Mẫu thân mầm, lá mầm được tiền nuôi cấy trong 2 ngày sau đó được đem đi lây nhiễm với 3 chủng vi khuẩn Agrobacterium C58, EHA101 và LBA4404 (mang vectơ nhị thể pBI121 chứa gen chỉ thị gus, gen chọn lọc nptII) trong 10 phút, đồng nuôi cấy trong 3 ngày sau đó tiến hành rửa khuẩn và cấy lên môi trường tương ứng có bổ sung kháng sinh với nồng độ thắch hợp. Thắ nghiệm nhằm mục đắch lựa chọn chủng vi khuẩn thắch hợp cho biến nạp gen ở bạch đàn Urô. Kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.9.
54
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của chủng A. tumefaciens đến khả năng biến nạp gen
Công thức Chủng vi khuẩn
Tỷ lệ thân mầm biểu hiện tạm thời
gen gus (%)
Tỷ lệ lá mầm biểu hiện tạm thời gen
gus (%) ĐC - 0,0 0,0 1 C58 48,2 49,3 2 EHA101 48,2 48,3 3 LBA4404 14,0 17,5 F 279,6 232,9 F crit 4,1 4,1
Ở công thức đối chứng (ĐC) không có vi khuẩn mà thay vào đó là dịch LB không cho biểu hiện màu xanh chàm của gen gus sau khi nhuộm X - gluc, dịch nhuộm trong suốt. Như vậy kết quả thắ nghiệm hoàn toàn đáng tin cậy, hiện tượng dương tắnh giả bị loại trừ.
Trong số 3 chủng vi khuẩn thắ nghiệm, có hai chủng vi khuẩn C58 và EHA101 đều cho tỷ lệ biểu biện tạm thời gen gus khá cao ở cả thân mầm và lá mầm. Tỷ lệ này tương ứng là 48,2% và 49,3% khi sử dụng chủng C58 và 48,2%, 48,3% khi sử dụng chủng EHA 101. Trong khi ở các mẫu biến nạp mà chủng vi khuẩn sử dụng là LBA 4404 tỷ lệ này thu được khá thấp, đều nhỏ hơn 20% ở cả thân mầm và lá mầm (14% ở thân mầm và 17,5% ở lá mầm). Như vậy, thực chất cả hai chủng C58 và EHA 101 đều có thể sử dụng để chuyển gen gus nhưng trong nghiên cứu này chúng tôi ưu tiên sử dụng chủng C58 cho các thắ nghiệm tiếp theo do độ ưu thế hơn về tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus ở lá mầm của chủng C58.
Kết quả nghiên cứu thu được của chúng tôi cũng tương tự như các báo cáo của Quisen và cs (2009), Kawaka và cs (2006), Thảo (2007) trên các đối tượng E. camaldulensis, E. urophylla. Hai chủng vi khuẩn A. tumefaciens được sử dụng trong các nghiên cứu này là C58 chứa vectơ pBIN 19 mang gen uidA và gen nptII; và EHA 101 chứa vectơ PTN 289 chứa gen gus [18], [71].