2.3.1.1. Tạo cây mầm in vitro
Hạt bạch đàn Urô được loại bỏ các mày; sau đó khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 30 giây, rửa lại bằng nước cất khử trùng, sau đó khử trùng bằng Javen 30% trong 15 phút, tráng lại bằng nước cất khử trùng 3 - 5 lần cho sạch. Sau cùng, ngâm mẫu trong nước cất khử trùng trong thời gian 1 tiếng. Thấm khô hạt bằng giấy thấm khử trùng. Sử dụng panh vô trùng gắp hạt gieo vào các đĩa Petri chứa môi trường MS có bổ sung 30g/l sucrose + 8g/l agar để cho nảy mầm. Các đĩa đã gieo hạt được để trong điều kiện tối 3 - 4 ngày, sau đó được chuyển ra nuôi dưới ánh sáng đèn neon (cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày). Sau khoảng 7 - 15 ngày cây con nảy mầm và có chiều cao 1 - 2 cm sẽ được sử dụng làm nguyên liệu cho các thắ nghiệm tiếp theo.
2.3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và BAP đến khả năng tạo mô sẹo
Cây mầm có chiều cao 1 - 2 cm, có 2 lá mầm hoàn chỉnh sẽ được sử dụng làm nguyên liệu cho thắ nghiệm này. Cây mầm được cắt và thu 2 bộ phận:
26
+ Thân mầm: Không dập nát, được cắt thành từng đoạn ngắn, dài từ 0,5 - 1 cm. + Lá mầm: Những lá mầm được sử dụng là những lá mầm cân đối, không bị biến dạng. Hai lá mầm được tách ra riêng biệt, giữ lại phần cuống lá và loại bỏ hoàn toàn phần chồi ngọn.
Thân thật in vitro của cây bạch đàn Urô được cắt thành từng đoạn ngắn, dài từ 0,5 - 1 cm.
Thân mầm, lá mầm, thân thật được cấy trên môi trường MS* (MS (1/2 N2) + 20g/l sucrose + 2,0 g/l phytagel + 100ml/l ND) có bổ sung thêm NAA và BAP ở các nồng độ khác nhau để đánh giá khả năng tạo mô sẹo. Thắ nghiệm được bố trắ trên các công thức thắ nghiệm:
ĐC: MS* S1: MS* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA S2: MS* + 0,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA S3: MS* + 0,5 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA S4: MS* + 1,0 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA S5: MS* + 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA S6: MS* + 1,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA
Thắ nghiệm được đặt trong điều kiện ánh sáng yếu (1000 lux)
Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, đặc điểm mô sẹo (màu sắc, cứng/xốp). Thời gian thu thập: Sau 4 tuần nuôi cấy.
2.3.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, NAA và Kinetin đến tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo
Các mô sẹo cứng, có màu xanh hoặc hồng tạo ra từ thắ nghiệm 1 được sử dụng để thử nghiệm ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo. Các công thức thắ nghiệm khác nhau về hàm lượng BAP, Kinetin bổ sung vào môi trường:
ĐC: MS*
C1: MS* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,1 mg/l Kinetin C2: MS* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,3 mg/l Kinetin C3: MS* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,5 mg/l Kinetin C4: MS* + 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 0,1 mg/l Kinetin
27
C5: MS* + 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 0,3 mg/l Kinetin C6: MS* + 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l Kinetin Thắ nghiệm được đặt trong điều kiện ánh sáng bình thường (2000 lux) Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mô sẹo tạo chồi, số chồi/mẫu, chất lượng chồi. Thời gian thu thập: Sau 4 tuần nuôi cấy.
2.3.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và IBA đến khả năng ra rễ
Các chồi bạch đàn Urô sinh trưởng phát triển tốt có chiều cao từ 1,5 - 2,0 cm được tách riêng và cấy chuyển sang môi trường nuôi cấy chứa NAA và IBA ở các hàm lượng khác nhau. Chồi được nuôi dưới ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ phòng nuôi cấy 25 Ử 20C. Sau 3 - 4 tuần nuôi cấy, xác định tỷ lệ chồi ra rễ, số lượng rễ/chồi.
Các công thức thắ nghiệm được bố trắ như sau: ĐC: MS* R1: MS* + 0,2 mg/l NAA + 0,1 mg/l IBA R2: MS* + 0,2 mg/l NAA + 0,2 mg/l IBA R3: MS* + 0,2 mg/l NAA + 0,3 mg/l IBA R4: MS* + 0,5 mg/l NAA + 0,1 mg/l IBA R5: MS* + 0,5 mg/l NAA + 0,2 mg/l IBA R6: MS* + 0,5 mg/l NAA + 0,3 mg/l IBA
Chỉ tiêu nuôi cấy: Tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ/chồi, ngày bắt đầu ra rễ, chất lượng bộ rễ. Thời gian theo dõi: Sau 4 tuần nuôi cấy.