rõ rệt. Ảnh hưởng đặc trưng của sự ra hoa của gibberellin là kắch thắch sự sinh trưởng kéo dài và nhanh chóng của cụm hoa. Gibberellin kắch thắch cây ngày dài ra hoa trong điều kiện ngày ngắn. Gibberellin ảnh hưởng đến sự phân hóa giới tắnh của hoa, ức chế sự phát triển hoa cái và kắch thắch sự phát triển hoa đực.
1.4.2. Sinh tổng hợp gibberellin và vai trò của gen GA20 trong sự sinh tổng hợp gibberellin gibberellin
* Sinh tổng hợp gibberellin trong thực vật
Mỗi phân tử GA thường có từ 19 đến 20 nguyên tử cácbon. Quá trình sinh tổng hợp của chúng đã được hiểu rõ nhờ phương pháp sử dụng hệ thống enzym không phụ thuộc vào tế bào. Phương pháp này người ta sử dụng cơ chất đã đánh dấu phóng xạ được enzym chuyển hóa thành các sản phẩm tương ứng dưới các điều kiện riêng với sự tham gia của các nhân tố thắch hợp để tìm ra từng bước của quá trình này (Davies và cs 1995; Neil và cs, 2002) [39], [69]. Hệ thống sinh tổng hợp
in vitro này cũng được sử dụng để nhận ra các mối quan hệ của các chất ức chế trong trình tự sinh tổng hợp dẫn đến các GA khác nhau. Sinh tổng hợp GA đã được làm sáng tỏ bằng cách gây đột biến, tách dòng và xác định đặc tắnh của các enzym liên quan đến sinh tổng hợp GA. Tất cả các GA đều dẫn xuất từ bộ khung ent - Gibberellan và được thông qua ent - kauren. Quá trình sinh tổng hợp GA ở thực vật bậc cao được chia thành 3 giai đoạn theo các enzym thắch hợp liên quan đến sự định vị bên trong tế bào:
(1) Sinh tổng hợp ent - kaurene dưới sự chuyển hóa của các enzym terpene cyclase hoạt động trong lạp thể
(2) Chuyển hóa ent - kaurene thành GA12 thông qua micromal cytochrome P450 monoxygenase liên kết với mạng lưới nội chất
20
(3) Sự tạo thành các GA khác nhau thông qua các dioxygenase định vị trong tế bào chất.
- Sự tạo thành ent - kaurene: GA cũng như tất cả các isoprenoid khác đều được tạo thành từ các hợp chất C5 isopentenyl diphosphate (IPP), IPP được tổng hợp từ axit mevalonic (MVA) (Chappell và cs, 1995) [32]. Trong tế bào chất MVA được phosphoryl hóa thông qua 2 bước thành MVA - 5 - diphosphate sau đó chất này bị khử carbon tạo thành IPP. Tuy nhiên, một số nghiên cứu mới đã chỉ ra rằng IPP cũng có thể được tạo thành không thông qua con đường MVA trong lạp thể (Lichtenthaler và cs, 1999; Rhomer và cs, 1999) [62].
Nhìn chung, các phân tử tiền thân của GA ban đầu cũng được tạo thành thông qua con đường 1- deoxy - D - xylulose 5 - phosphate trong lục lạp của các mô có màu xanh. IPP được tạo thành thông qua phản ứng được xúc tác bởi một isomerase thành dimethylallyl - PP. Ba phân tử IPP được gắn từng bước vào hợp chất này để tạo thành geranyl diphosphate, farnnesyl diphosphate, và cuối cùng là một hợp chất C20 geranyl geranyl diphosphate (GGPP). GGPP được đóng vòng thông qua copalyl diphosphate (CPP) tạo thành ent - kaurene. Các bước sau được xúc tác bởi 2 enzym là CPP synthase (hay ent-kaurene synthase A) và ent - kaurene synthase (hay
ent - kaurene synthase B) (Aach và cs, 1997) [24].
- Sự oxy hóa ent-kaurene thành GA12 - aldehyde: Các phản ứng được xúc tác bởi các monooxygenase được định vị trên mạng lưới nội chất, các phản ứng này cần có O2 và NADPH cho sự hoạt động và có liên quan đến cytochrome P450. Ent - kaurene được oxy hóa theo từng bước ở vị trắ C - 19 thông qua ent-kaurenol và ent - kaurenal thành axit ent - kaurenoic. Sau đó, axit ent-kaurenoic được gắn OH thành axit ent - 7 - hydroxykaurenoic và cuối cùng nó bị oxy hóa thành GA12 - aldehyde. GA12 - aldehyde được cho là chất trung gian đầu tiên cho sự tạo thành các GA khác nhau (Jan và cs, 1987; Chappell và cs 1995; Wihelm và cs, 2000) [32], [53], [85].
