Thời gian nhiễm khuẩn không chỉ quyết định tới khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn vào mẫu biến nạp mà còn ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng sống sót của mẫu trên môi trường chọn lọc. Để đánh giá ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn tới khả năng biến nạp gen, chúng tôi bố trắ thắ nghiệm theo 5 công thức với các khoảng thời gian biến nạp 0, 5, 10, 15 và 20 phút với vi khuẩn A. tumefaciens.
Hai lá mầm được tách riêng và thân mầm được cắt thành đoạn 0,5 - 1,0 cm, nhiễm khuẩn rồi cấy lên môi trường đồng nuôi cấy (S5 cho lá mầm, S1 cho thân mầm có bổ sung thêm 200ÌM acetosyringone), để trong tối. Sau 48 giờ đồng nuôi cấy rửa khuẩn và cấy chuyển lên môi trường tái sinh mới có bổ sung 400mg/l cefotaxim, sau 2 tuần nuôi cấy, lấy toàn bộ mảnh cấy nhuộm X - gluc để kiểm tra khả năng biến nạp. Phân tắch số liệu, kết quả thu được trình bày trong bảng 3.7.
50
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian nhiễm khuẩn đến khả năng biến nạp gen
CT Thời gian nhiễm khuẩn (phút) Thân mầm Lá mầm Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu biểu hiện tạm thời gen gus (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu biểu hiện tạm thời gen gus (%)
ĐC không nhiễm khuẩn 95,7 0,0 94,5 0,0
1 5 90,3 38,5 88,8 41,2 2 10 88,1 46,1 87,7 47,4 3 15 84,2 32,9 84,6 34,2 4 20 79,1 29,1 80,2 30,2 F 12,8 62,2 10,5 79,2 F crit 3,5 3,5 3,5 3,5
Kết quả nghiên cứu chỉ ra thời gian nhiễm khuẩn có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy, thời gian nhiễm khuẩn càng lâu thì tỷ lệ sống của mẫu càng giảm do mẫu bị ngâm lâu trong dung dịch khuẩn dễ bị úng và nhiễm lại. Tỷ lệ sống của mẫu cấy giảm từ 90,3% - 5 phút biến nạp xuống còn 79,1% - 20 phút biến nạp (thân mầm), từ 88,8% - 5 phút biến nạp xuống còn 80,2% - 20 phút biến nạp (lá mầm). Do vậy thời gian biến nạp phải đảm bảo làm sao đủ thời gian cho vi khuẩn xâm nhiễm hiệu quả mà mẫu cấy vẫn có sức sống tốt để thuận lợi cho việc tái sinh ở giai đoạn sau.
Kết quả đánh giá khả năng biến nạp gen vào mẫu cấy ở các khoảng thời gian biến nạp cho thấy: Đối với mảnh lá mầm, ở thời gian nhiễm khuẩn 10 phút cho tỷ lệ mảnh cấy biểu hiện tạm thời gen gus là cao nhất trong các công thức thắ nghiệm(47,4%); đối với đoạn thân mầm nhiễm khuẩn với thời gian 5, 10, 15, 20 phút cho tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus lần lượt là 38,5%, 46,1%, 32,9% và 29,1%. Như vậy đối với cả thân mầm và lá mầm thì thời gian nhiễm khuẩn thắch hợp được xác định là 10 phút, ở khoảng thời gian này tỷ lệ mẫu biểu hiện tạm thời gen gus thu được là cao nhất. Quan sát tương tự đã được báo cáo bởi Kawaka và cs (2006) cho đối tượng E.camaldulensis với thời gian biến nạp trong 10 phút là thắch hợp để chuyển gen.
51 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 Tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus plus (%) không nhiễm khuẩn 5 phút 10 phút 15 phút 20 phút
Thời gian nhiễm khuẩn (phút)
thân mầm lá mầm
Biểu đồ 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ biểu hiện gen gus 3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy tới khả năng biến nạp gen
Thời gian đồng nuôi cấy mẫu là khoảng thời gian mà mẫu cấy đã lây nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens được nuôi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy, môi trường này vừa chứa các chất cần thiết cho mô, tế bào thực vật sinh trưởng và phát triển, lại vừa chứa các yếu tố kắch thắch sự sinh trưởng, phát triển và xâm nhiễm của vi khuẩn vào mô và tế bào thực vật.
