30 * Hóa chất: Bảng 2.2: Thành phần dung dịch đệm tách chiết STT Nồng độ chuẩn cuối cùng Nồng độ Thể tắch (ml) 1 Tris Ố HCl, 1 M, pH = 8,0 0,1 M 2,0 2 NaCl 5 M 1,4 M 5,6 3 EDTA 0,5 M 0,02 M 0,8 4 CTAB 2% 0,4 5 H2O 11,2 Tổng thể tắch 20 * Quy trình:
B1: Cân 200 mg mẫu và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ cho đến khi thành dạng bột mịn.
B2: Bổ sung thêm 700 Ìl dung dịch đệm tách chiết ADN và trộn đều bằng cách đảo ngược nhẹ.
B3: Ủ ở nhiệt độ 650C khoảng 1 giờ (cứ 5 phút đảo nhẹ một lần).
B4: Thêm 600 Ìl dung dịch Chloroform: Isoamyl (24: 1) và đảo đều, để 5 phút ở nhiệt độ phòng.
B5: Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 vòng/phút, ở 40C, trong 5 phút. Dùng pipette hút lấy 500 Ìl dịch nổi sang ống Eppendorf 1,5 ml, ủ vào đá.
B6: Thêm 500 Ìl isopropanol lạnh, ủ hỗn hợp trong đá 15 phút. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 vòng/phút, ở 40
C, trong 10 phút.
B7: Loại bỏ phần dịch nổi phắa trên, rửa ADN kết tủa dưới đáy ống bằng cồn 70% (1 lần). Ly tâm 13000 vòng/phút và làm khô ADN kết tủa ở đáy ống eppendorf.
B8: Thêm 50 Ìl nước khử ion và 2 Ìl RNAse, ủ ở 370C trong 30 phút. B9: Bảo quản ADN tổng số ở -200C.
2.3.4.2. Kiểm tra sự có mặt của gen GA20
Để xác định sự có mặt của gen mục tiêu GA20 trong các dòng bạch đàn chuyển gen, sử dụng kĩ thuật PCR để nhân gen mục tiêu từ ADN genom của các dòng bạch đàn với cặp mồi đặc hiệu cho gen GA20.
31
Vật liệu: ADN genom tách từ lá, thân của các dòng bạch đàn chuyển gen. Cặp mồi đặc hiệu cho gen GA20:
Cặp mồi Trình tự mồi Kắch thƣớc
Mồi 1: F - ga20 Ara 5’gtt tcg taa caa cat ctc ctg agg 3’
1120 bp Mồi 2: R - ga20 Ara 5’ggt gag cca atc tga aaa ggc 3’
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng nhân gen GA20
TT Thành phần Thể tắch (Ìl)
1 H2O deion 14,5
2 10X PCR buffer minus Mg2+ 2,5
3 25 mM MgCl2 2,5
4 2,5 mM dNTP mix 2,0
5 Mồi 1: F - ga20 Ara 1,0
6 Mồi 2: R - ga20 Ara 1,0
7 DNA genom (pha loãng 200ng/ Ìl) 1,0
8 Taq DNA polymerase (5 U/ Ìl) 0,5
Tổng thể tắch 25
Chương trình chạy PCR: 950
C trong 3 phút; 940C trong 1 phút, 560C trong 1 phút, 720C trong 1 phút 30 giây, lặp lại 30 chu kì; 720C trong 10 phút, bảo quản ở 40C.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.