Xây dựng quy trình tái sinh và thử nghiệm khả năng chuyển gen gus vào cây thông nhựa

luận văn thạc sĩ, tiến sĩ, cao học, luận văn

Bộ giáo dục và đào tạo trờng đại học nông nghiệp hà nội ---------- ---------- Đô TIếN PHáT XÂY DựNG QUY TRìNH TáI SINH Và THử NGHIệM KHả NĂNG CHUYểN GEN GUS VàO CÂY THÔNG NHựA (PINUS MERKUSII JUNGH. & DE VRIES) Luận văn thạc sĩ nông nghiệp Chuyên ngành : Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số : 60.62.05 Ngời hớng dẫn khoa học: ts. ĐINH THị PHòNG Hà Nội - 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược công bố trong bất kỳ tài liệu nào. Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2009 Tác giả luận văn ðỗ Tiến Phát Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn cao học, tôi ñã nhận ñược sự quan tâm giúp ñỡ nhiệt tình từ nhiều cá nhân và cơ quan: Trước tiên cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến TS. ðinh Thị Phòng, Viện Công nghệ sinh học, người ñã tận tình hướng dẫn, tạo mọi ñiều kiện thuận lợi, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành, sâu sắc ñến GS.TS. Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà và Ban lãnh ñạo Viện Công nghệ sinh học ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi, ñịnh hướng, ủng hộ và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện và hoàn thiện luận văn. Xin gửi tới các thầy cô và cán bộ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội lời cảm ơn chân thành và sâu sắc, những người ñã giảng dạy kiến thức, truyền ñạt kinh nghiệm và dành những ñiều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn những chia sẻ, ñịnh hướng, hỗ trợ nhiệt tình và các ý kiến ñóng góp bổ ích của các cô chú, anh chị và các bạn ñồng nghiệp Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học. Cuối cùng, tôi muốn gửi ñến những người thân yêu trong gia ñình, bè bạn một tình cảm sâu nặng và lòng biết ơn sâu sắc, những người ñã luôn ở bên tôi, chia sẻ ñộng viên, ủng hộ và dành mọi ñiều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2009 Tác giả luận văn ðỗ Tiến Phát Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC STT Nội dung Trang Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các hình vii 1. MỞ ðẦU 1 1.1. Tính cấp thiết của ñề tài 1 1.2. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 2 1.3. Ý nghĩa khoa học của của ñề tài 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu chung về cây Thông nhựa 3 2.2 Sâu róm hại thông 5 2.3 Công nghệ sinh học trong cải tiến giống cây trồng 8 2.4 Phương pháp sàng lọc và ñánh giá cây chuyển gen 14 2.5 Một số thành tựu về chuyển gen trên ñối tượng cây lâm nghiệp 17 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu 21 3.2 Phương pháp nghiên cứu 22 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Xây dựng quy trình tái sinh cây thông nhựa thông qua ña chồi 27 4.1.1 Xác ñịnh môi trường thích hợp cho nuôi cấy in vitro cây thông nhựa 27 4.1.2 Ảnh hưởng của BAP ñến hiệu quả tạo ña chồi cây thông nhựa từ phôi hạt chín 29 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 4.1.3 Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng tới khả năng tạo ña chồi từ phôi hạt chín 31 4.1.4 Xác ñịnh nồng ñộ BAP thích hợp cho tạo ña chồi thông qua cây mầm 34 4.1.5 Nhân nhanh cây in vitro từ hai loại nguyên liệu nuôi cấy 36 4.1.6 Kết quả tạo rễ in vitro cây thông nhựa 39 4.1.7 Xác ñịnh giá thể thích hợp cho việc ra cây in vitro 45 4.2 Kết quả chuyển gen gus vào cây thông