Bản chất của vi khuẩn A. tumefaciens là loài vi khuẩn gây bệnh cho thực vật, nên sự tồn tại phát triển với thời gian dài sẽ có tác dụng không mong muốn đến sự sống, phát triển và phát sinh hình thái của mẫu sau này [47], [48]. Nhưng nếu khoảng thời gian này quá ngắn thì sự xâm nhiễm chưa kịp diễn ra, giảm sự biến nạp gen và hiệu quả chuyển gen sẽ thấp. Do vậy, thời gian đồng nuôi cấy thắch hợp sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhiễm và tiến hành quá trình chuyển gen vào mô thực vật, đồng thời sẽ giúp cho bước diệt khuẩn, phục hồi cũng như chọn lọc về sau được dễ dàng. Chắnh vì vậy chúng tôi tiến hành thắ nghiệm này nhằm tìm ra thời gian đồng nuôi cấy phù hợp đảm bảo cho hiệu quả chuyển gen tốt nhất và không ảnh hưởng đến sức sống và khả năng tái sinh của mẫu cấy sau này. Mẫu cấy được tiền nuôi cấy trong 2 ngày và được biến nạp với vi khuẩn A. tumefaciens trong 10 phút, sau đó được đồng nuôi cấy trong các khoảng thời gian 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ngày. Tỷ lệ mẫu sống sau biến nạp và tỷ lệ mẫu biểu hiện tạm thời gen gus được đánh giá sau 2 tuần biến nạp.
52
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen
CT Thời gian đồng nuôi cấy (ngày) Thân mầm Lá mầm Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu biểu hiện tạm thời gen gus (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu biểu hiện tạm thời gen gus (%) ĐC 0 95,5 0,0 94,3 0,0 1 1 ngày 91,1 23,7 89,0 25,3 2 2 ngày 88,1 46,1 87,7 47,4 3 3 ngày 87,8 48,5 87,5 49,6 4 4 ngày 72,4 45,6 75,0 46,3 5 5 ngày 60,5 33,7 61,7 34,0 6 6 ngày 52,1 26,7 54,2 27,4 7 7 ngày 33,1 17,5 33,8 18,3 F 396,6 79,7 186,1 76,8 F crit 2,7 2,7 2,7 2,7
Qua bảng 3.8. cho thấy: Thời gian đồng nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến sự sống sót của mẫu sau đồng nuôi cấy, thời gian đồng nuôi cấy càng dài thì tỷ lệ mẫu sống sót càng giảm. Kết quả ở bảng cho biết: Khi thời gian đồng nuôi cấy từ 1 Ố 3 ngày thì tỷ lệ mẫu sống sau diệt khuẩn đạt kết quả cao từ 95,5 % - 87,8 % ở thân mầm, 94,3 % - 87,5 % ở lá mầm; nhưng khi kéo dài thời gian đồng nuôi cấy lên 5 ngày thì kết quả mẫu sống sau diệt khuẩn giảm xuống còn 60,5 % thân mầm và 61,7% ở lá mầm, khi tiếp tục kéo dài thời gian đồng nuôi cấy lên đến 6 và 7 ngày thì kết quả mẫu sống sau khi diệt khuẩn giảm xuống chỉ còn tương ứng 52,1% và 33,1% ở thân mầm, 54,2% và 33,8% ở lá mầm. Kết quả này có thể lý giải là do thời gian đồng nuôi cấy dài đã tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn A. tumefaciens phát triển nhanh và bao trùm kắn toàn bộ mẫu cấy, khiến mẫu cấy bị chết và số mẫu sống cũng giảm theo.
