C. Chồi tạo ủược trờn cụng thức ủối chứng (khụng cảm ứng).
B. Cõy in vitro sống sút trờn mụi trường bổ sung hygromycine
Kết quả cho thấy, tỏc hại của hygromycine tới khả năng sinh trưởng và sống sút của cõy thụng nhựa thể hiện ngay ở nồng ủộ thấp, mức ủộ biểu hiện rừ ràng. Ở nồng ủộ 1mg/l, tỷ lệ mẫu sống sút với nguyờn liệu phụi hạt chớn là 58,3% và cõy in vitro là 74,2%. Tương tự như PPT, khả năng chống chịu của cõy in vitro với hygromycine cao hơn phụi hạt chớn. Cụ thể ở nồng ủộ 4mg/l mụi trường, tỷ lệ cõy in vitro sống sút là 8,3% trong khi ủú chỉ cú 6,2 % mẫu gieo từ phụi hạt sống sút. Khi nồng ủộ khỏng sinh này ủạt ngưỡng 6 – 8 mg/l toàn bộ cỏc mẫu thớ nghiệm ủều bị chết.
4 mg/l 5 mg/l 6 mg/l 7 mg/l 8 mg/l 4 mg/l 5 mg/l 6 mg/l 7 mg/l 8 mg/l A B 1 mg/l 2 mg/l 4 mg/l 6 mg/l 8 mg/l 1 mg/l 2 mg/l 4 mg/l 6 mg/l 8 mg/l A B
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………52
Quan sỏt hỡnh thỏi mẫu thớ nghiệm cho thấy: Khi ủược cấy trờn mụi trường cú bổ sung hygromycine, cỏc mẫu cõy thụng nhựa từ xanh chuyển sang nõu, ủen và chết. Ở cỏc ngưỡng nồng ủộ hygromycine từ 6 - 8 mg/l, tỏc hại của khỏng sinh này rất rừ rệt, toàn bộ cỏc mẫu cấy ủều thõm ủen và chết sau 4 tuần nuụi cấy.
Theo Brukhin và cộng sự [33], ngưỡng nồng ủộ chất chọn lọc phự hợp khi loại bỏ ủược khoảng 90% cỏc cõy khụng chuyển gen. Căn cứ vào cỏc kết quả trờn, chỳng tụi lựa chọn nồng ủộ PPT là 6 mg/l và hygromycine là 4 mg/l làm cơ sở ủể cho chọn lọc cỏc cõy thụng nhựa chuyển gen ở cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
4.2.2 Ảnh hưởng của thời gian siờu õm tới hiệu quả chuyển gen vào phụi hạt chớn nguyờn vẹn nguyờn vẹn
Với phương phỏp chuyển gen thụng qua Agrobacterium tumefaciens, vi khuẩn sẽ xõm nhập vào mụ tế bào thụng qua cỏc vết thương cơ giới hay cỏc lỗ hổng tự nhiờn của tế bào. Do vậy cú nhiều cỏch thức ủể làm tăng khả năng xõm nhiễm của vi khuẩn vào khối mụ như: thay ủổi ỏp suất thẩm thấu, tạo ỏp lực hỳt chõn khụng, gõy sước bằng bột thủy tinh (silicon carbine), siờu õm ... [34]
Trong thớ nghiệm chuyển gen thụng qua phụi hạt chớn, ủể làm tăng khả năng xõm nhập của vi khuẩn vào mẫu chuyển gen, phương phỏp siờu õm gõy xước mẫu biến nạp ủược chỳng tụi quan tõm nghiờn cứu. Phụi hạt chớn sau khi tỏch ủược ngõm trong dung dịch 1/2 MS khụng ủường sau ủú ủặt vào bể siờu õm Bransonics 1210 với cỏc ngưỡng thời gian 20 – 90 giõy. Kết quả tổng hợp trờn bảng 4.11.
Bảng 4.11. Ảnh hưởng của thời gian siờu õm tới hiệu quả chuyển gen qua phụi hạt chớn nguyờn vẹn
Cụng thức Thời gian siờu õm (giõy)
Tỉ lệ biểu hiện GUS (%) Tỷ lệ mẫu tỏi sinh chồi (%) Tỉ lệ mẫu sống sút trờn mụi trường chọn lọc (%) ðC Khụng siờu õm 5,5 58,8 0,0 S1 20 46,7 51,4 2,7 S2 30 68,3 49,2 16,2 S3 60 59,2 28,6 6,6 S4 90 37,5 16,5 0,0 LSD (0,05) 2,6 CV % 3,2
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………53
Thời gian siờu õm cú tỏc ủộng trực tiếp tới khả năng xõm nhập của vi khuẩn thụng qua chỉ tiờu tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ủồng thời ảnh hưởng tới khả năng sống sút và tỏi sinh cõy sau chuyển gen. Ở cụng thức ủối chứng, khụng cú tỏc ủộng gõy xước, tỷ lệ mẫu cú biểu hiện tạm thời của gen gus chỉủạt 5,5 %, tuy nhiờn số mẫu sống sút và tỏi sinh chồi ủạt cao nhất (58,8 %) do ớt bị tổn thương bởi siờu õm gõy ra. Tỷ lệ mẫu biểu hiện gen gus tạm thời tăng mạnh khi cú tỏc ủộng gõy xước bởi siờu õm, dao ủộng từ 37,5 - 68,3 %. Hiệu quả cao nhất là cụng thức S2 (thời gian siờu õm là 30 giõy), tuy nhiờn khi tiếp tục tăng thời gian siờu õm lờn 60 và 90 giõy, phụi hạt bị tổn thương mạnh cú biểu hiện vỡ, dập dẫn tới tỷ lệ biểu hiện gen gus giảm xuống (chỉ cũn 37,5 ở thời gian siờu õm 90 giõy).
Tỏc ủộng siờu õm gõy tổn thương mẫu và làm giảm khả năng sống sút và tỏi sinh cõy thụng nhựa. Tỷ lệ tỏi sinh chồi giảm dần theo chiều tăng của thời gian siờu õm, ở ngưỡng thời gian siờu õm 20 giõy, tỷ lệ mẫu tỏi sinh chồi ủạt 58,8 % và giảm xuống chỉ cũn 16,5 % ở ngưỡng thời gian 90 giõy.
Tỷ lệ mẫu sống sút trờn mụi trường chọn lọc là chỉ tiờu quan trọng ủểủỏnh giỏ hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen. Số mẫu sống cao nhất thu ủược ở cụng thức S2 (16,2%). Tuy nhiờn ở cụng thức ủối chứng và cụng thức S4 (siờu õm 90 giõy), tỷ lệ mẫu sụng sút là 0 %.
Hỡnh 4.12. Biểu hiện của gen gus trờn phụi hạt chớn