Trong nuôi cấy mô, Cytokinin có tác dụng kắch thắch rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại Cytokinin thì BAP và Kinetin là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả (Vũ Văn Vụ, 2007) [22], [23]. Nhiều nghiên cứu trước đây của Sung và cs (2003); Gorinova (2005), Gubis và cs (2004) đều cho thấy: Khi phối hợp các Cytokinin như là BAP, Kinetin và Zeatin với các Auxin như NAA, IBA, và 2,4D thì tác động phức hợp của chúng sẽ cho tỷ lệ tạo chồi cao hơn so với khi sử dụng riêng rẽ từng chất [46]. Cũng như vậy, Tibok và cs (1995) đã chứng minh rằng nồng độ NAA thấp (0,2 mg/l) sẽ kắch thắch sự tái sinh chồi bạch đàn Urô [83].
Theo nghiên cứu của Dibax và cs (2005) cho đối tượng E. camaldulensis, nồng độ BAP cao hơn NAA sẽ cho hiệu quả tạo chồi tốt hơn, tuy nhiên nếu sử dụng BAP ở nồng độ quá cao mẫu nuôi cấy dễ bị thủy tinh hóa, giảm tỷ lệ chồi hữu hiệu [40].
a b
37
Trên cơ sở tham khảo các kết quả nghiên cứu của những tác giả truớc đó và có những cải tiến, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng tổ hợp BAP, Kinetin và NAA với sự chênh lệch nồng độ nghiêng về phắa Cytokinin để đánh giá hiệu quả tạo chồi trực tiếp từ mô sẹo. Kết quả tạo chồi thu được trên các công thức môi truờng được thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của BAP, NAA và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo
CTTN BAP (mg/l) NAA (mg/l) Ki (mg/l) Tỷ lệ mô sẹo tạo chồi (%) Số chồi /mẫu (chồi) Chất lƣợng chồi ĐC - - - 0 0 C1 0,5 0,2 0,1 87,7 8,4 T C2 0,5 0,2 0,3 88,6 6,1 K C3 0,5 0,2 0,5 87,6 3,5 TB C4 1,0 0,5 0,1 66,8 5,7 K C5 1,0 0,5 0,3 86,3 7,1 T C6 1,0 0,5 0,5 85,6 4,2 TB F 4,7 36,4 F crit 5,1 5,1
Ghi chú: Chất lượng chồi trung bình (TB): Chiều cao chồi không đồng đều, chồi nhỏ Chất lượng chồi khá (K): Chiều cao chồi không đồng đều, chồi mập Chất lượng chồi tốt (T): Chiều cao chồi đồng đều, vươn dài, chồi mập
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Số chồi/mẫu (chồi) ĐC C1 C2 C3 C4 C5 C6 Môi trường
Biểu đồ 3.1. Chồi tái sinh trên các môi trƣờng
Số liệu thu được cho thấy mẫu cấy được nuôi trên môi trường bổ sung tổ hợp BAP, Kinetin và NAA cho hiệu quả tái sinh chồi từ mô sẹo khá cao, trong khi ở công thức đối chứng (công thức không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng) thì không có mô sẹo nào tái sinh chồi. Tỷ lệ mô sẹo tạo chồi thu được đạt từ 66,8% đến
38
88,6%. Hơn nữa chỉ tiêu số chồi/mẫu thu được ở các công thức cũng có sự khác biệt rất rõ. Trong đó công thức C1 bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,2 mg/l NAA và 0,1 mg/l Kinetin cho số chồi/mẫu đạt cao nhất (8,4 chồi/mẫu).
Hình 3.2. Chồi tái sinh từ mô sẹo trên môi trƣờng C1
a: sau 1 tuần; b: sau 2 tuần; c: sau 4 tuần nuôi cấy
Trong các công thức nghiên cứu, 4 công thức cho hiệu quả tạo chồi triển vọng hơn cả là:
Công thức C1 cho tỷ lệ mô sẹo tạo chồi là 87,7%; số chồi/mẫu đạt 8,4 chồi; chồi tạo ra đồng đều, mập.
Công thức C2 cho tỷ lệ mô sẹo tạo chồi là 88,6% và thu được 6,1 chồi/mẫu; chồi tạo ra mập tuy nhiên chiều cao các chồi lại không đồng đều.
Công thức C3 cho tỷ lệ mô sẹo tạo chồi là 87,6% ; đạt 3,5 chồi/mẫu; chồi tạo ra chiều cao không đồng đều, chồi nhỏ.
Công thức C5 cho tỷ lệ mô sẹo tạo chồi là 86,3%; 7,1 chồi/mẫu; chồi tạo ra chiều cao đồng đều, chồi mập.
Hình 3.3. Chồi tái sinh trên các công thức môi trƣờng sau 4 tuần nuôi cấy
C2 C4 C3 C5 C6 C1 a b c
39
Như vậy, nếu xét cả ba tiêu chắ để đánh giá khả năng tái sinh chồi là tỷ lệ mô sẹo tái sinh chồi trên môi trường, số chồi và đặc điểm chồi tạo ra thì công thức C1 cho ưu thế hơn cả. Những chồi tạo ra trên môi truờng này phát triển đồng đều, chồi mập, khỏe; do vậy sẽ cung cấp nguồn cây in vitro hữu hiệu cho quá trình ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh. Trong khi ở các công thức có hàm lượng Cytokinin bổ sung vào môi trường cao hơn (C2, C3) thì tỷ lệ mô sẹo tạo chồi thu được là cao nhưng chồi tạo ra không đều, thường nhỏ; sở dĩ có điều này có thể là do hiệu quả thúc đẩy kéo dài chồi, thân của Cytokinin khi ở nồng độ cao, trong khi sinh trưởng bề ngang vẫn chưa kịp đáp ứng.
Hình 3.4. Chồi tái sinh từ mô sẹo trên môi trƣờng C1 và trên môi trƣờng C4 sau 4 tuần nuôi cấy
Một số công trình nghiên cứu về tái sinh bạch đàn cũng đã được công bố, tuy nhiên các kết quả nghiên cứu thu được cho thấy ở mỗi loài bạch đàn, thậm chắ trong cùng loài bạch đàn thì khả năng tái sinh là rất khác nhau. Dibax và cs (2005) đã thu được những mô sẹo tạo chồi với tỷ lệ đạt 54% cho E. camaldulensis từ mẫu lá mầm [40]. Trong khi nghiên cứu của Tibok và cs (1995) tái sinh chồi qua mô sẹo từ thân mầm E.urophylla trên môi trường MS + 0,2 mg/l NAA + 0,2 mg/l BAP sau 28 ngày với tỷ lệ tái sinh chỉ đạt 37,5 Ử 5% [83]. Tuy nhiên, Cid và cs (1999) khi nghiên cứu quy trình tái sinh từ vật liệu là cuống lá mầm E.grandis x E. urophylla lại thấy tỷ lệ mô sẹo tạo chồi đạt 98% trên môi trường SP + 5ÌM zeatin (1mg/l zeatin) + 0,5 ÌM NAA (0,09 mg/l NAA) [36].