4.1 Xõy dựng quy trỡnh tỏi sinh cõy thụng nhựa thụng qua ủa chồi
4.1.1 Xỏc ủịnh mụi trường thớch hợp cho nuụi cấy in vitro cõy thụng nhựa
Trong nuụi cấy mụ tế bào thực vật, việc xỏc ủịnh mụi trường dinh dưỡng nuụi cấy phự hợp cho mỗi bộ phận của cõy và cho mỗi loài cõy ủược xem như ủiều kiện tiờn quyết quyết ủịnh cho bất cứ mục ủớch nghiờn cứu nào. Tuy nhiờn, chỳng cú một số yờu cầu chung như nguồn Cỏc bon dưới dạng ủường, muối của cỏc nguyờn tốủa lượng ( N, P, Ka, Ca) và vi lượng (MG, Fe, Mn, Co…). Ngoài ra cần một số chất vụ cơủặc biệt như vitamin (B1, B6, axit nicotinic …) và cỏc chất ủiều hũa sinh trưởng. Với cỏc loại cõy khỏc nhau, nhà nghiờn cứu cần lựa chọn mụi trường cơ bản phự hợp nhằm thỳc ủẩy khả năng sinh trưởng của cõy trong ủiều kiện in vitro. Cho ủến nay, nuụi cấy
in vitro ủối với cõy thõn gỗ luụn gõy khú khăn cho cỏc nhà nghiờn cứu, ủặc biệt ủối với loại cõy thõn gỗ cú chứa nhiều chất phenol, turpentine, colophany... và Thụng nhựa thuộc ủối tượng này. Do vậy, việc chọn tạo ủược mụi trường thớch hợp ủể tăng nhanh khả năng sinh trưởng và kộo dài chồi trong nuụi cấy in vitro mang một ý nghĩa quan trọng. Hầu hết cỏc kết quả nuụi cấy in vitro với một số loại cõy lõm nghiệp và cõy thõn gỗở nước ta mới chỉ thử nghiệm hai loại mụi trường là MS và WP [12], [5]. Trong cỏc cụng bố gần ủõy về tỏi sinh và chuyển gen ủối với cõy thụng, cỏc tỏc giảủó thụng bỏo một vài mụi trường phự hợp cho một số loài nhất ủịnh (Pinus taeda, Pinus
ayacahuite …) [64], [67].
Xuất phỏt từ cơ sở trờn, chỳng tụi sử dụng bốn loại mụi trường cơ bản MS, WP, SP và M16 [58], [59], [64], [69] (phụ lục 1) ủể xỏc ủịnh ủược mụi trường thớch hợp cho tỏi sinh và chuyển gen ủối với cõy thụng nhựa (Pinus merkusii).
Nguyờn liệu ủược sử dụng là cỏc chồi ủơn của cõy thụng nhựa nuụi cấy in vitro. Khả năng sinh trưởng của cõy ủược ủỏnh giỏ thụng qua tốc ủộ tăng trưởng chiều cao, thời gian xuất hiện ủợt lỏ mới và chất lượng cõy con ủược nuụi cấy. Kết quả nghiờn cứu ủược trỡnh bày trong bảng 4.1.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………28
Kết quả nghiờn cứu cho thấy, thành phần mụi trường cơ bản khỏc nhau cú ảnh hưởng trực tiếp tới tốc ủộ sinh trưởng của mẫu cấy. Với việc tăng cường thành phần và hàm lượng một số muối ủa lượng ủặc biệt là nhúm muối chứa nitơ giỳp ủẩy nhanh tốc ủộ sinh trưởng của cõy thụng nhựa khi ủược nuụi cấy trờn mụi trường M16. Trong bốn loại mụi trường thử nghiệm, mụi trường M16 tỏ ra phự hợp với cõy thụng nhựa, thể hiện qua tốc ủộ tăng chiều cao trung bỡnh lớn (nhất 2,7 cm) sau 10 tuần nuụi cấy, cỏc mụi trường cũn lại dao ủộng từ 1,1- 1,5 cm, mụi trường SP tỏ ra kộm hiệu quả khi nuụi cấy cõy thụng nhựa (1,1 cm).
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của mụi trường cơ bản tới khả năng sinh trưởng của cõy in vitro
Mụi trường Ngày xuất hiện
ủợt lỏ mới Chiều cao trung bỡnh (cm)/10 tuần Chất lượng cõy con M16 22 2,7 a +++ WP 30 1,5 b +++ SP 37 1,1 b + MS 34 1,2 b ++ LSD (0,05) 0,6 CV % 4,4
Ghi chỳ: (+++) Thõn, lỏ phỏt triển tốt; (++) Thõn phỏt triển chậm, lỏ mảnh kộo dài chậm; (+) Thõn khụng phỏt triển, lỏ chuyển vàng
Thời gian xuất hiện ủợt lỏ mới và chất lượng cõy thụng nhựa in vitro một lần nữa cho thấy sự phự hợp của mụi trường M16. Quan sỏt của chỳng tụi thấy, trờn mụi trường M16, cõy con cú khả năng sinh trưởng nhanh, sau 22 ngày bắt ủầu xuất hiện ủợt lỏ mới, sau ủú liờn tục xuất hiện lỏ mới, lỏ lục húa chậm thỳc ủẩy việc kộo dài thõn thật. Trong khi ủú trờn mụi trường SP, cõy thụng sinh trưởng chậm, lỏ mới ớt xuất hiện cõy cú biểu hiện vàng, cũi cọc. Xột về khả năng sinh trưởng của cõy thụng nhựa thỡ mụi trường WP tỏ ra ưu thế hơn hai mụi trường MS và SP, tuy nhiờn tốc ủộ ra lỏ mới
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………29
chậm và lỏ lục húa nhanh. Cỏc cõy in vitro chủ yếu kộo dài lỏ, thõn thật phỏt triển rất chậm (hỡnh 4.1).
