tumefaciens
3.2.2.1 Xỏc ủịnh nồng ủộ chất chọn lọc dựng cho thớ nghiệm chuyển gen
Nguyờn liệu sử dụng trong thớ nghiệm xỏc ủịnh ngưỡng chọn lọc là cõy mầm. Sau hai tuần nảy mầm, phần ngọn của cõy cú chiều dài 0,5 cm ủược bổ dọc và ủặt lờn mụi trường tạo ủa chồi. Sau 2 tuần nuụi cấy, lựa chọn cỏc mảnh mẫu cú chất lượng tốt, ủồng ủều và cấy lờn mụi trường cú bổ sung nồng ủộ khỏc nhau của kanamycine, hygromycine, PPT, thời gian cấy chuyển một thỏng 1 lần. Sau hai thỏng chọn lọc tiến hành thống kờ cỏc chỉ tiờu: tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu tạo ủa chồi…
3.2.2.2 Tạo nguyờn liệu ủể chuyển gen
Nguyờn liệu là phụi hạt chớn: Sau khi khử trựng, phụi hạt ủược tỏch khỏi nội nhũ và ủặt trờn mụi trường cảm ứng tạo ủa chồi gồm cú cỏc muối cơ bản của M16 bổ sung 1 mg/l BAP + 2 mg/l NAA + 1 g/l casein + 50 g/l sucrose + 9 g/l agar, pH = 5,8. Sau hai ngày trờn mụi trường cảm ứng, phụi hạt ủược lấy khỏi mụi trường và ngõm trong dung dịch ẵ M16 trước khi tiến hành siờu õm và nhiễm khuẩn.
Nguyờn liệu là cõy mầm: Phụi hạt chớn ủược ủặt lờn mụi trường nảy mầm phụi: M16 bổ sung 30 g/l sucrose + 0,2 mg/l GA3 + 9 g/l agar + 1,5 g/l than hoạt tớnh, pH = 5,8. Phụi ủược nảy mầm trong ủiều kiện tối hoàn toàn. Sau cỏc khoảng thời gian khỏc nhau, cõy mầm ủược sử dụng làm nguyờn liệu chuyển gen. Dựng panh, dao vụ trựng cắt phần ủỉnh mầm với chiều dài 0,7 cm sau ủú bổ ủụi ủỉnh sinh trưởng theo chiều dọc tạo thành hai mảnh mẫu. Mẫu ủược ngõm trong dung dịch ẵ M16 trước khi nhiễm khuẩn.
3.2.2.3 Tạo dịch huyền phự vi khuẩn Agrobacterium
Lấy chủng khuẩn từống giữ chủng và cấy vạch lờn mụi trường LB ủặc (bổ sung 50 mg/l kanamycine, 25 mg/l chloramphenicol, 100 mg/l spectinomycin, 100 mg/l streptomycin), nuụi trong tủổn nhiệt 28oC trong thời gian 48 giờ.
Lấy một khuẩn lạc riờng biệt phỏt triển tốt trờn ủĩa khuẩn ủó cấy vạch và cấy vào mụi trường LB lỏng bổ sung cỏc loại khỏng sinh như nuụi ủặc. Bỡnh nuụi lỏng ủược ủặt trong mỏy lắc với tốc ủộ 200 vũng/phỳt, nhiệt ủộ 28oC và ủiều kiện tối hoàn
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………25
toàn. Sau 12-14 giờ, dịch khuẩn ủược hũa loóng 3 lần và tiếp tục nuụi phục hồi với thời gian 2-4 giờ. Sau ủú, dịch khuẩn ủược ly tõm với tốc ủộ 6000 vũng/phỳt, thời gian 10 phỳt. Sinh khối tế bào ủược hũa loóng trong dung dịch ẵ M16 về mật ủộ huyền phự vi khuẩn ủạt OD660nm 0,75 - 1,0, sau ủú bổ sung acetosyringone (AS) ở nồng ủộ 100 àM trước khi biến nạp.
