Xây dựng quy trình tái sinh cây hành đẻ (Allium Wakegi) từ callus và bước đầu đánh giá ảnh hưởng của colchicine đến sự cảm ứng đa bội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI PHẠM THỊ THU TRANG XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY HÀNH ðẺ (ALLIUM WAKEGI) TỪ CALLUS VÀ BƯỚC ðẦU ðÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA COLCHICINE ðẾN SỰ CẢM ỨNG ðA BỘI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Lý Anh HÀ NỘI - 2014 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực. Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin ñược trích dẫn trong luận văn này ñã ñược ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 22 tháng 1 năm 2014 Tác giả luận văn Phạm Thị Thu Trang Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội, khoa Công nghệ Sinh học, Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật ñã truyền ñạt kiến thức trong suốt quá trình học tập, cũng như hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Lý Anh, người ñã ñịnh hướng, trực tiếp hướng dẫn và ñóng góp cụ thể trong quá trình thực hiện luận văn của tôi. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Viện Sinh học Nông nghiệp, Khoa Công nghệ Sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian làm ñề tài. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình, bạn bè, người thân ñã ñộng viên cũng như quan tâm, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường và thực tập tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 1 năm 2014 Tác giả luận văn Phạm Thị Thu Trang Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH viii PHẦN I MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích, yêu cầu 2 1.2.1. Mục ñích 2 1.2.2. Yêu cầu 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 1.3.1. Ý nghĩa khoa học 3 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn 3 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Giới thiệu chung về cây hành ðẻ (Allium wakegi) 4 2.1.1. Nguồn gốc, phân loại 4 2.1.2. ðặc ñiểm sinh học của cây hành ðẻ 5 2.1.3. Giá trị của cây hành tỏi 6 2.1.4. Tình hình sản xuất hành tỏi ở Việt Nam 8 2.2. Cơ chế tác ñộng của Colchicine lên tế bào 8 2.2.1. Bản chất của colchicine 8 2.2.2. Cơ chế tác ñộng của colchicine ñến quá trình phân bào 9 2.3. Các nghiên cứu về tạo callus và tái sinh cây trên hành tỏi 10 2.4. Các nghiên cứu xử lý colchicine gây cảm ứng ña bội trên thực vật 12 2.4.1. Các nghiên cứu xử lý colchicine gây cảm ứng ña bội 12 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv 2.4.2. Các nghiên cứu xử lý colchicine gây cảm ứng ña bội hành tỏi 13 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1. ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm 17 3.1.1. ðối tượng 17 3.1.2. Vật liệu 17 3.1.3. ðịa ñiểm 17 3.2. Nội dung nghiên cứu 17 3.2.1. Xây dựng quy trình tái sinh cây hành ðẻ từ callus 17 3.2.2. Xác ñịnh phương pháp xử lý colchicine in vitro thích hợp trên cây hành ðẻ 19 3.2.3.Bước ñầu ñánh giá ñộ bội của cây thu ñược sau xử lý colchicine 20 3.3. Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1. Quy trình kỹ thuật tách ñỉnh chồi 20 3.3.