trưởng nhanh
Việc biểu hiện gen GA20 được phân lập từ các loài khác nhau trong các cây chuyển gen đều làm tăng sự phát triển của cây (Bhatttacharya và cs, 2010) [27]. Cole và cs (1999) đã thấy sự tăng lên đáng kể về chiều cao cây khi chuyển gen AtGA20ox1
vào cây Arabidopsis thaliana [37]. Sự biểu hiện của gen GA200ox1 - phân lập từ cây bông được chuyển gen vào cây Nicotiana benthamiana đã làm tăng hàm lượng GA4, GA7 lên 1,4 - 2,7 lần so với cây đối chứng (Xiao và cs, 2006) [86]. Ở khoai tây, sự thay đổi biểu hiện của enzym GA20 - oxidase trong các cây chuyển gen GA20 có tác động rõ rệt đến sự kéo dài thân cây do vậy các cây chuyển gen GA20 có sự vượt trội về chiều cao cây so với những cây không chuyển gen, ngược lại những cây chuyển antisense của gen GA20 thì chiều cao cây thấp hơn hẳn những cây không chuyển gen (Carrera và cs, 2000) [30]. Việc chuyển gen GA20 có nguồn gốc khác loài vẫn có thể làm thực vật chuyển gen tăng trưởng hơn như AtGA20ox1 từ Arabidopsis thaliana
được chuyển vào cây thuốc lá (Biemelt và cs, 2004) [28].
Trong các cây thân gỗ, GA còn cần thiết cho sự biệt hóa của các tế bào sợi xylem và ảnh hưởng trực tiếp đến sự kéo dài và sự phát triển tỏa tròn của các tế bào này. Gen mã hóa cho enzym GA20 - oxidase từ cây Arabidopsis được thiết kế trong cấu trúc pCV702 chứa promoter 35S đã được Eriksson và cs (2000) chuyển vào cây Dương lai (Populus tremula x P.tremuloides). Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ GA ở lá tăng từ 9% lên 17%, các dòng chuyển gen đều có tốc độ sinh trưởng nhanh và sinh khối tăng cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen, ở chồi khối lượng khô tăng 64%, ở thân tăng 126%, sợi chất gỗ nhiều hơn [42]
Ở nước ta, việc phân lập gen GA20 từ cây Arabidopsis cũng đã được tiến hành trong nghiên cứu của Hồ Văn Giảng và cs (2010). Đây cũng là một trong những nghiên cứu nhằm phục vụ công tác chuyển gen vào cây trồng. Qua đó cho thấy, các nghiên cứu ở trong nước cũng tập trung vào gen GA20 nhằm tạo cây có khả năng sinh trưởng nhanh [10].
24
Chƣơng 2
VẬT LIỆU Vầ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Hạt giống bạch đàn Urô dòng 20 và dòng 55 được Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học lâm nghiệp cung cấp.
2.1.2. Vật liệu di truyền và các chủng vi khuẩn
- Các chủng Agrobacterium tumefaciens C58, EHA101, LBA4404 mang vectơ chuyển gen nhị thể pBI121 chứa gen gus;
- Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 mang vectơ chuyển gen nhị thể pBI121 chứa gen GA20.
Hình 2.1. Vectơ pBI121
a: pBI121 chứa gen gus; b: pBI121 chứa gen GA20
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xây dựng quy trình tái sinh cây bạch đàn Urô thông qua giai đoạn mô sẹo + Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp NAA và BAP đến khả năng tạo mô sẹo và xác định môi trường thắch hợp cho tạo mô sẹo;
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo và xác định môi trường thắch hợp cho tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo;
NOS-pro NTP II (Kan) NOS- ter
CaMV 35S
promoter Gene GUS NOS- ter Xba I BamH I Sma I Hind III Sph I Pst I Sac I EcoR I ATG TGA RB LB pBI121
NOS-pro NTP II (Kan) NOS- ter
CaMV 35S
promoter Gene GA20 NOS- ter Xba I BamH I Sma I Hind III Sph I Pst I Sac I EcoR I ATG TGA RB LB pBI121 a b
25
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA đến khả năng ra rễ và xác định môi trường thắch hợp cho ra rễ.
