C. Chồi tạo ủược trờn cụng thức ủối chứng (khụng cảm ứng).
4.1.4 Xỏc ủị nh nồng ủộ BAP thớch hợp cho tạo ủa chồi thụng qua cõy mầm
Mặc dự phụi hạt chớn ủược sử dụng trực tiếp trong nhiều thớ nghiệm tỏi sinh và chuyển gen nhưng loại nguyờn liệu này cũn cú một số hạn chế. Tỷ lệ tạo ủa chồi thấp, cần cú thời gian cảm ứng tạo ủa chồi, nồng ủộ chất ủiều tiết sinh trưởng cao mới cú tỏc dụng ức chế chồi ủỉnh, kớch thớch chồi bờn phỏt triển do vậy ảnh hưởng xấu tới hiệu quả tỏi sinh và chuyển gen ở giai ủoạn sau. Ngoài ra, cỏc phụi nguyờn vẹn khi chuyển gen cần phải cú cỏc biện phỏp gõy tạo vết thương thớch hợp cho sự xõm nhập của vi khuẩn Agrobacterium.
Năm 2002, Jean và cộng sự [48] ủó cú ủược thành cụng khi sử dụng ủỉnh chồi làm nguyờn liệu chuyển gen và tỏi sinh cõy. Việc bổ dọc ủỉnh chồi giỳp hạn chế ủược ưu thế ngọn do ủú giảm ủược hàm lượng chất ủiều tiết sinh trưởng bổ sung vào mụi trường tạo ủa chồi, rỳt ngắn thời gian tỏi sinh cõy. Ngoài ra việc bổ dọc ủỉnh chồi sẽ tạo ra vết thương cơ giới làm tăng khả năng xõm nhiễm của vi khuẩn ở giai ủoạn nhiễm khuẩn và ủồng nuụi cấy trong cỏc thớ nghiệm chuyển gen.
Từ cỏc kết quả thu ủược trờn, chỳng tụi tiến hành thớ nghiệm ủỏnh giỏ khả năng tỏi sinh ủa chồi cõy thụng nhựa sử dụng nguyờn liệu là ủỉnh sinh trưởng của cõy mầm 15-20 ngày tuổi. Hiệu quả của từng loại mụi trường ủược thể hiện trờn bảng 4.4.
Số liệu bảng 4.4 cho thấy, trong khoảng nồng ủộ BAP từ 0,5 – 6 mg/l, tỷ lệ tạo ủa chồi tăng theo chiều tăng nồng ủộ BAP. Tỷ lệ tạo ủa chồi dao ủộng từ 42,3 – 73,5%, cao nhất là cụng thức SR5 (6 mg/l BAP) và thấp nhất là cụng thức SR1 (0,5 mg/l BAP). Khi tăng nồng ủộ chất ủiều tiết sinh trưởng BAP, tỷ lệ mẫu tơn chồi cú chiều hướng giảm xuống. Cụ thể ở cụng thức SR1 tỷ lệ ủợn chồi là 39,3% và ở cụng thức SR5 tỷ lệủơn chồi giảm xuống chỉ cũn 15,4%. Ngược lại, số chồi trung bỡnh trờn một mẫu cấy tăng lờn theo chiều tăng của BAP, dao ủộng từ 2,4 chồi/cụm (SR1) ủến 7,6 chồi/cụm (SR5).
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………35
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của BAP tới hiệu quả tỏi sinh ủa chồi từ cõy mầm Ký hiệu cụng thức BAP (mg/l) Nồng ủộ Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu chồi ủơn (%) Tỷ lệ mẫu tạo ủa chồi
(%) Số chồi Số chồi trung bỡnh (chồi) ðC 0 33,1 66,9 0,0 1,0 SR1 0,5 18,5 39,3 42,3 2,4 SR2 1,0 15,9 30,4 53,7 3,2 SR3 2,0 13,3 22,4 64,3 4,5 SR4 4,0 11,0 23,2 65,8 5,8 SR5 6,0 11,1 15,4 73,5 7,6 SR6 8,0 29,5 12,8 57,7 10,3 LSD (0,05) 1,6 CV % 1,8
Tuy nhiờn khi nồng ủộ BAP tiếp tục tăng lờn 8 mg/l, tỷ lệ mẫu ủơn chồi tiếp tục giảm (12,8%), số chồi trung bỡnh trờn một mẫu tăng lờn (10,3 chồi/cụm) nhưng tỷ lệ mẫu chết tăng mạnh. Nguyờn nhõn do nồng ủộ BAP cao gõy sốc và làm chết mẫu cấy ủiều này làm cho tỷ lệ mẫu tạo ủa chồi giảm xuống chỉ cũn 57,7%.
Chất ủiều tiết sinh trưởng BAP cú vai trũ quan trọng trong hiệu quả nhõn chồi và tỏi sinh cõy thụng nhựa in vitro. ðiều này thể hiện rừ khi xem xột cỏc chỉ tiờu khỏc nhau ở cụng thức ủối chứng. Khi ủỉnh sinh trưởng bị tổn thương, một lượng lớn mẫu ở cụng thức ủối chứng khụng cú khả năng phục hồi và chết (33,1%), phần cũn lại (66,9%) cú khả năng phục hồi nhưng lại xuất hiện ưu thế ngọn rất mạnh. Kết quả, toàn bộ cỏc mẫu sống sút ở cụng thức ủối chứng chỉ thu ủược một chồi ngọn duy nhất.
Trong thớ nghiệm chuyển gen, mẫu vật sẽ bị tổn thương mạnh do vết thương cơ giới và vi khuẩn Agrobacterium, do ủú làm tăng tỷ lệ mẫu chết ở cỏc giai ủoạn sau. Vỡ vậy, một quy trỡnh tỏi sinh phục vụ chuyển gen muốn cú hiệu quả cao cần cú tỷ lệ tỏi sinh cao. Số chồi trung bỡnh là một chỉ tiờu quan trọng cần quan tõm, nếu như nhõn giống vụ tớnh khi hệ số nhõn càng cao càng hiệu quả. Căn cứ vào hai chỉ tiờu trờn chỳng tụi thấy, mụi trường SR5 (6 mg/l BAP) thớch hợp cho việc tỏi sinh ủa chồi cõy thụng nhựa khi sử dụng vật liệu nuụi cấy là ủỉnh cõy mầm. Tỷ lệ tạo ủa chồi từ cõy mầm thu ủược ở SR5 (73,5%) vượt hơn hẳn so với nguyờn liệu là phụi hạt chớn nguyờn vẹn (61,5%).
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………36
Hỡnh 4.4. ða chồi hỡnh thành từ mẫu cõy mầm