nhựa 49 4.2.1 Xác ñịnh ngưỡng nồng ñộ chất chọn lọc PPT và hygromycine trong thí nghiệm chuyển gen 49 4.2.2 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới hiệu quả chuyển gen vào phôi hạt chín nguyên vẹn 52 4.2.3 Ảnh hưởng của tuổi cây mầm tới hiệu quả chuyển gen gus thông qua Agrobacterium vào cây mầm thông nhựa. 54 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 57 5.1 Kết luận 57 5.2 Kiến nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 67 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic ARN Acid Ribonucleic AS Acetosyrigone BAP 6-benzyladenine bar gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase bp Base pair Cry Crystal gene = gen mã hóa protein tinh thể ñộc có tác dụng diệt côn trùng CV Coefficient of variation = sai số thí nghiệm CXN Cùng xâm nhập GA3 Gibberellic acid gus β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase Hyg Hygromycin phosphotransferase IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid LB Luria Bertani LSD Least significant difference = ñộ lệch chuẩn M16 Môi trường muối cơ bản theo Pullman và cộng sự (2003) MS Môi trường muối cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) NAA α-Naphthaleneacetic acid nptII Neomycin phosphotransferase gene OD Optical density PPT Phosphinothricin SEV Split-end vector SP Môi trường muối cơ bản theo Smith (1996) SRT Sâu róm thông str/spc Streptomycine/spectinomycine phosphotransferase gene T-DNA Transfer –DNA = ñoạn ADN ñược chuyển Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u Vir Virulence Region = vùng gây ñộc WP Môi trường muối cơ bản theo Mc Cown và Llyod (1981) X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản tới khả năng sinh trưởng của cây in vitro 28 4.2. Ảnh hưởng của BAP tới việc tạo ña chồi từ phôi hạt chín 30 4.3. Thời gian cảm ứng và hiệu quả tạo ña chồi từ phôi hạt chín 32 4.4. Ảnh hưởng của BAP tới hiệu quả tái sinh ña chồi từ cây mầm 35 4.5. Ảnh hưởng của BAP tới khả năng nhân nhanh cây thông in vitro 38 4.6. Nồng ñộ NAA và hiệu quả tạo rễ 40 4.7. Nồng ñộ IBA và hiệu quả tạo rễ 42 4.8. Ảnh hưởng của NAA-IBA tới hiệu quả tạo rễ 44 4.9. Ảnh hưởng của giá thể tới hiệu quả ra cây cây thông nhựa 46 4.10. Ảnh hưởng chất chọn lọc tới khả năng sống sót của cây thông nhựa 49 4.11. Ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới hiệu quả chuyển gen qua phôi hạt chín nguyên vẹn 52 4.12. Ảnh hưởng tuổi mẫu tới hiệu quả chuyển gen qua cây mầm 54 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1. Sơ ñồ khái quát quá trình tái sinh in vitro cây thông nhựa từ hai nguyên liệu là phôi hạt chín và cây mầm 23 4.1. Cây thông nhựa sinh trưởng trên các môi trường khác nhau 29 4.2. Cụm chồi thành từ phôi hạt chín 31 4.3. Các dạng chồi thành ở thời gian cảm ứng khác nhau 33 4.4. ða chồi thành từ mẫu cây mầm 36 4.5. Cụm chồi cây thông nhựa hình thành trên môi trường nhân nhanh 38 4.6. Rễ cây thông nhựa thành trên môi trường bổ sung NAA 41 4.7. Rễ cây thông nhựa thành trên môi trường bổ sung IBA 42 4.8. Rễ cây thông nhựa thành trên môi trường bổ sung NAA - IBA 44 4.9. Cây thông nhựa sinh trưởng trên các giá thể khác nhau 47 4.10. Mẫu Thông nhựa sống sót trên môi trường bổ sung PPT 51 4.11. Mẫu Thông nhựa sống sót trên môi trường bổ sung hygromycine 51 4.12. Biểu hiện của gen gus trên phôi hạt chín 53 4.13. Biểu hiện gen gus trên mẫu cây mầm 55 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 1. MỞ ðẦU 1.1. Tính cấp thiết của ñề tài Các loài thông thuộc chi Pinus là ñối tượng cây lâm nghiệp ñược trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới như Hoa Kỳ, Canada, Chile, New Zealand, Úc, Nam Phi, Tây Ban Nha,…[42], [48], [72]. Ở nước ta, cây thông ñóng vai trò quan trọng trong cơ cấu cây rừng. Diện tích trồng thông chiếm tỷ lệ cao nhất trong tổng diện tích rừng trồng ở nước ta. ðây là loại cây có khả năng sinh trưởng trên ñiều kiện ñất ñai thoái hóa, nghèo dinh dưỡng và trong ñiều kiện lập ñịa xấu [42]. Ngoài tác dụng phủ xanh ñất trống ñồi trọc, phục hồi cảnh quan, chắn gió, làm sạch môi trường, thông còn cung cấp gỗ và nhựa phục vụ cho công nghiệp. Hai thành phần chính của nhựa thông là tinh dầu thông (turpetine) và tùng hương (colophony) ñược sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến sơn, mỹ phẩm, hóa chất tẩy rửa… Trong số các loài thông ñang ñược trồng ở nước ta, Thông nhựa (Pinus Merkusii Jungh. & de Vries) là loài có giá trị kinh tế cao và ñược trồng với diện tích lớn nhất [63]. Một trong những trở ngại lớn cho công tác trồng rừng thông là sâu róm. Các biện pháp kỹ thuật canh tác, sinh học ñã ñược áp dụng trong phòng chống sâu róm nhưng kết quả rất hạn chế. Biện pháp hóa học ñược sử dụng khi dịch bùng phát mạnh song rất khó thực hiện bởi chiều cao của cây và sức sinh sản nhanh của sâu hại. Ngoài ra, nó còn tiềm ẩn các nguy cơ về môi trường sinh thái. Tuy nhiên, việc tạo giống cây thông kháng sâu bằng phương pháp truyền thống hầu như không có hiệu quả. Công nghệ gen là một trong những giải pháp tạo ra những bước ñột phá về năng suất, chất lượng cũng như tính chống chịu với ñiều kiện bất lợi. Cho ñến nay, ñã có nhiều công bố thành công về chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium ở một số loài thông như Pinus taeda, Pinus roxburghii, Pinus omorika và Pinus radiata [42], [61]. . Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens có nhiều ưu việt hơn phương pháp bắn gen hay vi tiêm. Tuy nhiên, hiệu quả biến nạp gen thông qua A. tumefaciens phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn vật liệu dùng ñể nuôi cấy, thời gian cảm ứng, khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn, nồng ñộ chất chọn lọc, khả năng tái sinh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 2 cây sau biến nạp gen, . Xuất phát từ yêu cầu trên chúng tôi thực hiện ñề tài “Xây dựng quy trình tái sinh và thử nghiệm khả năng chuyển gen gus vào cây thông nhựa (Pinus merkusii Jungh. & de Vries)” 1.2. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 1.2.1. Mục ñích Xây dựng, hoàn thiện quy trình tái sinh và chuyển gen vào cây thông nhựa làm cơ sở ñể tiến hành chuyển gen kháng sâu vào loài thông này nhằm tạo ra ñược giống thông có khả năng chống chịu cao với sâu róm. 1.2.2. Yêu cầu - Xây dựng quy trình tái sinh cây thông nhựa (Pinus merkusii) thông qua ña chồi phục vụ việc chuyển gen. - Xác ñịnh ñược ngưỡng nồng ñộ chất chọn lọc và thử nghiệm chuyển gen gus vào cây thông nhựa. 1.3. Ý nghĩa khoa học của của ñề tài ðây là nghiên cứu ñầu tiên ở nước ta về nuôi cấy in vitro và chuyển gen trên ñối tượng loài thông nhựa (Pinus merkusii Jungh. & de Vries). Quy trình tái sinh ña chồi ñã xây dựng ñược trong ñề tài là quy trình tái sinh in vitro hoàn chỉnh ñầu tiên ở Việt Nam ñối với cây thông nói chung và Thông nhựa nói riêng. Kết quả của ñề tài là cơ sở quan trọng trong chiến lược chọn tạo giống thông chống chịu cao với sâu róm.