3.2.2.4 Nhiễm khuẩn và ủồng nuụi cấy
Nhiễm khuẩn vào phụi hạt chớn: Mẫu phụi chuẩn bị ngõm trong ẵ M16 ủược tạo thương tổn bằng cỏch ngõm trong bể siờu õm (Bransonics 1210) với cỏc mức thời gian 20-90 giõy. Sau khi siờu õm, loại bỏ phần dung dịch và ngõm mẫu trong huyền phự vi khuẩn (ủó chuẩn bịở phần trờn) trong thời gian 30 phỳt. Sau khi nhiễm khuẩn, mẫu phụi ủược thấm khụ và cấy lờn mụi trường cảm ứng tạo ủa chồi M16 bổ sung 1 mg/l BAP + 2 mg/l NAA + 1 g/l casein + 50 g/l sucrose + 9 g/l agar, pH = 5,8, ủồng nuụi cấy ba ngày trong ủiều kiện tối hoàn toàn.
Nhiễm khuẩn vào mẫu cõy mầm: mẫu cõy mầm ủó ủược chuẩn bị ngõm trong ẵ M16 ủược vớt ra và ngõm trong huyền phự vi khuẩn trong thời gian 30 phỳt. Sau thời gian nhiễm khuẩn mẫu vật ủược thấm khụ và cấy lờn mụi trường M16 bổ sung 7 mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar, pH = 5,8. Mẫu ủược ủồng nuụi cấy với vi khuẩn trong ủiều kiện tối hoàn toàn với thời gian 3 ngày.
3.2.2.5 Diệt khuẩn, chọn lọc và tỏi sinh cõy
Sau thời gian ủồng nuụi cấy, mẫu biến nạp ủược lấy ra rửa sạch bằng nước cất khử trựng, lắc trong nước cất bổ sung 500 mg/l cefotaxime trong thời gian 10 phỳt, thấm khụ bằng giấy thấm khử trựng và cấy mẫu lờn mụi trường tạo ủa chồi.
- Với nguyờn liệu là phụi hạt chớn: M16 bổ sung 9 mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 500 mg/l cefotaxime + 6 mg/l PPT.
- Với nguyờn liệu là cõy mầm: M16 bổ sung 6 mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 500 mg/l cefotaxime + 6 mg/l PPT
Thời gian cấy chuyển 2 tuần 1 lần. Sau 2 thỏng chọn lọc, cỏc cụm chồi sống sút và phỏt triển ủược chuyển sang mụi trường kộo dài chồi. Chồi ủơn cú chiều dài 1,5 cm – 2 cm ủược tỏch ra và cấy lờn mụi trường tạo rễ và tạo cõy hoàn chỉnh.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………26
3.2.2.6 Phõn tớch biểu hiện gen gus bằng nhuộm hoỏ mụ tế bào
Một số mẫu vật ở cỏc giai ủoạn khỏc nhau trong quỏ trỡnh tỏi sinh chồi sau khi chuyển gen ủược lấy ra, rửa sạch vi khuẩn, thấm khụ làm nguyờn liệu kiểm tra biểu hiện của gen chỉ thị gus bằng phản ứng nhuộm màu. Mẫu vật ủược ngõm trong dung dịch X-Gluc (50 mM Na2HPO4 và NaH2PO4, pH = 7,0, 10 mM K3[Fe(CN)6], 10 mM K4[Fe(CN)6], 10 mM Na2EDTA, 0,1% (v/v) Triton-100, 1,5 mM X-glucuronide) và ủ trong tủổn nhiệt ở nhiệt ủộ 37oC, thời gian ủ từ 24 - 48 giờ. Sau thời gian ủ, mẫu ủược rửa sạch bằng nước cất khử trựng và ngõm vào dung dịch cồn 70% nhằm loại bỏ diệp lục tố. Sau khi loại bỏ hoàn toàn chất diệp lục, mẫu cấy ủược ủưa lờn kớnh hiển vi soi nổi, quan sỏt, tớnh toỏn và chụp ảnh mức ủộ biểu hiện màu.