Trong quá trình chuyển gen, việc chọn lọc và xác định được các cá thể mang gen chuyển là một khâu hết sức quan trọng. Để công tác chọn lọc hiệu quả cần thiết lập được một môi trường chọn lọc với ngưỡng phù hợp để có thể loại bỏ phần lớn các cá thể không mang gen chuyển đồng thời giữ lại được toàn bộ các cá thể đã được chuyển gen. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành chuyển gen chỉ thị gus nằm trong vectơ pBI121. Ngoài gen đắch vectơ này còn mang gen nptII kháng kháng sinh kanamycin, được biểu hiện cùng với gen đắch nên cá thể biểu hiện gen này thường được đánh giá sơ bộ là mang gen đắch. Do đó gen kháng kanamycin được coi là yếu
44
tố chọn lọc cá thể mang gen chuyển. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành xác định ngưỡng nồng độ của kháng sinh kanamycin để chọn lọc hiệu quả cây bạch đàn chuyển gen. Tuy nhiên, cũng cần chú ý, nhân tố chọn lọc kháng sinh khi được sử dụng ở nồng độ quá thấp có thể dẫn đến xác suất xuất hiện một số mô thực vật trốn thoát, do việc bảo vệ các tế bào không chuyển gen này bởi các tế bào chuyển gen xung quanh. Nhưng nếu chọn lọc ở nồng độ quá cao có thể dẫn đến mất mát các mô thực vật do quá trình oxy hóa hoặc mô bị hoại tử (Cervera và cs, 1998) [31]. Hơn nữa, nếu sử dụng nồng độ kanamycin quá cao, mảnh cấy chuyển gen ở giai đoạn sớm tế bào dễ bị chết, do giai đoạn đầu mới nhiễm tế bào có thể mới chỉ sản xuất được lượng enzym kanamycin phosphotransferase ắt. Do đó nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc kanamycin tới khả năng sống sót của mẫu là rất cần thiết.
Một số báo cáo trước đây về tái sinh và chuyển gen cây bạch đàn, nồng độ kanamycin thường được sử dụng dao động từ 10 mg/l (Mullins và cs, 1997) đến 200 mg/l (Laudete và cs, 2002) trong đó phổ biến là ở nồng độ 50 mg/l (Cheng và cs, 2006; Tounier và cs, 2003; Kawazu và cs, 2003) và 100 mg/l (Kawasu và cs, 2003; Serrano và cs, 1997) [35], [56], [57], [61], [68]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thử nghiệm các nồng độ từ 10 mg/l đến 200 mg/l nhằm xác định ngưỡng phù hợp cho chọn lọc cây bạch đàn Urô chuyển gen. Kết quả được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của kanamycin tới khả năng sống của thân mầm
CT Km (mg/l) Tỷ lệ mẫu sống sau 2 tuần (%) Tỷ lệ mẫu sống sau 3 tuần (%) Tỷ lệ mẫu sống sau 4 tuần (%) ĐC 0 100 100 100 1 10 97,1 86,8 75,2 2 50 88,8 70,6 54,5 3 75 86,2 64,2 44,2 4 100 70,3 20,4 11,5 5 150 50,3 15,3 0,0 6 200 0,0 0,0 0,0 F 1738,4 966,2 905,4 F crit 2,8 2,8 2,8
45
Sau 4 tuần nuôi cấy cho thấy, kanamycin ảnh hưởng trực tiếp tới tỷ lệ sống sót của thân mầm. Tỷ lệ sống sót của thân mầm giảm mạnh từ 75,2% (10 mg/l kanamycin) xuống còn 11,5% (100 mg/l kanamycin). Ở nồng độ cao hơn (150 mg/l kanmycin) toàn bộ mẫu đều chết. Khi tăng nồng độ kanamycin lên 200 mg/l, không còn mẫu nào sống được trên môi trường này (ở nồng độ 200 mg/l, tất cả các mẫu đều đã chết từ tuần thứ 2 theo dõi). Căn cứ vào các kết quả trên, chúng tôi lựa chọn nồng độ kanamycin là 150mg/l làm cơ sở để chọn lọc các mẫu bạch đàn chuyển gen ở các thắ nghiệm tiếp theo. Hiệu quả của kanamycin tới khả năng sống của mẫu cũng được ghi nhận tương tự đối với vật liệu là lá mầm.
