C. Chồi tạo ủược trờn cụng thức ủối chứng (khụng cảm ứng).
B. Mẫu cõy mầm bổ dọc trờn mụi trường tạo ủa chồi C, D, E Cỏc dạng chồi hỡnh thành trờn mẫu cấy
4.1.6 Kết quả tạo rễ in vitro cõy thụng nhựa
Tạo rễ là khõu cuối cựng trong hệ thống nuụi cấy in vitro, ủặc biệt cú ý nghĩa ủối với kỹ thuật chuyển gen ở thực vật. Vỡ thế, lựa chọn chất ủiều tiết sinh trưởng và nồng ủộ phự hợp nhằm nõng cao hiệu quả tạo rễ cõy thụng nhựa trong ủiều kiện in vitro cũng ủược quan tõm nghiờn cứu này. Cho ủến nay, NAA, IBA vẫn là những chất ủược sử dụng phổ biến trong nghiờn cứu tạo rễ. Tuy nhiờn, nồng ủộ tối thớch với mỗi ủối tượng cõy trồng cần ủược nghiờn cứu .
4.1.6.1 Ảnh hưởng của NAA tới việc tạo rễ cõy in vitro
NAA (α-Naphthaleneacetic acid) là một auxin nhõn tạo, cú hoạt tớnh mạnh hơn auxin tự nhiờn IAA, nú cú vai trũ quan trọng ủối với phõn chia tế bào và tạo rễ [21]. NAA ủược sử dụng khỏ phổ biến trong việc kớch thớch hỡnh thành rễ trong nuụi cấy in
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………40
Francisco và cộng sự [43] ủó bổ sung NAA vào mụi trường nhằm kớch thớch tạo rễ với cõy thụng nuụi cấy in vitro. Kết quả nghiờn cứu cũng chỉ ra rằng việc bổ sung NAA thỳc ủẩy sự hỡnh thành rễ cõy thụng, tuy nhiờn ở nồng ủộ cao cú thể gõy ra hiện tượng mụ sẹo húa phần gốc mẫu cấy gõy khú khăn cho việc ra cõy. Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi bổ sung NAA vào mụi trường tạo rễ với nồng ủộ dao ủộng từ 0,2-1,5 mg/l nhằm tỡm ra ngưỡng phự hợp cho việc ra rễ cõy thụng nhựa (bảng 4.6)
Bảng 4.6. Nồng ủộ NAA và hiệu quả tạo rễ Cụng thức NAA (mg/l) Tỷ lệ tạo rễ (%) Số rễ trung bỡnh Ngày bắt ủầu ra rễ Chất lượng rễ ðC 0 0,0 - - - PR1 0,2 24,2 2,0 48 ++ PR2 0,5 41,0 3,0 43 ++ PR3 1 49,7 3,5 43 + PR4 1,5 30,4 4,2 40 + LSD (0,05) 1,6 CV % 2,9
Ghi chỳ: (++) Rễ ngắn, nhỏ, mụ sẹo phỏt sinh ớt; (+) Rễ phỡnh to, mụ sẹo hỡnh thành nhiều
NAA ủược bổ sung vào mụi trường ủó kớch thớch việc hỡnh thành rễ cõy thụng nhựa trong nuụi cấy in vitro. Cụ thểở cụng thức ủối chứng, toàn bộ mẫu cấy khụng cú khả năng tạo rễ trong khi ủú tất cả cỏc cụng thức cú bổ sung NAA ủều cho một tỷ lệ cõy tạo rễ nhất ủịnh. Tỷ lệ cõy thụng nhựa ra rễ dao ủộng từ 24,2 - 49,7%, tăng dần trong phạm vi nồng ủộ từ 0,2 mg/l – 1 mg/l NAA. Ở cụng thức PR4 (1,5 mg/l NAA), tỷ lệ cõy tạo rễ giảm xuống cũn 30,4%, nguyờn nhõn chủ yếu do việc hỡnh thành khối mụ sẹo lớn ở phần gốc ủó ức chế việc hỡnh thành rễ.
Số rễ trung bỡnh thu ủược dao ủộng từ 2,0 – 4,2 rễ, tăng lờn theo nồng ủộ NAA. Thờm vào ủú, thời gian hỡnh thành rễ cũng ủược rỳt ngắn khi tăng nồng ủộ NAA. Tuy nhiờn, rễ cõy thụng nhựa tạo ủược trờn cỏc mụi trường bổ sung NAA cú chất lượng kộm, rễ phỡnh to, ủen, khả năng kộo dài chậm và thường hỡnh thành cỏc mụ sẹo ở phần
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………41
sỏt gốc thõn. Phần lớn rễ ủược phỏt sinh từ cỏc khối mụ sẹo này mà khụng phải phỏt sinh trực tiếp từ thõn in vitro do ủú thường bị ủứt góy và bị thối khi ủưa ra ngoài giỏ thể (hỡnh 4.6)
Hỡnh 4.6. Rễ cõy thụng nhựa hỡnh thành trờn mụi trường bổ sung NAA
A. Rễ tạo ủược trờn mụi trường bổ sung 0,2 mg/l NAA B. Rễ tạo ủược trờn mụi trường bổ sung 0,5 mg/l NAA C. Rễ tạo ủược trờn mụi trường bổ sung 1-1,5 mg/l NAA
Như vậy, rừ ràng NAA cú vai trũ kớch thớch việc tạo rễ cõy thụng nhựa in vitro nhưng nú cũng gõy nờn hiện tượng mụ sẹo húa mạnh mẫu cấy làm giảm chất lượng bộ rễ tạo ủược ngay ở nồng ủộ thấp (0,2mg/l). ðiều này ch thấy, việc sử dụng NAA riờng biệt khụng mang lại hiệu quả trong tạo rễ in vitro cõy thụng nhựa.