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 21 3.3.3. Phương pháp xử lý bằng colchicine 21 3.3.4. Phương pháp ñánh giá ñộ bội của chồi tái sinh 21 3.3.5. ðiều kiện thí nghiệm 22 3.3.6. Bố trí thí nghiệm 22 3.3.7. Phương pháp theo dõi 23 3.3.8. Xử lý số liệu 23 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY HÀNH ðẺ (Allium wakegi) TỪ CALLUS 24 4.1.1. Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng ñến sự hình thành callus từ ñỉnh sinh trưởng cây hành ðẻ 24 4.1.2. Ảnh hưởng của ñường và chất ñiều tiết sinh trưởng ñến sự phát sinh chồi từ callus 27 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v 4.1.3. Ảnh hưởng của kinetin ñến sự nhân nhanh chồi 31 4.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất ñến sự ra rễ của cây tái sinh 32 4.2. NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ COLCICINE THÍCH HỢP ðỐI VỚI CÂY HÀNH ðẺ 37 4.2.1. Phương pháp 1: nuôi cấy ñỉnh chồi cây hành ðẻ trong môi trường có bổ sung của colchicine trong 6 tuần 37 4.2.2. Phương pháp 2: ðỉnh chồi ñược nuôi cấy trong môi trường có bổ sung colchicine trong 2 tuần sau ñó cấy chuyển sang môi trường không có colchicine 39 4.2.3. Phương pháp 3: lắc callus trong môi trường có bổ sung colchicine 42 4.2.4. Bước ñầu ñánh giá ñộ bội của cây thu ñược sau xử lý colchicine 47 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 52 5.1. Kết luận 52 5.2. ðề nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 57 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 4.1. Ảnh hưởng của 2,4D ñến sự tạo thành callus từ ñỉnh sinh trưởng sau 6 tuần nuôi cấy 25 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của picloram ñến sự tạo thành callus từ ñỉnh chồi sau 6 tuần nuôi cấy 26 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của các loại ñường và chất ñiều tiết sinh trưởng ñến sự tạo chồi từ callus - sau 6 tuần nuôi cấy 29 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của kinetin ñến sự nhân nhanh chồi thu ñược sau xử lý colchicine (sau 4 tuần nuôi cấy) 31 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của IAA ñến sự ra rễ của cây tái sinh 33 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của than hoạt tính ñến sự ra rễ của cây tái sinh 35 Bảng 4.7. Sức sống và sự tái sinh chồi từ ñỉnh sinh trưởng cây hành ðẻ (Allium wakegi) nuôi cấy theo phương pháp 1 - (sau 6 tuần nuôi cấy) 37 Bảng 4.8. Sức sống và khả năng tái sinh chồi từ ñỉnh sinh trưởng cây hành ðẻ (Allium wakegi) nuôi cấy theo phương pháp 2 - (sau 6 tuần nuôi cấy) 40 Bảng 4.9. Ảnh hưởng của colchicine ñến sức sống và khả năng phát sinh chồi của callus khi lắc trong 24h – sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS 42 Bảng 4.10. Ảnh hưởng của colchicine ñến sức sống và khả năng phát sinh chồi của callus khi lắc trong 36h – sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS 43 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii Bảng 4.11. Ảnh hưởng của colchicine ñến sức sống và khả năng tái sinh chồi của callus khi lắc trong 48h – sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS 44 Bảng 4.12. Kết quả phân nhóm cây tạo thành sau xử lý colchicine 47 Bảng 4.13. Kết quả phân nhóm cây tạo thành sau xử lý colchicine theo số lượng và kích thước khí khổng (%) 50 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1. Cấu trúc phân tử colchicine 1 Hình 2.2. Quá trình phân bào bình thường và ảnh hưởng của colchicine 9 Hình 4.1. Callus tạo thành trên môi trường 2,4D 1 Hình 4.2. Callus hình thành trên môi trường bổ sung picloram 1 Hình 4.3. Ảnh hưởng của picloram ñến sự phát sinh callus 1 Hình 4.4. Ảnh hưởng của ñường và BA ñến sự phát sinh chồi của callus thu ñược trên môi trường bổ sung picloram 1 Hình 4.5. Ảnh hưởng của ñường và BA ñến sự phát sinh chồi của callus thu ñược trên môi trường bổ sung 2,4D 1 Hình 4.6. Ảnh hưởng của kinetin ñến sự nhân nhanh chồi 32 Hình 4.7. Ảnh hưởng của IAA ñến sự sinh trưởng, phát triển và ra rễ của cây tái sinh 34 Hình 4.8. Ảnh hưởng của colchicine (xử lý theo phương pháp 1) ñến sự phát sinh chồi và callus của ñỉnh sinh trưởng 39 Hình 4.9. Ảnh hưởng của colchicine (xử lý theo phương pháp 2) ñến sự phát sinh chồi và callus của ñỉnh sinh trưởng 41 Hình 4.10. Ảnh hưởng của nồng ñộ colchicine ñến sức sống và khả năng phát sinh chồi từ callus trong thời gian lắc 24h 44 Hình 4.11. Ảnh hưởng của nồng ñộ colchicine ñến sức sống và khả năng phát sinh chồi từ callus trong thời gian lắc 36h 45 Hình 4.12. Ảnh hưởng của nồng ñộ colchicine ñến sức sống và khả năng phát sinh chồi từ callus trong thời gian lắc 48h 45 Hình 4.13. So sánh tỷ lệ mẫu sống khi lắc callus trong 24h, 36h và 48h 46 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ix Hình 4.14. So sánh tỷ lệ mẫu phát sinh chồi khi lắc callus trong 24h, 36h và 48h 46 Hình 4.15. So sánh hình thái cây nhóm 1 và nhóm 2 1 Hình 4.16. Tế bào khí khổng cây hành ðẻ sau xử lý colchicine 48 Hình 4.17. Khí khổng ở các nhóm cây 1 – 4 49 [...]... Nam hành t i v n chưa ñư c quan tâm nghiên c u nhi u, ñ c bi t là nh ng nghiên c u v xây d ng quy trình tái sinh cây t callus và t o c m ng ña b i b ng cách x lý colchicine Trên cơ s nh ng v n ñ nêu trên, chúng tôi ti n hành ñ tài: Xây d ng quy trình tái sinh cây hành ð (Allium wakegi) t callus và bư c ñ u ñánh giá nh hư ng c a colchicine ñ n s c m ng ña b i” 1.2 M c ñích, yêu c u 1.2.1 M c ñích Xây. .. ñư c quy trình tái sinh cây t callus hành ð và bư c ñ u xác ñ nh ñư c phương pháp x lý colchicine in vitro phù h p cho t o ña b i hóa cây hành ð 1.2.2 Yêu c u - Xác ñ nh ñư c môi trư ng t o callus t ñ nh ch i - Xác ñ nh ñư c môi trư ng t o th ti n ch i t callus - Xác ñ nh ñư c môi trư ng tái sinh cây t callus - Xác ñ nh ñư c môi trư ng nhân nhanh cây sau tái sinh - Xác ñ nh ñư c môi trư ng t o cây. .. T QU VÀ TH O LU N 4.1 XÂY D NG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY HÀNH ð (Allium wakegi) T CALLUS 4.1.1 nh hư ng c a ch t ñi u ti t sinh trư ng ñ n s hình thành callus t ñ nh sinh trư ng cây hành ð Auxin có vai trò quan tr ng trong s t o callus Trong môi trư ng nuôi c y, auxin thư ng gây ra s t o bư u các mô và cơ quan, kích thích s phân chia t bào (t o mô s o), kích thích s t o r b t ñ nh, gây ra s phát sinh. .. gi ng m i Chính vì v y, chúng tôi ti n hành ñ tài Xây d ng quy trình tái sinh cây hành ð (Allium wakegi) t callus và bư c ñ u ñánh giá nh hư ng c a colchicine ñ n s c m ng ña b i” Qua nghiên c u này, chúng tôi mong mu n bư c ñ u t o ra cây gi ng hành m i có kích thư c và năng su t cao nhưng v n gi ñư c nh ng giá tr v hương v cũng như tính thích nghi như gi ng hành ð ban ñ u Trư ng ð i H c Nông Nghi... ng và phát tri n c a callus r t nhi u cây thu c h hành t i S có m t c a cytokinin trong môi trư ng dinh dư ng không th c s c n thi t và ch khi có s k t h p c a auxin và cytokinin thì callus m i hình thành (Haim D Rabinowitch và c ng s , 1990) Công th c môi trư ng và các ch t ñi u ti t sinh trư ng thích h p cho quá trình tăng sinh t bào và hình thành callus thì không kích thích ñư c callus phát sinh. .. nh hư ng c a n ng ñ colchicine và th i gian l c callus trong colchicine ñ n s c s ng và s tái sinh ch i t callus (phương pháp 3) N ng ñ colchicine 0,1 mg/l 0,2 mg/l 0.3 mg/l 0,4 mg/l Th i gian x lý 24h CT1 CT2 CT3 CT4 36h CT6 CT7 CT8 CT9 48h CT11 CT12 CT13 CT14 3.2.3.Bư c ñ u ñánh giá ñ b i c a cây thu ñư c sau x lý colchicine Cây tái sinh thu ñư c sau x lý colchicine ñư c ñánh giá ñ b i b ng phương... invivo và là v t li u ñ ñánh giá s b n v ng c a các th kh m Không có s thay ñ i v ñ b i gi a các ch i m m sinh ra t các th nh b i và t b i Kho ng 30% ch i t cây 4-2-2 và 90% ch i t cây 2-4-4 duy trì d ng kh m t nhiên như cây m Cây con tái sinh t cây 2-4-2, 4-4-2 và 4-8-4 b m t ho c thay ñ i các tính tr ng kh m t nhiên và có xu hư ng gi ng cây nh b i, t b i, 4-2-2 và 2-4-4 ð nh ch i phân l p t các cây. .. wakegi) nói riêng 1.3.2 Ý nghĩa th c ti n ð xu t ñư c quy trình tái sinh cây in vitro thông qua callus và bư c ñ u ñ xu t ñư c phương pháp x lý Colchicine in vitro cho kh năng t o ña b i ñ i v i cây hành ð (Allium wakegi) làm cơ s cho công tác ch n t o gi ng m i Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 3 PH N II T NG QUAN TÀI LI U 2.1 Gi i thi u chung v cây hành ð (Allium. .. (11,4 M) Các cây t o thành khi ñư c tr ng ra ñ t th h ñ u không phát sinh ch i m i, tuy nhiên th h sinh s n vô tính ti p theo cây b t ñ u sinh trư ng, phát tri n bình thư ng Môi trư ng không có ch t ñi u ti t sinh trư ng r t thích h p cho quá trình phát sinh ch i t callus trên cây t i tây (A ampeloprasum) (Debergh và c ng s , 1976) Callus ñư c t o thành khi nuôi c y ñ u hoa cây t i tây thì d v và có hình... hình thành nên t bào ñư c ña b i hóa: t 2n tr thành 3n, 4n (Stanley và c ng s , 1965) Theo nh ng nghiên c u c a Tr n Duy Quý và Lê Duy Thành, 1997 thì colchicine d ng dung d ch có kh năng khu ch tán m nh vào mô th c v t Hi n tư ng ña b i hóa ch x y ra khi có tác d ng c a colchicine ñ n nh ng mô ñang phân hóa m nh 2.3 Các nghiên c u v t o callus và tái sinh cây trên hành t i Trên ñ i tư ng hành t i, callus . XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY HÀNH ðẺ (Allium wakegi) TỪ CALLUS 24 4.1.1. Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng ñến sự hình thành callus từ ñỉnh sinh trưởng cây hành ðẻ 24 4.1.2. Ảnh. nêu trên, chúng tôi tiến hành ñề tài: Xây dựng quy trình tái sinh cây hành ðẻ (Allium wakegi) từ callus và bước ñầu ñánh giá ảnh hưởng của colchicine ñến sự cảm ứng ña bội . 1.2 Mục ñích, yêu. 4.5. Ảnh hưởng của IAA ñến sự ra rễ của cây tái sinh 33 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của than hoạt tính ñến sự ra rễ của cây tái sinh 35 Bảng 4.7. Sức sống và sự tái sinh chồi từ ñỉnh sinh trưởng cây