So với cõy trồng nụng nghiệp, việc chuyển gen trờn ủối tượng cõy lõm nghiệp mới chỉ thu ủược những kết quả khiờm tốn và cũn nhiều hạn chế. Hai trở ngại lớn nhất trong chuyển gen ủối với cõy lõm nghiệp là việc tỏi sinh ủối với cõy thõn gỗ gặp nhiều khú khăn (cõy sinh trưởng chậm; chu kỳ tỏi sinh in vitro dài), việc ủỏnh giỏ mức ủộ biểu hiện và sự bền vững của gen chuyển cần nhiều thời gian bởi chu kỳ sinh trưởng và phỏt triển của cỏc thế hệ cõy lõu năm [66].
Tuy vậy, cho tới nay cú khỏ nhiều cụng bố thành cụng về nghiờn cứu hệ thống tỏi sinh in vitro và chuyển gen trờn nhiều ủối tượng cõy lõm nghiệp: dương, keo, bạch
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………18
ủàn, xoan, thụng… [29], [34], [42]. Những nghiờn cứu về cụng nghệ sinh học trong lõm nghiệp ủó ủược tiến hành trờn 80 quốc gia [41], trong ủú chõu Âu chiếm 39%, chõu Á 24% và 23% thuộc về Bắc Mỹ, cũn lại là chõu ðại Dương, chõu Phi, Nam Mỹ. Theo bỏo cỏo của FAO [41] cú 6 loại cõy rừng ủược tập trung nghiờn cứu là thụng (20%), bạch ủàn (11%), Picea (9%), dương (9%), Quercus (7%) và keo (6%). Cỏc gen ủược nghiờn cứu và ỏp dụng chủ yếu là gen khỏng sõu (cryIA/a, b, c), gen tăng cường chất lượng gỗ, giảm hàm lượng lignin (F5H-Ferulate-5-hydroxylase;
C4H-cinnamate 4-hydroxylase), gen kớch thớch sinh trưởng (gen Xycloglucanases,
gen CEL1) và gen chịu mặn ( mtlD, nha1). Cho tới nay, trờn thế giới cú khoảng 210 thử nghiệm ủồng ruộng cõy lõm nghiệp biến ủổi gen ở cỏc ủối tượng cõy dương, thụng, Sau sau, keo và bạch ủàn. Tớnh trạng khỏng sõu trờn cõy thụng và cõy dương ủó ủược thử nghiệm ở bốn quốc gia Argentina, Canada, Trung Quốc và Mỹ. Theo cỏc bỏo cỏo, ủến nay duy nhất chỉ Trung Quốc cú cõy dương chuyển gen khỏng sõu ủó ủược thương mại húa với diện tớch khoảng 300-500 ha, bờn cạnh ủú cõy thụng cũng ủang ủược thử nghiệm .
Ở nước ta trong những năm gần ủõy, ủối tượng cõy lõm nghiệp cũng ủó ủược quan tõm ủầu tư nghiờn cứu và mang lại những thành cụng ủỏng kể trờn cả hai phương diện nhõn nhanh - chuyển gen. Kỹ thuật nuụi cấy mụ tế bào ủược ứng dụng nhằm nhõn nhanh một số giống cõy lõm nghiệp với mức ủộ ủồng ủều cao, hệ số nhõn lớn và chất lượng cõy giống ủảm bảo. Rất nhiều quy trỡnh nhõn nhanh hiệu quảủược ỏp dụng rộng rói trong sản xuất trờn nhiều ủối tượng cõy lõm nghiệp như bạch ủàn, keo, hụng [17], [12]. Cỏc nghiờn cứu về chuyển gen trờn ủối tượng cõy lõm nghiệp cũn hạn chế tuy nhiờn ủó cú những thành tựu khả quan trờn một số ủối tượng quan trọng như hụng, keo, xoan… [4], [5]. Việc chuyển và biểu hiện thành cụng một số gen chỉ thị như gen khỏng thuốc trừ cỏ bar, gen gus là cơ sở quan trọng ủể tiến hành chuyển cỏc gen mong muốn vào cỏc ủối tượng cõy rừng quan trọng này.
Với nhiều lợi ớch về kinh tế cũng như sinh thỏi, cõy thụng là một trong những ủối tượng cõy lõm nghiệp quan trọng nhất và ủược xếp vào nhúm 6 cõy trồng rừng quan trọng ủược tập trung nghiờn cứu trờn toàn thế giới.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………19
Tuy nhiờn, ở nhúm cõy cú quả hỡnh nún núi chung và cõy thụng núi riờng, kết quả chuyển gen mới chỉủược cụng bố cỏch ủõy khoảng 10 năm [64], [68] và giới hạn ở một vài loài nhất ủịnh [39], [45], [51], [53], [71].
Cú rất nhiều phương phỏp chuyển gen ủược ỏp dụng và ủó thu ủược thành cụng trờn nhiều ủối tượng cõy trồng. Tuy nhiờn với cõy thụng, hai phương phỏp chuyển gen ủược ỏp dụng chủ yếu: Phương phỏp biến nạp trực tiếp sử dụng sỳng bắn gen và phương phỏp giỏn tiếp thụng qua vi khuẩn Agrobacterium.