- Sự oxy hóa từ GA12 - aldehyde thành các GA khác nhau: Sự chuyển hóa của giai đoạn thứ 3 xảy ra đầu tiên ở tế bào chất. Hầu hết các phản ứng được xúc tác bởi các enzym dioxygenase hòa tan trong tế bào chất, các phản ứng này cần 2- oxoglutarate như một đồng cơ chất, Fe2+
và ascorbate. Tuy nhiên, phụ thuộc vào các loài thực vật và các mô thì một số bước ban đầu vẫn có thể được xúc tác bởi các
21
enzym monooxygenase. Sự gắn nhóm OH ở vị trắ C12 và C13 có thể liên quan đến cả hai loại enzym. GA12 - aldehyde cũng bị oxy hóa bởi monooxygenase hoặc dioxyhenase ở vị trắ C17. Do đó, chuyển nhóm aldehyde thành nhóm axit carboxylic để tạo thành GA12. Con đường 13 - hydroxylation (hydroxyl hóa tại vị trắ carbon 13) là phổ biến đối với các thực vật bậc cao, GA53 được tạo thành qua các bước trung gian tiếp sau GA12. Sau đó, oxy hóa từng bước ở C20 tạo thành vòng lactone (liên quan đến C19 giữa C4 và C10) và mất C20 dưới dạng CO2, các phản ứng này được xúc tác bởi một phức hợp các enzym GA20-oxidase, thông qua GA44 và GA19 để tạo thành GA20. Dựa trên bước này và các bước tiếp theo, ở các loài và các cơ quan khác nhau thì sự oxy hóa đặc hiệu có thể tạo ra một họ các GA khác nhau. Hoạt tắnh sinh học đáng kể chỉ có thể được tìm thấy ở các C19 - GA, các chất này được gắn nhóm OH ở vị trắ 3β (Jan và cs, 1987; Wihelm và cs, 2000) [53], [85].
Hình 1.2. Con đƣờng sinh tổng hợp GA và vị trắ hoạt động của enzym GA20-oxidase
Ngược lại, sự gắn nhóm OH ở vị trắ 2β (vắ dụ: sự chuyển GA1 thành GA8) làm giảm mạnh hoạt tắnh sinh học. Các phản ứng oxy hóa xa hơn ở bước này có chức năng giới hạn nhiệm vụ của GA. Bằng chứng là có một vài isoenzym của GA20 - oxydase,
22
3β - hydroxylase và 2β - hydroxylase tồn tại có cơ chất đặc hiệu ở mức khá thấp và có thể có những tác động trùng lặp nhau (Jan và cs, 1987; Wihelm và cs, 2000) [53].
* Vai trò của gen GA20 trong quá trình sinh tổng hợp GA
Trong số các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp GA dạng hoạt động thì gen GA20 mã hoá cho enzym GA - 20 oxidase giữ vai trò rất quan trọng trong việc điều khiển quá trình sinh tổng hợp GA ở tế bào thực vật. Enzym này xúc tác cho sự chuyển hoá GA12/GA53 thành GA9/GA20 thông qua 3 phản ứng oxi hoá khử liên tiếp, mà GA9/GA20 lại là tiền chất trực tiếp để tạo thành GA1/GA4 có hoạt tắnh sinh học. Do đó enzym GA20 - oxidase được coi là một enzym chìa khoá quan trọng trong quá trình điều hoà sinh tổng hợp gibberellin dạng hoạt động, có hoạt tắnh kắch thắch sự biệt hóa và kéo dài mạch xylem làm cây thân gỗ tăng trưởng về chiều cao và đường kắnh. Khi tăng cường biểu hiện gen mã hóa cho enzym GA - 20 oxidase ở trong cây Arabidopsis thaliana cho thấy các cây chuyển gen nở hoa sớm hơn và chiều dài thân cao hơn so với cây đối chứng. Trong khi đó ở những cây chuyển gen ức chế hoạt động của enzym này cho kết quả ngược lại. Chắnh vì vậy, việc sử dụng các phương pháp sinh học nhằm tăng cường sinh tổng hợp GA ở các loài cây lâm nghiệp sẽ là một hướng nghiên cứu triển vọng trong việc tạo giống cây lâm nghiệp sinh trưởng nhanh (Eriksson và cs, 2000) [42].
Hình 1.3. Sơ đồ thể hiện vai trò của GA20-oxidase trong sinh tổng hợp gibberellin
Đến nay, gen GA20 đã được phân lập từ nhiều đối tượng khác nhau: Đậu Hà Lan, lúa gạo, thuốc lá, rau diếp, Arabidopsis thaliana,Ẩ(Nakayama và cs, 2005). Ở cây
Arabidopsis, người ta đã xác định được trình tự nucleotide hoàn chỉnh của gen GA20
23
3 đoạn exon có chiều dài 1131 bp, mã hoá cho phân tử protein là GA20 - oxidase bao gồm 377 axit amin và có khối lượng phân tử là 43,4 kDa (Yun và cs, 1995) [88].