3.2.1.1 Tạo nguyờn liệu nuụi cấy in vitro từ phụi hạt chớn thụng nhựa
Hạt chớn ủược tỏch bỏ lớp vỏ gỗ, khử trựng bề mặt bằng cồn 70% trong 1 phỳt, rửa lại bằng nước cất khử trựng, khử trựng bằng Javen 60% bổ sung Tween 20 trong 15 phỳt, rửa lại nhiều lần bằng nước cất khử trựng, thấm khụ hạt bằng giấy thấm khử trựng. Sử dụng panh, dao, kộo vụ trựng tỏch phụi hạt khỏi nội nhũ làm nguyờn liệu cho cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
3.2.1.2 Xỏc ủịnh mụi trường nuụi cấy in vitro cõy thụng nhựa
Cõy thụng nhựa in vitro cú chiều cao 1 cm ủược cấy trờn bốn loại mụi trường cơ bản MS, WP, SM, M16 (mụi trường cơ bản ủều ủược bổ sung 30g/l sucrose, 8,5g/l agar và pH = 5,8). Sau 4 tuần, cỏc cõy thụng ủược cấy chuyển sang mụi trường mới. Cỏc chỉ tiờu: Tỷ lệ cõy sống, chiều cao trung bỡnh cõy, chất lượng cõy in vitro ủược xỏc ủịnh và ủỏnh giỏ sau 2 lần cấy chuyển.
3.2.1.3 Tạo ủa chồi thụng qua phụi hạt chớn
Phụi hạt chớn ủược ủặt trờn mụi trường cảm ứng tạo ủa chồi bao gồm M16 bổ sung 1 mg/l BAP + 2 mg/l NAA + 1 g/l Casein + 50 g/l sucrose + 9 g/l agar, pH = 5,8. Sau thời gian cảm ứng, phụi hạt ủược ủặt lờn mụi trường tạo ủa chồi (PN1-PN5): M16 bổ sung 30 g/l sucrose + 9 g/l agar, pH = 5,8 và chất ủiều tiết sinh trưởng BAP với cỏc nồng ủộ từ 5-13 mg/l. Cỏc cụm chồi phỏt triển ủầy ủủ ủược chuyển sang mụi trường kộo dài chồi: M16 bổ sung 0,5 mg/l NAA + 0,2 mg/l GA3 + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 1,5 g/l than hoạt tớnh, pH = 5,8.
3.2.1.4 Tạo ủa chồi từ cõy mầm cõy
Phụi hạt chớn ủược ủặt lờn mụi trường nảy mầm phụi: M16 bổ sung 30 g/l sucrose + 0,5 mg/l NAA + 0,2 mg/l GA3 + 9 g/l agar + 1,5 g/l than hoạt tớnh, pH =5,8. Phụi ủược nảy mầm trong ủiều kiện tối hoàn toàn. Sau 15-20 ngày, cõy mầm ủược sử dụng làm nguyờn liệu tỏi sinh. Dựng panh, dao vụ trựng cắt phần ủỉnh mầm với chiều dài 0,7 cm, sau ủú bổủụi ủỉnh sinh trưởng theo chiều dọc tạo thành hai mảnh mẫu. Cỏc mảnh mẫu ủược ủặt trờn mụi trường tạo ủa chồi (SR1-SR6): M16 bổ sung BAP từ 0,5 - 8 mg/l + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar, pH = 5,8. Cỏc cụm chồi phỏt triển
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………23
ủầy ủủ ủược chuyển sang mụi trường kộo dài chồi: M16 bổ sung 0,5 mg/l NAA + 0,2 mg/l GA3 + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 1,5 g/l than hoạt tớnh, pH = 5,8.
3.2.1.5 Nhõn nhanh cõy in vitro
Chồi ngọn với chiều dài 0,5 cm ủược cắt từ cõy thụng nhựa in vitro và cỏc ủoạn thõn cõy in vitro cú chiều dài 0,7 cm ủược cấy lờn mụi trường nhõn chồi (M1-M5) bao gồm: M16 bổ sung 30 g/l sucrose + 9 g/l agar và BAP nồng ủộ từ 5 - 11 mg/l, ba tuần cấy chuyển một lần. Sau 2 thỏng, cụm chồi ủó nhõn ủược chuyển sang mụi trường kộo dài chồi và tỏch cỏc chồi ủơn ủể tạo cõy hoàn chỉnh.
3.2.1.6 Tạo rễ in vitro, ra cõy và chăm súc cõy
Cõy in vitro cú kớch thước từ 1,5-2 cm ủược cấy lờn mụi trường tạo rễ SR: M16 + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar; bổ sung cỏc nồng ủộ khỏc nhau của NAA , IBA và cỏc tổ hợp giữa IBA – NAA. Cỏc cõy in vitro cú bộ rễ hoàn chỉnh ủược ủưa ra trồng trong cỏc loại giỏ thể khỏc nhau với sự tổ hợp của ủất, cỏt sỏi, trấu hun, cỏt ủen. Cõy thụng nhựa sống sút trờn giỏ thể, xuất hiện lỏ mới ủược ủưa ra cỏc chậu ủất cú bổ sung phõn bún và trồng trong ủiều kiện nhà lưới.
Hỡnh 2.1. Sơ ủồ khỏi quỏt quỏ trỡnh tỏi sinh in vitro cõy thụng nhựa từ hai nguyờn liệu là phụi hạt chớn và cõy mầm
Tỏi sinh qua cõy mầm
Khử trựng tỏch phụi hạt Phụi nảy mầm Cảm ứng tạo ủa chồi Tạo ủa chồi Kộo dài chồi Tạo rễ cõy in vitro Ra cõy
Tỏi sinh qua phụi hạt chớn
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………24