4.1.6.2 Ảnh hưởng của IBA ủến hiệu quả tạo rễ cõy in vitro
Trong thớ nghiệm trờn, chỳng tụi ủó sử dụng NAA nhằm kớch thớch tạo rễ cõy thụng nhựa nuụi cấy in vitro. Tuy nhiờn, bộ rễ cõy thụng nhựa tạo ủược cú chất lượng thấp. Với mục tiờu hoàn thiện quy trỡnh tỏi sinh, chỳng tụi tiếp tục sử dụng IBA (Indole- 3-butyric acid) ủể kớch thớch việc tạo rễ cõy thụng nhựa trong ủiều kiện in vitro.
IBA là nhúm chất ủiều tiết sinh trưởng ủược nhiều tỏc giả sử dụng trong tạo rễ
in vitro cõy thụng [48], [52]. Trong thớ nghiệm này, nồng ủộ IBA cũng ủược bố trớ dao ủộng từ 0,2-1,5 mg/l mụi trường nuụi cấy, kết quả thể hiện trờn bảng 4.7
B C
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………42
Bảng 4.7. Nồng ủộ IBA và hiệu quả tạo rễ
Cụng thức IBA (mg/l) Tỷ lệ tạo rễ (%) Số rễ trung bỡnh Ngày bắt ủầu ra rễ Chất lượng rễ ðC 0 0,0 - - - PR5 0,2 44,4 1 40 +++ PR6 0,5 55,6 1 38 +++ PR7 1 68,9 1 36 +++ PR8 1,5 48,5 1,5 36 + LSD (0,05) 2,1 CV % 2,5
Ghi chỳ: (+) Rễ phỡnh to, ủen; (+++) Rễ phỏt triển nhanh, dài, màu trắng, phõn nhiều rễ cấp 1
Hỡnh 4.7. Rễ cõy thụng nhựa hỡnh thành trờn mụi trường bổ sung IBA
A. Rễ tạo ủược trờn mụi trường bổ sung 0,2 -0,5 mg/l IBA B. Rễ tạo ủược trờn mụi trường bổ sung 1mg/l IBA
C. Rễ tạo ủược trờn mụi trường bổ sung 1,5 mg/l IBA
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………43
Thời gian bắt ủầu ra rễ giảm dần khi tăng nồng ủộ của IBA, dao ủộng từ 36 - 40 ngày, muộn nhất là cụng thức PR5 (0,2 mg/l IBA). ðiều này chứng tỏ IBA cú tỏc ủộng kớch thớch việc hỡnh thành rễ trong nuụi cấy in vitro cõy thụng nhựa. Tỷ lệ cõy thụng nhựa ra rễ trờn mụi trường bổ sung IBA dao ủộng từ 44,4 - 68,9%, cao nhất là PR7(1 mg/l) và thấp nhất PR5 (0,2 mg/l). Ở cụng thức PR8 (1,5 mg/l IBA), tỷ lệ cõy ra rễ giảm xuống do sự xuất hiện của cỏc dạng mụ sẹo nhỏ. Ngoài ra, cỏc rễ thu ủược ở cụng thức này bắt ủầu xuất hiện một số dạng bất thường (rễ phỡnh to, ủen và chậm kộo dài).
Cỏc cụng thức bổ sung IBA ủều thu ủược số rễ trung bỡnh là 1 rễ/ mẫu cấy ngoại trừ cụng thức PR8 (1,5 rễ/cõy). Tớnh ưu việt của IBA thể hiện rất rừ ở chất lượng rễ cõy thụng tỏi sinh in vitro, rễ thu ủược mảnh, khả năng kộo dài nhanh, rễ trắng và phõn nhiều rễ cấp 1. Ở tất cả cỏc cụng thức bổ sung nồng ủộ IBA từ 0,2mg/l ủến 1mg/l khụng thấy xuất hiện mụ sẹo húa ở phần gốc mẫu cấy (hỡnh 4.7).
So với NAA, chất ủiều tiết sinh trưởng IBA tỏ ra ưu việt hơn về tỷ lệ tạo rễ cũng như chất lượng rễ thu ủược. Tuy nhiờn, số rễ trung bỡnh thu ủược (1 rễ /cõy) lại thấp hơn hẳn so với NAA (2,0 - 4,2 rễ /cõy).