- Xây dựng quy trình chuyển gen vào bạch đàn Urô
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh đến khả năng chọn lọc và xác định nồng độ kháng sinh thắch hợp cho chọn lọc;
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy thể nhận gen đến khả năng chuyển gen và xác định thời gian tiền nuôi cấy thể nhận gen thắch hợp;
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến khả năng chuyển gen và xác định thời gian nhiễm khuẩn thắch hợp;
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen và xác định thời gian đồng nuôi cấy thắch hợp.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Agrobacterium tumefaciens khác nhau đến khả năng chuyển gen và xác định chủng thắch hợp cho chuyển gen.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu đến khả năng chuyển gen và xác định vật liệu thắch hợp cho chuyển gen;
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Nuôi cấy mô
2.3.1.1. Tạo cây mầm in vitro
Hạt bạch đàn Urô được loại bỏ các mày; sau đó khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 30 giây, rửa lại bằng nước cất khử trùng, sau đó khử trùng bằng Javen 30% trong 15 phút, tráng lại bằng nước cất khử trùng 3 - 5 lần cho sạch. Sau cùng, ngâm mẫu trong nước cất khử trùng trong thời gian 1 tiếng. Thấm khô hạt bằng giấy thấm khử trùng. Sử dụng panh vô trùng gắp hạt gieo vào các đĩa Petri chứa môi trường MS có bổ sung 30g/l sucrose + 8g/l agar để cho nảy mầm. Các đĩa đã gieo hạt được để trong điều kiện tối 3 - 4 ngày, sau đó được chuyển ra nuôi dưới ánh sáng đèn neon (cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày). Sau khoảng 7 - 15 ngày cây con nảy mầm và có chiều cao 1 - 2 cm sẽ được sử dụng làm nguyên liệu cho các thắ nghiệm tiếp theo.
2.3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và BAP đến khả năng tạo mô sẹo
Cây mầm có chiều cao 1 - 2 cm, có 2 lá mầm hoàn chỉnh sẽ được sử dụng làm nguyên liệu cho thắ nghiệm này. Cây mầm được cắt và thu 2 bộ phận:
26
+ Thân mầm: Không dập nát, được cắt thành từng đoạn ngắn, dài từ 0,5 - 1 cm. + Lá mầm: Những lá mầm được sử dụng là những lá mầm cân đối, không bị biến dạng. Hai lá mầm được tách ra riêng biệt, giữ lại phần cuống lá và loại bỏ hoàn toàn phần chồi ngọn.
Thân thật in vitro của cây bạch đàn Urô được cắt thành từng đoạn ngắn, dài từ 0,5 - 1 cm.
Thân mầm, lá mầm, thân thật được cấy trên môi trường MS* (MS (1/2 N2) + 20g/l sucrose + 2,0 g/l phytagel + 100ml/l ND) có bổ sung thêm NAA và BAP ở các nồng độ khác nhau để đánh giá khả năng tạo mô sẹo. Thắ nghiệm được bố trắ trên các công thức thắ nghiệm:
ĐC: MS* S1: MS* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA S2: MS* + 0,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA S3: MS* + 0,5 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA S4: MS* + 1,0 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA S5: MS* + 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA S6: MS* + 1,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA
Thắ nghiệm được đặt trong điều kiện ánh sáng yếu (1000 lux)
Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, đặc điểm mô sẹo (màu sắc, cứng/xốp). Thời gian thu thập: Sau 4 tuần nuôi cấy.
2.3.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, NAA và Kinetin đến tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo
Các mô sẹo cứng, có màu xanh hoặc hồng tạo ra từ thắ nghiệm 1 được sử dụng để thử nghiệm ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo. Các công thức thắ nghiệm khác nhau về hàm lượng BAP, Kinetin bổ sung vào môi trường:
ĐC: MS*
C1: MS* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,1 mg/l Kinetin C2: MS* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,3 mg/l Kinetin C3: MS* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,5 mg/l Kinetin C4: MS* + 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 0,1 mg/l Kinetin
27
C5: MS* + 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 0,3 mg/l Kinetin C6: MS* + 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l Kinetin Thắ nghiệm được đặt trong điều kiện ánh sáng bình thường (2000 lux) Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mô sẹo tạo chồi, số chồi/mẫu, chất lượng chồi. Thời gian thu thập: Sau 4 tuần nuôi cấy.
2.3.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và IBA đến khả năng ra rễ
Các chồi bạch đàn Urô sinh trưởng phát triển tốt có chiều cao từ 1,5 - 2,0 cm được tách riêng và cấy chuyển sang môi trường nuôi cấy chứa NAA và IBA ở các hàm lượng khác nhau. Chồi được nuôi dưới ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ phòng nuôi cấy 25 Ử 20C. Sau 3 - 4 tuần nuôi cấy, xác định tỷ lệ chồi ra rễ, số lượng rễ/chồi.
