Biểu hiện của gen gus trờn phụi hạt ở cỏc cụng thức sử dụng siờu õm C.Mẫu biến nạp sống sút trờn mụi trường chọn lọc

C. Chồi tạo ủược trờn cụng thức ủối chứng (khụng cảm ứng).

B. Biểu hiện của gen gus trờn phụi hạt ở cỏc cụng thức sử dụng siờu õm C.Mẫu biến nạp sống sút trờn mụi trường chọn lọc

C. Mẫu biến nạp sống sút trờn mụi trường chọn lọc

Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ54

Quan sỏt mức ủộ biểu hiện màu khi nhuộm với thuốc nhuộm X-gluc (hỡnh 4.12) cho thấy, ở cụng thức ủối chứng chỉ xuất hiện cỏc chấm xanh nhỏ rải rỏc ở phụi hạt. Trong khi ủú ở cỏc mẫu siờu õm, biểu hiện màu là cỏc ủốm lớn tập trung ở cỏc vị trớ cú khả năng tỏi sinh chồi (xung quanh ủỉnh sinh trưởng và cỏc lỏ mầm). điều này cho thấy hiệu quả của phương thức siờu õm thể hiện rừ khi chuyển gen thụng qua

Agrobacterium.

Căn cứ vào cỏc kết quả trờn, chỳng tụi lựa chọn phương thức siờu õm với thời gian 30 giõy làm cơ sở cho cỏc thớ nghiệm chuyển gen tiếp theo thụng qua phụi hạt chớn vào cõy thụng nhựa.

4.2.3 Ảnh hưởng của tuổi cõy mầm tới hiệu quả chuyển gen gus thụng qua Agrobacterium vào cõy mầm thụng nhựa. Agrobacterium vào cõy mầm thụng nhựa.

Chuyển gen thụng qua Agrobacterium khi sử dụng nguyờn liệu là cõy mầm, vi khuẩn sẽ xõm nhập vào mụ cõy thụng qua vết thương cơ giới ủược hỡnh thành khi bổ dọc cõy mầm ủể loại ưu thế ngọn. Trong nghiờn cứu của Jean và cộng sự [48], cho thấy tuổi cõy cú ảnh hưởng tới khả năng xõm nhiễm của vi khuẩn cũng như khả năng sống sút và tỏi sinh cõy thụng ở cỏc giai ủoạn sau. Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi sử dụng cõy mầm ở cỏc ủộ tuổi khỏc nhau làm nguyờn liệu chuyển gen chỉ thị gus nhằm lựa chọn ủược tuổi cõy mầm thớch hợp làm nguyờn liệu cho việc chuyển gen vào cõy thụng nhựa thụng qua Agrobacterium, số liệu thu ủược tổng hợp trờn bảng 4.12

Bảng 4.12. Ảnh hưởng tuổi mẫu tới hiệu quả chuyển gen qua cõy mầm

Tuổi cõy mầm Tỷ lệ biểu hiện tạm thời (%) Tỷ lệ mẫu tỏi sinh (%) Tỷ lệ mẫu tạo ủa chồi (%) Tỉ lệ mẫu sống sút trờn mụi trường chọn lọc (%) 1 tuần 40,3 d 25,3 13,4 3,6 2 tuần 54,4 c 49,4 41,7 6,7 3 tuần 74,7 a 62,4 51,2 12,6 4 tuần 60,2 b 67,5 28,2 5,4 > 5 tuần 24,7 e 68,2 14,5 4,2 LSD (0,05) 2.7 CV % 3,1

Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ55 độ tuổi của cỏc mẫu nghiờn cứu ảnh hưởng rừ rệt lờn tỷ lệ biểu hiện gus, tỷ lệ sống sút và khả năng tỏi sinh chồi. Tỷ lệ biểu hiện gus tạm thời dao ủộng từ 24,7 Ờ 74,7%, cao nhất ở cõy mầm 3 tuần tuổi và thấp nhất ở nhúm cõy mầm trờn 5 tuần tuổi. Tỷ lệ mẫu tỏi sinh chồi tăng dần theo chiều tăng của tuổi mẫu cấy dao ủộng từ 25,3 Ờ 68,2%. Ở cõy mầm 1 tuần tuổi, sau khi nhiễm khuẩn mẫu cú biểu hiện mềm, mọng nước, thõm ủen và chết trờn mụi trường tạo ủa chồi. Ở mức 4 tuần tuổi trở lờn, cõy mầm ủó lục húa nhiều, thõn mầm bắt ủầu húa gỗ do vậy sau khi nhiễm khuẩn mẫu ớt bị tổn thương cho nờn tỷ lệ tỏi sinh cao. Tuy nhiờn do tuổi cõy mầm cao, khả năng phỏt sinh chồi bất ủịnh của mẫu cấy bị hạn chế, chủ yếu chồi ủược hỡnh thành từủỉnh sinh trưởng của mẫu cấy dẫn tới tỷ lệ mẫu tạo ủa chồi rất thấp (14,5 Ờ 28,2 %). Phần lớn cỏc mẫu cấy ở mức 2 và 3 tuần tuổi ủều cú khả năng tạo ủa chồi sau khi biến nạp.

Hỡnh 4.13. Biểu hiện gen gus trờn mẫu cõy mầm

A. Biểu hiện của gen gus trờn cõy mầm 1 tuần tuổi B. Biểu hiện của gen gus trờn cõy mầm 3 tuần tuổi C. Biểu hiện của gen gus trờn cõy mầm trờn 5 tuần tuổi

Mức ủộ biểu hiện gus rừ nột nhất ở nhúm mẫu 3 tuần tuổi, diện tớch màu xanh tương ủối rộng ở lỏ mầm, xung quanh ủỉnh sinh trưởng và cả phần trờn của thõn mầm. đõy là những vị trớ cú khả năng phỏt sinh chồi bất ủịnh ủó ủược chứng minh ở thớ nghiệm tỏi sinh chồi ở phần trờn. Biểu hiện màu gus trờn mẫu cú ủộ tuổi quỏ non hay

Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ56

quỏ già chỉ là những ủốm xanh nhỏ nằm rải rỏc ở phần thõn mầm, những vị trớ này ớt cú khả năng hỡnh thành chồi (hỡnh 4.13).

Mặc dự tỷ lệ mẫu tỏi sinh chồi sau chuyển gen khỏ cao nhưng khi chuyển sang mụi trường chọn lọc cú bổ sung PPT tỷ lệ mẫu chết rất lớn. Lượng mẫu sống sút trờn mụi trường chọn lọc dao ủộng từ 3,6 Ờ 12,6 %. Số mẫu sống sút trờn mụi trường chọn lọc cao nhất ở mẫu 3 tuần tuổi và thấp nhất ở nhúm mẫu 1 tuần tuổi. Cỏc kết quả trờn cho thấy, cõy mầm tuần tuổi thớch hợp sử dụng làm nguyờn liệu chuyển gen thụng qua

Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ57