C. Chồi tạo ủược trờn cụng thức ủối chứng (khụng cảm ứng).
B. Mẫu cõy mầm bổ dọc trờn mụi trường tạo ủa chồi C, D, E Cỏc dạng chồi hỡnh thành trờn mẫu cấy
4.2.1 Xỏc ủị nh ngưỡng nồng ủộ ch ất chọn lọc PPT và hygromycine trong thớ nghiệm chuyển gen
nghiệm chuyển gen
Trong quỏ trỡnh chuyển gen, việc chọn lọc và xỏc ủịnh ủược cỏc cỏ thể mang gen chuyển là một khõu hết sức quan trọng. ðể cụng tỏc chọn lọc hiệu quả cần thiết lập ủược một mụi trường chọn lọc với ngưỡng phự hợp ủể cú thể loại bỏ phần lớn cỏc cỏ thể khụng mang gen chuyển ủồng thời giữ lại ủược toàn bộ cỏc cỏ thể ủó ủược chuyển gen. Hệ thống tỏi sinh thụng qua ủa chồi từ hai loại nguyờn liệu là phụi hạt chớn nguyờn vẹn và cõy mầm ủó ủược chứng minh hiệu quả trong phần xõy dựng quy trỡnh tỏi sinh ủể phục vụ cụng tỏc chuyển gen. ðể tiến hành cỏc thớ nghiệm chuyển gen chỉ thị gus nằm trong cỏc vector pPTN289 (chứa gen bar) và gen khỏng sõu cryIA(c) nằm trong vector pCAMBIA1300 (chứa gen khỏng hygromycine) (phụ lục 2), chỳng tụi tiến hành xỏc ủịnh ngưỡng nồng ủộ của PPT và hygromycine ủể chọn lọc cõy thụng nhựa chuyển gen. Kết quả tổng hợp trờn bảng 4.10.
Bảng 4.10. Ảnh hưởng chất chọn lọc tới khả năng sống sút của cõy thụng nhựa PPT hygromycine Nồng ủộ (mg/L) Tỷ lệ phụi sống sút (%) Tỷ lệ cõy in vitro sống sút (%) Nồng ủộ (mg/L) Tỷ lệ phụi sống sút (%) Tỷ lệ cõy in vitro sống sút (%) ðC 100 100 ðC 100 100 4 38,6 65,3 1 58,3 74,3 5 13,3 28,7 2 20,0 33,5 6 3,8 5,4 4 6,2 8,3 7 0,0 2,5 6 0,0 0,0 8 0,0 0,00 8 0,0 0,0 LSD (0,05) 4,5 1,3 LSD (0,05) 2,4 2,0 CV % 3,5 2,1 CV % 2,8 3,2
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………50
Xỏc ủịnh nồng ủộ chất chọn lọc PPT
Lờ Tấn ðức và cộng sự [5] khi nghiờn cứu về chuyển gen và chọn lọc trờn ủối tượng cõy Hụng ủó thử nghiệm ngưỡng nồng ủộ PPT từ 2-8 mg/l. Kết quả nghiờn cứu của tỏc giả ủó xỏc ủịnh ngưỡng nồng ủộ 4mg/l PPT thớch hợp cho việc chọn lọc cõy Hụng chuyển gen. Tuy nhiờn, Nguyễn Thị Tõm [19] ủó thử nghiệm tới nồng ủộ 4 mg /l PPT cho chọn lọc cõy thụng nhựa nhưng tỷ lệ cõy sống sút vẫn cũn rất cao (phụi hạt là 33,3%, cõy in vitro cũn 68,5%). Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi tiếp tục thử nghiệm cỏc nồng ủộ từ 4 – 8 mg/l PPT nhằm xỏc ủịnh ngưỡng phự hợp chọn lọc cõy thụng nhựa chuyển gen với hai loại nguyờn liệu là phụi hạt và cõy in vitro.
Sau 8 tuần nuụi cấy cho thấy, PPT ảnh hưởng trực tiếp tới tỷ lệ sống sút cũng như khả năng sinh trưởng của mẫu cấy. Tỷ lệ phụi sống sút trờn mụi trường bổ sung 4mg/l PPT là 38,6 % và ở nồng ủộ 6 mg/l chỉ cũn lại 3,8 %. Tiếp tục tăng nồng ủộ PPT lờn 7 và 8 mg/l, toàn bộ mẫu cấy ủều bị chết. Với nguyờn liệu là cõy in vitro, kết quả thu ủược cú chiều hướng tương tự. Tỷ lệ mẫu sống sút giảm mạnh từ 65,3 % (4mg/l PPT) tới 2,5 % (7 mg/l PPT). Tuy nhiờn, ủể toàn bộ mẫu cõy in vitro bị tiờu diệt nồng ủộ PPT phải cần tới 8 mg/l. Quan sỏt hỡnh thỏi mẫu cấy cho thấy, hầu hết cỏc cõy sống sút ủều cú sức sinh trưởng kộm, biểu hiện lỏ chuyển vàng, phần gốc và rễ cú màu thõm ủen và kộm phỏt triển (hỡnh 4.10).
Xỏc ủịnh nồng ủộ khỏng sinh chọn lọc hygromycine
Gen chọn lọc khỏng hygroycine thường ủược thiết kế trong nhiều vector dựng ủể chuyển gen ở thực vật . Việc xỏc ủịnh ngưỡng nồng ủộ chọn lọc thớch hợp ủối với từng loại cõy trồng cần phải thực hiện trước khi thực hiện cỏc thớ nghiệm chuyển gen.
Năm 2004, Tang Wei và cộng sự [70] ủó sử dụng ngưỡng nồng ủộ 4,5 mg/l hygromycine ủể chọn chọn lọc cõy thụng chuyển gen loài Pinus taeda. ðể xỏc ủịnh nồng ủộ hygromycine thớch hợp cho chọn lọc cõy thụng nhựa chuyển gen, trong thớ nghiệm này, chỳng tụi sử dụng nồng ủộ hygromycine dao ủộng từ 1- 8 mg/l mụi trường. Hai loại nguyờn liệu dựng trong nghiờn cứu này gồm phụi hạt chớn và cõy thụng nhựa in vitro.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………51
Hỡnh 4.10. Mẫu Thụng nhựa sống sút trờn mụi trường bổ sung PPT