Các công thức thắ nghiệm được bố trắ như sau: ĐC: MS* R1: MS* + 0,2 mg/l NAA + 0,1 mg/l IBA R2: MS* + 0,2 mg/l NAA + 0,2 mg/l IBA R3: MS* + 0,2 mg/l NAA + 0,3 mg/l IBA R4: MS* + 0,5 mg/l NAA + 0,1 mg/l IBA R5: MS* + 0,5 mg/l NAA + 0,2 mg/l IBA R6: MS* + 0,5 mg/l NAA + 0,3 mg/l IBA
Chỉ tiêu nuôi cấy: Tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ/chồi, ngày bắt đầu ra rễ, chất lượng bộ rễ. Thời gian theo dõi: Sau 4 tuần nuôi cấy.
2.3.2. Chuyển gen vào cây bạch đàn Urô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tumefaciens
2.3.2.1. Xác định nồng độ chất chọn lọc kanamycin
* Xác định ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến tỷ lệ sống của bạch đàn Urô Các đoạn thân mầm được cấy lên môi trường tái sinh tốt nhất (đã thu được ở mục 2.3.1.1.) có bổ sung thêm kháng sinh kanamycin ở các nồng độ khác nhau: 0 mg/l, 10 mg/l, 50 mg/l, 75 mg/l, 100 mg/l, 150 mg/l, 200 mg/l. Sau 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần nuôi, đếm số mẫu sống, xác định tỷ lệ mẫu sống ở mỗi công thức thắ nghiệm.
28
Chồi có chiều cao từ 1,5 - 2,0 cm (đã được tạo ra từ thắ nghiệm tái sinh) được cấy lên môi trường ra rễ tốt nhất (đã thu được ở thắ nghiệm trên) có bổ sung kanamycin ở các nồng độ khác nhau: 0 mg/l, 10 mg/l, 50mg/l, 75mg/l, 100mg/l. Sau 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần nuôi cấy, đếm số mẫu ra rễ, xác định tỷ lệ mẫu ra rễ ở mỗi công thức thắ nghiệm.
2.3.2.2. Tạo vật liệu trước khi chuyển gen
Thân mầm, thân thật được cắt thành những đoạn dài 0,5 - 1,0 cm. Lá mầm giữ lại cuống lá được nuôi cấy trên môi trường tái sinh ở các khoảng thời gian: Cảm ứng 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ trước khi nuôi cấy cộng sinh.
2.3.2.3. Tạo dịch huyền phù
Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: Lấy khuẩn A. tumefaciens chủng C58/gus, EHA101/
gus, LBA4404/gus, C58/GA20 được bảo quản trong glycerol ở - 850C, cấy trải lên môi trường LB đặc bổ sung 50mg/l kanamycin, 50 mg/l rifamycin. Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ 280
C trong 3 ngày.
Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: Chọn một khuẩn cho vào 2ml môi trường LB lỏng bổ sung 50mg/l kanamycin và 50mg/l rifamycin. Nuôi lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 280
C, trong 14 - 16 giờ. Sau đó hút 1 ml dịch vi khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng bổ sung 50mg/l kanamycin và 50mg/l rifamycin. Nuôi lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 280
C, trong 4 Ố 5 giờ. Dịch vi khuẩn được ly tâm lạnh ở tốc độ 5.000 vòng/phút, trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn vi khuẩn trong 1/2 MS lỏng, pha loãng cho tới khi dịch có OD600 đạt ≈ 0,5, sau đó bổ sung 200 M acetosyringone. Dịch huyền phù này có thể dùng biến nạp ngay hoặc giữ ở 4oC trong 1 - 2 giờ.
Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn A. tumefaciens
Môi trƣờng Thành phần hóa học
LB đặc 5g/l Yeast extract + 10g/l NaCl + 10g/l
Trypton + 15g/l Bactor agar, pH =7
LB lỏng 5g/l Yeast extract + 10 g/l NaCl +
10g/l Tryptone, pH = 7 Dịch lỏng tạo dịch huyền phù vi khuẩn Môi trường cơ bản 1/2 MS
29
2. 3.2.4. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy
Mẫu sau xử lý, chuẩn bị cho biến nạp như mục 2.3.2.2, được ngâm trong dung dịch huyền phù vi khuẩn với các khoảng thời gian: 0 phút, 5 phút, 10 phút, 15 phút và 20 phút. Sau đó thấm khô mẫu bằng giấy thấm vô trùng. Chuyển mẫu sang môi trường nuôi cấy cộng sinh (thành phần môi trường phụ thuộc vào các thắ nghiệm tái sinh trên). Môi trường nuôi cộng sinh được bổ sung thêm acetosyringone với nồng độ 200ÌM. Nuôi cấy cộng sinh ở nhiệt độ 250C, trong buồng tối trong 24, 48, 96 giờ.