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 Tỷ lệ sống (%) 0 mg/l 10 mg/l 50 mg/l 75 mg/l 100 mg/l 150 mg/l 200 mg/l Nồng độ kanam ycin (m g/l)
Biểu đồ 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ kanamycin đến tỷ lệ sống của thân mầm
Giải thắch hiện tượng các mô, tế bào bị hoá nâu hay bạch tạng, không phát triển rồi chết trên môi trường có bổ sung kháng sinh, hiện tượng này là do các mô tế bào này không mang gen ngoại lai nptII. Do đó, trên môi trường nuôi cấy có chứa kanamycin, các mô tế bào đã bị kháng sinh này ức chế quá trình sinh tổng hợp protein làm mất sức sống và khả năng phát triển của mẫu. Còn các mẫu sống sót được trên môi trường có chứa kháng sinh là do tế bào có thể đã mang gen ngoại lai
nptII được điều khiển bởi Promotor nos. Khi promotor hoạt động, gen nptII sẽ mã hoá cho enzym kanamycin phosphotransferase làm mất hoạt tắnh của kháng sinh kanamycin nên mô thực vật vẫn phát triển tốt. Tác dụng gây độc của kanamycin đối với mô bạch đàn đã được ghi nhận trên đối tượng E. grandis (Gonzalez và cs, 2002), E. camaldulensis (Quisen và cs, 2009) [45], [71].
46
Hình 3.6 Ảnh hƣởng của nồng độ kanamycin đến sức sống của thân mầm sau 4 tuần nuôi cấy
a: ĐC; b: 75 mg/l; c: 150 mg/l
Điều cần xem xét ở đây là đối với cây bạch đàn Urô hoặc giống lai của nó như E.grandis x E. urophylla thì nồng độ chất chọn lọc cho giai đoạn đầu như tái sinh mô sẹo, tái sinh chồi thường được chọn lọc ở nồng độ cao: 200 mg/l (Laudete và cs, 2002), 100 mg/l (Kawasu và cs, 2003); trong khi chọn lọc ở giai đoạn ra rễ lại thường chỉ là 50 mg/l (Cheng và cs, 2006; Tounier và cs, 2003; Kawazu và cs, 2003) [35], [56], [57], [61]. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thử nghiệm bổ sung để đánh giá khả năng ra rễ của chồi tái sinh ở những mức nồng độ kanamycin khác nhau; từ đó tìm được nồng độ chọn lọc kanamycin thắch hợp cho giai đoạn ra rễ.
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của kanacycin đến khả năng ra rễ
CT Km
(mg/l)
Tỷ lệ ra rễ sau
2 tuần (%) Tỷ lệ ra rễ sau 3 tuần (%) Tỷ lệ ra rễ sau 4 tuần (%)
ĐC 0 28,7 50,0 90,9 1 10 14,6 35,2 52,2 2 50 7,1 12,1 18,5 3 75 0 0 0,7 4 100 0 0 0 F 45,5 278,4 1133,0 F crit 3,5 3,5 3,5
Kết quả thu được trong bảng 3.5. cho thấy: Khi nồng độ kanamycin bổ sung vào môi trường là 100 mg/l thì mẫu cấy bị ức chế hoàn toàn khả năng ra rễ, trong khi ở công thức ĐC (không bổ sung kanamycin) thì tỷ lệ ra rễ vẫn đảm bảo (90,9%).
47
Ở khoảng nồng độ 10 - 50 mg/l kanamycin bổ sung vào môi trường, khả năng ra rễ của bạch đàn Urô bị ức chế rõ rệt, tuy nhiên mức độ ức chế ra rễ ở mỗi nồng độ là khác nhau. Điều dễ nhận thấy đó là sự sụt giảm đáng kể tỷ lệ mẫu cấy ra rễ: ở công thức bổ sung 10 mg/l kanamycin thì tỷ lệ ra rễ sau 2 tuần chỉ là 14,6%, 3 tuần là 35,2% và đến 4 tuần thì có tăng thêm (52,2%) tuy nhiên con số này vẫn nhỏ hơn nhiều so với tỷ lệ ra rễ thu được ở công thức ĐC (28,7% sau 2 tuần, 50% sau 3 tuần và 90,9% sau 4 tuần). Trên môi trường bổ sung 50 mg/l kanamycin thì tỷ lệ ra rễ còn sụt giảm hơn nữa, chỉ xấp xỉ 1/5 so với ĐC (tỷ lệ ra rễ đạt 18,5% sau 4 tuần nuôi cấy).
Ở nồng độ bổ sung 75 mg/l kanamycin thì hầu như mẫu cấy nào cũng bị ức chế ra rễ, sau 4 tuần chỉ có 1 mẫu duy nhất có tái sinh rễ, nhưng rễ mảnh, ngắn, đầu rễ bị thâm đen. Theo Brukhin và cs (2000), ngưỡng nồng độ chất chọn lọc phù hợp khi loại bỏ được khoảng 90% các cây không chuyển gen [29]. Do vậy chúng tôi lựa chọn kanamycin ở nồng độ 75 mg/l để chọn lọc cây chuyển gen ở giai đoạn ra rễ cho bạch đàn Urô.