Với ưu ủiểm, kớch thớch cõy thụng nhựa sớm tạo rễ, tỷ lệ tạo rễ cao nhất (68,9%) ủồng thời rễ tạo ủược cú chất lượng tốt, cụng thức PR7 (1 mg/l IBA) thớch hợp cho việc tạo rễ cõy thụng nhựa nuụi cấy in vitro.
4.1.6.3 Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA ủến khả năng tạo rễ cõy in vitro
Trong một số kết quả ủược cụng bố trờn một số loài thụng khỏc như Larix gmelinii L; Pinus radiata [52], [54] cỏc tỏc giả ủó sử dụng kết hợp hai nhúm chất NAA và IBA nhằm tăng cường khả năng ra rễ, chất lượng và số lượng rễ tạo ủược. Trong thớ nghiệm này, chỳng tụi tiếp tục khảo sỏt sự kết hợp của NAA và IBA ủối với hiệu quả tạo rễở cõy thụng nhựa nuụi cấy mụ. Ngoài ra ủể hạn chế việc phỏt sinh mụ sẹo do NAA gõy ra, nồng ủộ NAA thấp (0,2 – 0,5 mg/l) ủược kết hợp với cỏc ngưỡng nồng ủộ khỏc nhau của IBA.Kết quảủược thể hiện trờn bảng 4.8.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………44
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của NAA-IBA tới hiệu quả tạo rễ
Cụng thức NAA (mg/l) IBA (mg/l) Tỷ lệ tạo rễ (%) Tỷ lệ rễ dị hỡnh (%) Số rễ trung bỡnh Ngày bắt ủầu ra rễ Chất lượng rễ ðC 0,0 0,0 0,0 - - - - PR9 0,2 0,2 37,5 58,3 3,4 32 + PR10 0,2 0,5 50,0 96,2 5,2 29 + PR11 0,2 0,7 87,5 100 6,5 29 + PR12 0,5 0,2 50,0 97,5 4,6 26 + PR13 0,5 0,5 75,0 100 6,8 26 + PR14 0,5 0,7 75,0 100 8,3 26 + LSD (0,05) 4,2 CV % 4,4
Ghi chỳ: +: Rễ dị dạng, phỡnh to, ủen, hỡnh thành cỏc khụi mụ sẹo
Hỡnh 4.8. Rễ cõy thụng nhựa hỡnh thành trờn mụi trường bổ sung NAA - IBA
A. Rễ tạo ủược trờn mụi trường 0,1 mg/l NAA - 0,5 mg/l IBA B. Rễ tạo ủược trờn mụi trường 0,1 mg/l NAA – 0,7 mg/l IBA C. Rễ tạo ủược trờn mụi trường 0,2 mg/l NAA – 0,5 mg IBA D. Rễ tạo ủược trờn mụi trường 0,2 mg/l NAA – 0,7 mg IBA
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………45
Khi kết hợp NAA và IBA, tỷ lệ tạo rễ ủa tăng lờn ủỏng kể, dao ủộng từ 37,5 – 87,5%. Tỷ lệ tạo rễ cao nhất thu ủược ở cụng thức PR11, cú sự kết hợp giữa 0,2 mg/l NAA và 0,7 mg/l IBA và thấp nhất là cụng thức PR9 (0,2 mg/l NAA + 0,2 mg/l IBA).
Việc kết hợp giữa hai chất này khụng chỉ làm tăng tỷ lệ tạo rễ mà cũn làm tăng số rễ trung bỡnh cũng như rỳt ngắn thời gian ra rễ của cõy thụng nhựa nuụi cấy in vitro.
Số rễ trung bỡnh thu ủược dao ủộng từ 3,4 – 8,3 rễ / 1chồi, khụng cú chồi nào xuất hiện rễủơn. Thời gian phỏt sinh rễ sau khi cấy ủược rỳt ngắn xuống cũn 26 – 32 ngày.
Khi bổ sung kết hợp NAA và IBA vào mụi trường nuụi cấy làm tăng tỷ lệ tạo rễ, rỳt ngắn thời gian hỡnh thành rễ nhưng tỷ lệ rễ dị hỡnh rất cao dao ủộng từ 58,3 – 100%. Tỷ lệ rễ dị hỡnh tăng theo chiều tăng nồng ủộ của NAA và IBA (hỡnh 4.8). Hầu hết rễ cõy phỏt sinh từ khối mụ sẹo hỡnh thành ở phần gốc cõy in vitro nờn dễ dàng bị ủứt góy khi ra cõy. Mặc dự số rễ tạo ủược nhiều nhưng dị dạng (phỡnh to, xốp và khụng cú khả năng kộo dài). Phần rễ cũn lại khụng bị dị hỡnh nhưng phỏt triển chậm, ủen, dễ góy và khụng phõn nhỏnh. Chỳng tụi ủó thử nghiệm ra cõy với nhiều giỏ thể khỏc nhau nhưng tỷ lệ cấy sống sút là 0%. Kết quả trờn cho thấy việc sử dụng kết hợp NAA và IBA khụng mang lại hiệu quả trong tạo rễ in vitro cõy thụng nhựa.