Chuyển gen trực tiếp sử dụng sỳng bắn gen ủó ủược một số tỏc giả ỏp dụng với những thành cụng trờn một số loài thụng khỏc nhau. Năm 2004, Lining [55] và cộng sự ủó nghiờn cứu ủỏnh giỏ về kớch thước hạt vàng dựng trong chuyển gen và tỏi sinh thành cụng cõy thụng thuộc loài Picea mariana mang gen chỉ thị gus. Lin và cộng sự [54] sử dụng phụi hạt chớn của loài thụng Larix gmelinii L. làm nguyờn liệu chuyển gen ủồng thời tỏi sinh thành cụng cõy thụng mang gen chỉ thị gus. Cũng với phương phỏp này, Tuija và cộng sự [73] ủó thu ủược cõy thụng mang gen gus thuộc loài Pinus
sylvestris L. Một gen chọn lọc khỏc là gen khỏng thuốc trừ cỏ cũng ủó ủược chuyển thành cụng vào cõy thụng loài Pinus radiata [29]. Khụng chỉ dừng lại ở những gen chỉ thị, Tang và cộng sự [68] ủó thành cụng trong việc chuyển gen và tỏi sinh cõy thụng loàiPinus radiata mang gen khỏng sõu CryIAc. Mặc dự ủó cú khỏ nhiều kết quả ủược cụng bố khi sử dụng phương phỏp chuyển gen trực tiếp bằng sỳng bắn gen, nhưng hầu hết cỏc nghiờn cứu ủược thực hiện trờn cỏc loài thụng cú khả năng tỏi sinh thụng qua phụi soma. ðường hướng tỏi sinh thụng qua ủa chồi vẫn chưa thu ủược thành cụng với phương phỏp này. Ngoài ra, một trở ngại lớn trong việc ứng dụng phương phỏp chuyển gen này ủú là yờu cầu về trang thiết bị và cụng nghệ, ủồng thời chi phớ thực hiện cao.
So với phương phỏp trờn, phương phỏp chuyển gen giỏn tiếp thụng qua vi khuẩn
A. tumefaciens ủược ỏp dụng phổ biến hơn trong chuyển gen vào cõy thụng. Nguyờn liệu sử dụng ủể chuyển gen khỏ phong phỳ như: phụi hạt chớn, phụi non, chồi ngọn… phạm vi ứng dụng là hầu hết cỏc loài thụng khỏc nhau. Những thành cụng trong chuyển gen thụng qua Agrobacterium ủược cụng bố trờn cả hai ủường hướng tỏi sinh thụng qua phụi soma và tỏi sinh thụng qua ủa chồi [43], [47]. Việc chuyển và tỏi sinh thụng qua ủa
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………20
chồi cú ý nghĩa quan trọng vỡ khụng phải bất cứ loài thụng nào cũng cú khả năng tỏi sinh qua con ủường mụ sẹo và phụi soma. Cho ủến nay, rất nhiều nghiờn cứu chuyển gen sử dụng A. tumefaciens và tỏi sinh phụi soma ủó thành cụng với cỏc gen chỉ thị như gus,
bar, pptII trờn nhiều loài thụng khỏc nhau Pinus patula, Pinus radiata D., Pinus taeda,
Picea abies…[34], [45], [60], [71], [75]. Jean và cộng sự [48] cũng ủó chuyển thành cụng gen chỉ thị gus vào loài thụng Pinus taeda bằng việc sử dụng ủỉnh chồi và tỏi sinh thụng qua ủa chồi. Từ những thành cụng trờn cỏc tỏc giả tập trung vào chuyển cỏc gen hữu ớch như gen khỏng sõu, tăng khả năng sinh trưởng ...
Nhỡn chung, kết quả tạo cõy thụng chuyển gen chủ yếu thành cụng trờn một số ớt loài, phần lớn chỳng cú hiệu suất tỏi sinh cao thụng qua phụi soma ủiển hỡnh là
Pinus radiata và Pinus taeda. Hiện nay, Trung Quốc là nước ủầu tiờn ủưa cõy thụng chuyển gen vào khảo nghiệm ủồng ruộng và tiến hành ủỏnh giỏ tiến tới ỏp dụng rộng rói. Mặc dự vậy, trờn thế giới vẫn chưa cú một cụng bố nào về chuyển gen trờn cõy thụng nhựa Pinus merkursii.
Ở Việt Nam, khụng giống cỏc ủối tượng cõy rừng khỏc như bạch ủàn, keo hay xoan, những nghiờn cứu trờn cõy thụng mới chỉ là bước ủầu và mang tớnh chất thăm dũ. Một số kết quả ủó cụng bố dừng lại ở việc khảo sỏt nhõn nhanh cõy thụng trong ủiều kiện in vitro và chưa cú ủược một quy trỡnh tỏi sinh hoàn chỉnh [17], [12], [6]. Thụng nhựa là loài thụng phổ biến ở nước ta và là ủối tượng bị thiệt hại nặng nhất bởi sõu rúm nờn ủược chọn làm ủối tượng chuyển gen. Khú khăn khi nghiờn cứu với Thụng nhựa vỡ ủõy là loài thụng bản ủịa ở khu vực ðụng Nam chõu Á, ớt ủược tiếp cận. Do vậy, xõy dựng quy trỡnh tỏi sinh in vitro và thử nghiệm khả năng chuyển gen ở cõy thụng nhựa là bước ủi ủầu tiờn và rất quan trọng ủể tiến hành chuyển gen khỏng sõu vào loại cõy này.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………21
3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.1 Vật liệu