2. 3.2.5. Diệt khuẩn và tái sinh chồi chuyển gen
Các mẫu sau khi đồng nuôi cấy, được rửa bằng nước cất vô trùng 2 lần. Sau đó ngâm mẫu trong dung dịch 1/2 MS có bổ sung 500mg/l cefotaxim trong 10 phút, rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng. Thấm khô mẫu, chuyển lên môi trường nuôi diệt khuẩn và tái sinh chồi chuyển gen.
Môi trường diệt khuẩn và tái sinh có bổ sung kháng sinh cefotaxim với nồng độ 400mg/l và chất chọn lọc kanamycin (nồng độ phụ thuộc vào thắ nghiệm mục 2.3.2.1) để chọn lọc chồi chuyển gen.
2.3.3. Phân tắch thể nhận gen, mô sẹo, chồi và cây chuyển gen bằng phương pháp hóa sinh pháp hóa sinh
Tiến hành đánh giá sự biểu hiện tạm thời của gen gus được biến nạp vào tế bào, mô và biểu hiện của các chồi và cây chuyển gen theo phương pháp nhuộm tế bào học của Jefferson (1987) như sau: Các mảnh cấy sau 48 giờ nuôi cấy cộng sinh, các chồi và cây hoàn chỉnh sống trên môi trường chọn lọc, được nhuộm với dung dịch X-gluc (50mM Na2HPO4 và NaH2PO4; pH = 7,0; 10 mM K3[Fe(CN)6]; 10mM K4[Fe(CN)6]; 10mM NaEDTA; 0,1% Triton -100; 1,5 mM X - glucuronide), ủ trong tủ ổn nhiệt để ở nhiệt độ 370
C, thời gian ủ từ 24 - 48 giờ. Sau thời gian ủ, mẫu được rửa sạch bằng nước cất khử trùng và ngâm vào dung dịch cồn 70% nhằm loại bỏ diệp lục. Sau khi loại bỏ diệp lục, mẫu được quan sát dưới kắnh hiển vi và chụp ảnh. Những vùng có gen gus biểu hiện, nhuộm có màu xanh lam.
2.3.4. Phân tắch cây chuyển gen bằng phương pháp phân tử
30 * Hóa chất: Bảng 2.2: Thành phần dung dịch đệm tách chiết STT Nồng độ chuẩn cuối cùng Nồng độ Thể tắch (ml) 1 Tris Ố HCl, 1 M, pH = 8,0 0,1 M 2,0 2 NaCl 5 M 1,4 M 5,6 3 EDTA 0,5 M 0,02 M 0,8 4 CTAB 2% 0,4 5 H2O 11,2 Tổng thể tắch 20 * Quy trình:
B1: Cân 200 mg mẫu và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ cho đến khi thành dạng bột mịn.
B2: Bổ sung thêm 700 Ìl dung dịch đệm tách chiết ADN và trộn đều bằng cách đảo ngược nhẹ.
B3: Ủ ở nhiệt độ 650C khoảng 1 giờ (cứ 5 phút đảo nhẹ một lần).
B4: Thêm 600 Ìl dung dịch Chloroform: Isoamyl (24: 1) và đảo đều, để 5 phút ở nhiệt độ phòng.
B5: Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 vòng/phút, ở 40C, trong 5 phút. Dùng pipette hút lấy 500 Ìl dịch nổi sang ống Eppendorf 1,5 ml, ủ vào đá.
B6: Thêm 500 Ìl isopropanol lạnh, ủ hỗn hợp trong đá 15 phút. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 vòng/phút, ở 40
C, trong 10 phút.
B7: Loại bỏ phần dịch nổi phắa trên, rửa ADN kết tủa dưới đáy ống bằng cồn 70% (1 lần). Ly tâm 13000 vòng/phút và làm khô ADN kết tủa ở đáy ống eppendorf.
B8: Thêm 50 Ìl nước khử ion và 2 Ìl RNAse, ủ ở 370C trong 30 phút. B9: Bảo quản ADN tổng số ở -200C.
2.3.4.2. Kiểm tra sự có mặt của gen GA20
Để xác định sự có mặt của gen mục tiêu GA20 trong các dòng bạch đàn chuyển gen, sử dụng kĩ thuật PCR để nhân gen mục tiêu từ ADN genom của các dòng bạch đàn với cặp mồi đặc hiệu cho gen GA20.
31
Vật liệu: ADN genom tách từ lá, thân của các dòng bạch đàn chuyển gen. Cặp mồi đặc hiệu cho gen GA20:
Cặp mồi Trình tự mồi Kắch thƣớc