hiện màu là các đốm lớn tập trung ở các vị trắ có khả năng tái sinh chồi (ở hai đầu đoạn thân và các lá mầm). Điều này cho thấy hiệu quả của giai đoạn tiền nuôi cấy thể hiện rõ khi chuyển gen thông qua Agrobacterium.
49 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 Tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus plus (%)
0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ
thời gian tiền nuôi cấy (giờ)
thân mầm lá mầm
Biểu đồ 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ biểu hiện gen gus
Căn cứ vào các kết quả trên, chúng tôi lựa chọn thời gian tiền nuôi cấy cho mẫu cấy với thời gian 48 giờ làm cơ sở cho các thắ nghiệm chuyển gen tiếp theo. Quan sát tương tự cũng đã được ghi nhận bởi tác giả Alcantara và cs (2011) trên loài bạch đàn lai E. grandis x E. urophylla [25]. Trong khi Cheng và cs (2006): Thời gian tiền nuôi cấy cho E.grandis x E. urophylla trong 4 ngày là thắch hợp cho chuyển gen (WO 2006/052554) [35]. Trên cùng đối tượng, Michael và cs (2000) chỉ thực hiện tiền nuôi cấy với thời gian 1 ngày, kết quả này đã được công bố trong sáng chế WO 2000/012715 A1R6 [65].