Sau 2 tuần biến nạp, kết quả biểu hiện gen gus tạm thời cũng bị ảnh hưởng rõ rệt bởi thời gian đồng nuôi cấy. Kết quả bảng 3.8. cho thấy: Thời gian đồng nuôi cấy đã có ảnh hưởng nhất định đến kết quả chuyển nạp gen gus vào mẫu thắ nghiệm, thời gian đồng nuôi cấy quá ngắn hay quá dài thì kết quả này đều kém. Cụ thể: Ở
53
thời gian đồng nuôi cấy là 1 ngày, kết quả tỷ lệ mẫu biểu hiện tạm thời gen gus chỉ là 23,7% ở thân mầm và 25,3% ở lá mầm, kết quả này có thể một phần bị ảnh hưởng bởi mẫu mọc khuẩn sau đồng nuôi cấy thấp, do đồng nuôi cấy quá ngắn chưa đủ thời gian để vi khuẩn phát triển và chuyển gen vào mẫu cấy. Khi thời gian đồng nuôi cấy tăng lên 3 ngày thì kết quả này có sự tăng lên rõ rệt, tỷ lệ mẫu mang gen gus tăng lên đạt 48,5% ở thân mầm và 49,6% ở lá mầm (đạt cao nhất). Ở công thức có thời gian đồng nuôi cấy là 5 ngày tỷ lệ này bắt đầu giảm dần xuống còn 33,7% ở thân mầm và 34,0% ở lá mầm. Khi thời gian đồng nuôi cấy tiếp tục tăng lên đến 6 ngày, 7 ngày thì tỷ lệ này bắt đầu có sự biểu hiện giảm đi nhanh chóng: Tỷ lệ mẫu biểu hiện tạm thời gen gus lần lượt là 26,7% ở thân mầm và 27,4% ở lá mầm ở công thức 6 ngày và giảm xuống còn 17,5% cho thân mầm 18,3% cho lá mầm ở công thức 7 ngày đồng nuôi cấy. Sở dĩ có sự sụt giảm đó là do thời gian đồng nuôi cấy càng dài thì vi khuẩn phát triển càng mạnh, bao trùm lên mẫu cấy, làm mẫu cấy bị chết.
Qua thắ nghiệm này chúng tôi nhận định rằng: Thời gian đồng nuôi cấy thắch hợp nhất cho việc chuyển gen gus vào bạch đàn Urô là 3 ngày, với tỷ lệ mẫu sống sau đồng nuôi cấy là 87,8% ở thân mầm và 87,5% ở lá mầm, tỷ lệ mẫu biểu hiện tạm thời gen gus sau 2 tuần chuyển gen là 48,5% và 49,6% tương ứng ở thân mầm và lá mầm. Tiếp đó là 2 ngày đồng nuôi cấy cũng cho kết quả chuyển gen khá cao. Kết quả này phù hợp với nhận định của Cheng và cs (2006) khi tiến hành chuyển gen trên đối tượng bạch đàn E.grandis x E.urophylla cũng như E. camaldulensis
(Kawaka và cs, 2006) [35]. Tuy nhiên một số nghiên cứu khác lại cho thời gian đồng nuôi cấy cao hơn như 5 ngày (Alcantara và cs, 2011), 6 ngày (Tournier và cs, 2003) [25], [84].
3.2.5. Ảnh hưởng của chủng Agrobacterium tumefaciens đến khả năng biến nạp gen
Mẫu thân mầm, lá mầm được tiền nuôi cấy trong 2 ngày sau đó được đem đi lây nhiễm với 3 chủng vi khuẩn Agrobacterium C58, EHA101 và LBA4404 (mang vectơ nhị thể pBI121 chứa gen chỉ thị gus, gen chọn lọc nptII) trong 10 phút, đồng nuôi cấy trong 3 ngày sau đó tiến hành rửa khuẩn và cấy lên môi trường tương ứng có bổ sung kháng sinh với nồng độ thắch hợp. Thắ nghiệm nhằm mục đắch lựa chọn chủng vi khuẩn thắch hợp cho biến nạp gen ở bạch đàn Urô. Kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.9.