Căn cứ vào tốc ủộ kộo dài chồi, khả năng xuất hiện lỏ mới và chất lượng cõy con, cho thấy mụi trường M16 thớch hợp cho nuụi cấy in vitro cõy thụng nhựa (Pinus merkusii). Mụi trường này ủược chỳng tụi sử dụng trong toàn bộ cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
Hỡnh 4.1. Cõy thụng nhựa sinh trưởng trờn cỏc mụi trường khỏc nhau
4.1.2 Ảnh hưởng của BAP ủến hiệu quả tạo ủa chồi cõy thụng nhựa từ phụi hạt chớn
Trong cỏc kết quả về tỏi sinh cõy thụng in vitro qua hai ủường hướng ủa chồi và phụi soma ủược cụng bố trong thời gian gần ủõy, nguyờn liệu ủược cỏc tỏc giả sử dụng ủa dạng gồm cú cõy mầm, phụi hạt chớn, lỏ mầm và phụi hạt chưa chớn [40], [48], [73]. Tuy nhiờn, với cỏc thớ nghiệm chuyển gen thành cụng, nguyờn liệu ủó ủược sử dụng chủ yếu là phụi hạt chớn [42]. Việc sử dụng phụi hạt chớn cú ưu ủiểm là chủủộng ủược nguồn hạt giống, ớt lệ thuộc vào thời vụ và cụng tỏc vụ trựng mẫu cấy rất thuận lợi.
ðể làm cơ sở cho việc xõy dựng quy trỡnh tỏi sinh thụng qua ủa chồi phục vụ chuyển gen ở cõy thụng nhựa, chỳng tụi sử dụng nguyờn liệu là hạt chớn của gia ủỡnh Thụng nhựa số 54. Phụi ủược tỏch từ hạt chớn, ủặt lờn mụi trường cảm ứng tạo ủa chồi trong 5-7 ngày, nhằm thỳc ủẩy phõn chia tế bào và kớch thớch chồi bờn phỏt triển. Sau thời gian cảm ứng, phụi ủược chuyển lờn 5 loại mụi trường tạo ủa chồi khỏc nhau (PN1-PN5) với việc bổ sung chất ủiều tiết sinh trưởng BAP (6-benzyladenine) nồng ủộ từ 5 mg/l ủến 13 mg/l như trong bảng 4.2.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………30
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của BAP tới việc tạo ủa chồi từ phụi hạt chớn
Ký hiệu cụng thức BAP (mg/l) Tỷ lệ tạo sẹo (%) Tỷ lệ mẫu chồi ủơn (%) Tỷ lệ mẫu tạo ủa chồi (%) ðC 0 82,2 17,8 0 PN1 5 57,4 16,8 7,4 PN2 7 49,6 12,5 24,3 PN3 9 14,2 9,7 57,5 PN4 11 5,7 6,2 49,8 PN5 13 4,3 2,2 21,3 LSD(0,05) 1,2 CV% 2,5
Kết quả bảng 4.2 cho thấy, cỏc nồng ủộ BAP sử dụng khỏc nhau khụng chỉ tỏc ủộng tới hiệu quả tạo ủa chồi mà cũn ảnh hưởng tới khả năng mụ sẹo húa mẫu cấy và tỷ lệ mẫu chết. Hiện tượng mụ sẹo húa mẫu cấy xảy ra sau khi phụi ủược ủặt trờn mụi trường cảm ứng, nếu tỷ lệ mụ sẹo húa cao sẽ làm giảm hiệu qủa tạo ủa chồi. Trong thớ nghiệm này, tỷ lệ mẫu tạo ủa chồi dao ủộng từ 7,4 – 57,5%, cao nhất là cụng thức PN3 (9 mg/l BAP) và thấp nhất là cụng thức PN1 (5 mg/l BAP). Khi nồng ủộ BAP tăng từ 5 – 9 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo ủa chồi tăng lờn. Tuy nhiờn khi tiếp tục tăng nồng ủộ của BAP lờn ngưỡng 11-13 mg/l, khả năng tạo ủa chồi cú xu hướng giảm xuống. Kết quả này hoàn toàn phự hợp với lý thuyết là cỏc chất kớch thớch sinh trưởng chỉ cú tỏc dụng ở nồng ủộ nhất ủịnh và sẽức chế cỏc hoạt ủộng thậm chớ gõy chết khi nồng ủộ quỏ cao.
Tỷ lệ phụi bị mụ sẹo húa giảm dần theo chiều tăng nồng ủộ BAP, dao ủộng từ 4,3% (PN5) ủến 57,4% (PN1). Tương tự như vậy, tỷ lệ mẫu ủơn chồi cũng giảm dần theo chiều tăng nồng ủộ của chất ủiều tiết sinh trưởng BAP. Ở cụng thức ủối chứng, tỷ lệ phụi bị mụ sẹo húa rất cao sau giai ủoạn cảm ứng (82,2%), ủồng thời xuất hiện mẫu bị mụ sẹo húa hoàn toàn và khụng cú khả năng tạo chồi. Trong khi ủú một số mẫu ở cụng thức này khụng bị mụ sẹo húa hoàn toàn (17,8%) nhưng vẫn xảy ra hiện tượng ưu thế ngọn nờn chỉ thu ủược chồi ủơn duy nhất.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………31
Hỡnh 4.2. Cụm chồi hỡnh thành từ phụi hạt chớn