54
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của chủng A. tumefaciens đến khả năng biến nạp gen
Công thức Chủng vi khuẩn
Tỷ lệ thân mầm biểu hiện tạm thời
gen gus (%)
Tỷ lệ lá mầm biểu hiện tạm thời gen
gus (%) ĐC - 0,0 0,0 1 C58 48,2 49,3 2 EHA101 48,2 48,3 3 LBA4404 14,0 17,5 F 279,6 232,9 F crit 4,1 4,1
Ở công thức đối chứng (ĐC) không có vi khuẩn mà thay vào đó là dịch LB không cho biểu hiện màu xanh chàm của gen gus sau khi nhuộm X - gluc, dịch nhuộm trong suốt. Như vậy kết quả thắ nghiệm hoàn toàn đáng tin cậy, hiện tượng dương tắnh giả bị loại trừ.
Trong số 3 chủng vi khuẩn thắ nghiệm, có hai chủng vi khuẩn C58 và EHA101 đều cho tỷ lệ biểu biện tạm thời gen gus khá cao ở cả thân mầm và lá mầm. Tỷ lệ này tương ứng là 48,2% và 49,3% khi sử dụng chủng C58 và 48,2%, 48,3% khi sử dụng chủng EHA 101. Trong khi ở các mẫu biến nạp mà chủng vi khuẩn sử dụng là LBA 4404 tỷ lệ này thu được khá thấp, đều nhỏ hơn 20% ở cả thân mầm và lá mầm (14% ở thân mầm và 17,5% ở lá mầm). Như vậy, thực chất cả hai chủng C58 và EHA 101 đều có thể sử dụng để chuyển gen gus nhưng trong nghiên cứu này chúng tôi ưu tiên sử dụng chủng C58 cho các thắ nghiệm tiếp theo do độ ưu thế hơn về tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus ở lá mầm của chủng C58.
Kết quả nghiên cứu thu được của chúng tôi cũng tương tự như các báo cáo của Quisen và cs (2009), Kawaka và cs (2006), Thảo (2007) trên các đối tượng E. camaldulensis, E. urophylla. Hai chủng vi khuẩn A. tumefaciens được sử dụng trong các nghiên cứu này là C58 chứa vectơ pBIN 19 mang gen uidA và gen nptII; và EHA 101 chứa vectơ PTN 289 chứa gen gus [18], [71].
3.2.6. Ảnh hưởng của nguồn mẫu tới khả năng biến nạp gen
Trong nghiên cứu quy trình chuyển gen vào thực vật, việc lựa chọn được vật liệu mảnh lá, đoạn thân, mô sẹo hay phôi hạt thắch hợp cho chuyển gen là rất cần thiết. Đối
55
với từng loại cây trồng, tuỳ thuộc vào hệ thống tái sinh mà người ta lựa chọn vật liệu thắch hợp. Chuyển gen vào cây lúa, ngô, bông, cây đu đủ,...sử dụng mô sẹo là thắch hợp nhất, mang lại hiệu quả chuyển gen. Chuyển gen vào cây cà chua, thuốc lá, bạch dương,Ẩ, sử dụng mảnh lá lại mang lại kết quả. Chuyển gen vào cây thông sử dụng phôi hạt. Chuyển gen vào cây cam quýt sử dụng đoạn thân. Ngay trong cùng chi bạch đàn thì vật liệu sử dụng thắch hợp cho chuyển gen cũng khá khác nhau (lá mầm, thân mầm, thân thật, chồi đỉnh, chồi sơ cấp, lá non). Trong đó hai loại vật liệu được sử dụng phổ biến là lá mầm và thân mầm (Tournier và cs, 2003; Tibok và cs, 1990; Quisen và cs, 2007; Dibax và cs, 2010; Sarotoretto và cs, 2002; Gonzalez và cs, 2002; Cheng và cs, 2006; Ho và cs, 1998; Prakash và Gurumurthi, 2009) [35], [41], [45], [70], [71], [82].
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành khảo sát cho 3 nguồn mẫu chắnh: Thân mầm, lá mầm và thân thật và đánh giá ảnh hưởng của các vật liệu này đến khả năng chuyển gen. Từ đó nhằm tìm ra vật liệu thắch hợp nhất cho quá trình biến nạp gen. Kết quả chuyển gen được đánh giá qua biểu hiện tạm thời của gen gus (nhuộm X - gluc) của các mẫu chuyển gen và chồi tái sinh sau chuyển gen.
Các mẫu thân mầm, lá mầm, thân thật được tiền nuôi cấy trong 2 ngày sau đó được nhiễm với A. tumefaciens C58 mang vectơ pBI 121 trong các thời gian 10 phút. Sau 3 ngày đồng nuôi cấy trên môi trường MS* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 200 mg/l AS (thân mầm, thân thật) và MS* + 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 200 mg/l AS (lá mầm) trong điều kiện tối, tiến hành diệt khuẩn với cefotaxim 500mg/l và nuôi cấy mẫu trên môi trường trên bổ sung 400 mg/l cefotaxim. Tỷ lệ mẫu biểu hiện tạm thời gen gus được trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen
CT Vật liệu
Tỷ lệ mẫu biểu hiện tạm
thời gen gus
(%)
Tỷ lệ chồi biểu hiện gen gus/chồi
tái sinh (%)
Tỷ lệ chồi biểu hiện gen gus/tổng
mẫu thắ nghiệm (%) 1 Thân mầm 48,1 13,1 2,5 2 Lá mầm 49,1 24,6 2,9 3 Thân thật 22,7 8,3 0,6 F 34,5 2,3 4,9 F crit 5,1 5,1 5,1
56
Như vậy, khi khảo sát 3 nguồn mẫu sử dụng cho chuyển gen thì từ kết quả thu được trong bảng 3.10 chúng tôi nhận thấy: Vật liệu là thân mầm và lá mầm cho tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus là khá cao, tương ứng là 48,1% và 49,1% trong khi tỷ lệ này ở thân thật chỉ là 22,7%.
Kết quả thắ nghiệm cũng cho thấy, lá mầm có tỷ lệ chồi chuyển gen/chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc cao hơn so với biến nạp gen vào đoạn thân mầm; với tỷ lệ chồi biểu hiện gen gus/chồi tái sinh đạt 24,6% và 2,9% chồi biểu hiện gen gus/tổng số mẫu thắ nghiệm; trên thân mầm thì tỷ lệ này tương ứng đạt được 13,1% chồi biểu hiện gen gus/chồi tái sinh và 2,5% chồi biểu hiện gen gus trên tổng số mẫu thắ nghiệm. Hiệu quả tạo chồi chuyển gen giảm rõ rệt trên đối tượng thân thật, trung bình có 8,3% chồi trong số chồi chuyển gen là có biểu hiện gen gus, và tỷ lệ này chỉ là 0,6% so với tổng số mẫu thắ nghiệm.
Xét tổng thể cả về mẫu biểu hiện gen gus tạm thời và chồi tái sinh sau chuyển gen có biểu hiện gen gus thì thân mầm và lá mầm cho hiệu quả chuyển gen cao hơn hẳn so với thân thật. Giải thắch điều này là do độ non trẻ của mẫu thắ nghiệm; mẫu càng non trẻ thì khả năng biến nạp, tái sinh càng thuận lợi; trong khi đó ở các mẫu trưởng thành còn sự tồn tại của các mô phân sinh khác do vậy khả năng biến nạp và tái sinh là thấp hơn (Teulieres và cs, 1994; Macrae và Van Staden, 1999) [63], [79].
Kết quả này phù hợp với các báo cáo được đưa ra khi nghiên cứu hệ thống tái sinh và chuyển gen cho bạch đàn Urô và loài lai của nó E. grandis x E. urophylla (Sarotoretto và cs, 2002; Gonzalez và cs, 2002; Cheng và cs, 2006) [35], [45]. Như vậy cả hai nguồn mẫu là