Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ựiều tiết sinh trưởng ựến sự tạo thành callus từ ựỉnh sinh trưởng
Thắ nghiệm 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D ựến sự tạo thành callus từ ựỉnh sinh trưởng
Môi trường cơ bản ựược sử dụng gồm MS + 30g ựường + 5,5g agar (MS) ở pH 5,8 CT1: MS CT2: MS + 0,5 mg/l 2,4D CT3: MS + 0,75 mg/l 2,4D CT4: MS + 1 mg/l 2,4D CT5: MS + 1,5 mg/l 2,4D
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 18
Thắ nghiệm 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của picloram ựến sự hình thành callus từ ựỉnh sinh trưởng CT1: MS CT2: MS + 0,5 mg/l picloram CT3: MS + 0,75 mg/l picloram CT4: MS + 1 mg/l picloram CT5: MS + 1,5 mg/l picloram
Thắ nghiệm 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của ựường và chất ựiều tiết sinh trưởng ựến sự tạo chồi từ callus
đC: MS (MS + 30g saccarose/l)(đC1), pH = 5,8
CT1: MS1 (MS + 15g/l saccarose + 7,5 g/l glucose + 7,5g/l manitol) (đC2) CT2: MS1 + 0,5 mg/l BA
CT3: MS1 + 1,0 mg/l BA CT4: MS1 + 1,5 mg/l BA
Nghiên cứu môi trường nhân nhanh chồi
Thắ nghiệm 4. Ảnh hưởng của kinetin ựến sự nhân nhanh chồi CT1 (ự/c): MS
CT2: MS + 0,5mg/l kinetin CT3: MS + 1 mg/l kinetin CT4: MS + 1,5 mg/l kinetin CT5: MS + 2 mg/l kinetin.
Nghiên cứu môi trường ra rễ của cây tái sinh
Thắ nghiệm 5. Ảnh hưởng của IAA ựến sự ra rễ CT1(ự/c): MS
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 19 CT2: MS + 0,25 mg/l IAA
CT3: MS + 0,5 mg/l IAA
Thắ nghiệm 6. Ảnh hưởng của than hoạt tắnh (THT) ựến sự ra rễ CT1(ự/c): MS
CT2: MS + 0,5g/l THT CT3: MS + 1g/l THT
3.2.2. Xác ựịnh phương pháp xử lý colchicine in vitro thắch hợp trên cây hành đẻ
Thắ nghiệm 7. Ảnh hưởng của xử lý colchicine nồng ựộ thấp trong thời gian dài (6 tuần) ựến sự tái sinh chồi từ ựỉnh sinh trưởng (phương pháp 1)
Môi trường nền là MS + 0,75 BA + 0,5 IAA (MS0) (môi trường tái sinh chồi tốt nhất theo nghiên cứu của Phạm Thị Thu Trang, 2007)
CT1: MS0 + 0,001% colchicine CT2: MS0 + 0,002% colchicine CT3: MS0 + 0,003% colchicine CT4: MS0 + 0,004% colchicine
Thắ nghiệm 8. Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý colchicine nồng ựộ cao, thời gian ngắn ựến sự phát sinh hình thái của ựỉnh sinh trưởng (phương pháp 2)
đỉnh chồi sau khi ựược nuôi cấy 2 tuần trên môi trường có colchicine sẽ ựược cấy chuyển sang môi trường MS0 không có colchicine tiếp tục nuôi trong 4 tuần.
CT1: MS0 + 0,01% colchicine CT2: MS0 + 0,02% colchicine CT3: MS0 + 0,03% colchicine CT4: MS0 + 0,04% colchicine
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 20
Thắ nghiêm 9. Ảnh hưởng của nồng ựộ colchicine và thời gian lắc callus trong colchicine ựến sức sống và sự tái sinh chồi từ callus (phương pháp 3)
Nồng ựộ colchicine Thời gian xử lý 0,1 mg/l 0,2 mg/l 0.3 mg/l 0,4 mg/l 24h CT1 CT2 CT3 CT4 36h CT6 CT7 CT8 CT9 48h CT11 CT12 CT13 CT14
3.2.3.Bước ựầu ựánh giá ựộ bội của cây thu ựược sau xử lý colchicine
Cây tái sinh thu ựược sau xử lý colchicine ựược ựánh giá ựộ bội bằng phương pháp quan sát hình thái cây, quan sát hình thái và xác ựịnh kắch thước khắ khổng.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Quy trình kỹ thuật tách ựỉnh chồi - Bước 1: Chuẩn bị mẫu - Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Cắt các ựoạn thân sát gốc, tách bỏ rễ và các lá bao ở ngoài, kắch thước ựoạn cắt 1 Ờ 1,5cm. Rửa mẫu nhiều lần dưới vòi nước chảy, không cần rửa bằng xà phòng.
- Bước 2: Khử trùng mẫu
Mẫu trước khi tách ựược khử trùng bằng cồn 70o trong 1 phút, rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần sau ựó ựược lắc liên tục trong HgCl2 1% trong 10 phút rồi tiếp tục rửa lại bằng nước cất 3 lần.
- Bước 3: Tách ựỉnh chồi
đặt các ựoạn thân ựã khử trùng vào ựĩa petri vô trùng ựể trong tủ cấy. Dùng dao mũi mác ựã khử trùng và panh tách bỏ các lá bao ngoài chỉ ựể lại từ 1 Ờ 3 lá bao nguyên thuỷ trong cùng, sau ựó chuyển mẫu lên kắnh hiển vi.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 21 Dùng dao phẫu thuật ựể cắt ựỉnh chồi hình cầu với kắch thước 0,8 Ờ 1,2 mm và ựưa vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo ựã chuẩn bị sẵn.
3.3.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Sử dụng phương pháp nuôi cấy invitro trên môi trường cơ bản MS (Murahige&Skoog, 1962 với 6,2 Ờ 7g agar, 30 g/l saccarose và 100 mg/l inositol).
Các thắ nghiệm vào mẫu, nhân nhanh, và tạo cây hoàn chỉnh ựược nuôi cấy trong bình trụ miệng hẹp 250 ml hoặc ống nghiệm. Tất cả các môi trường nuôi cấy ựược ựiều chỉnh ựộ pH bằng 5,8 Ờ 6 trước khi tiệt trùng và ựược khử trùng ở 1200C, 1.4 atm trong thời gian 20 phút.
3.3.3. Phương pháp xử lý bằng colchicine
Colchicine khô ựược cân và pha bằng methanol 100% sau ựó lên thể tắch bằng nước cất. Dung dịch colchicine ựược khử trùng bằng màng lọc vô trùng (Millipore Sterivex GS: 0,22ộm), sau ựó ựược bổ sung trực tiếp vào các bình môi trường (khi môi trường vẫn còn lỏng Ờ khoảng 700C) ựã ựược hấp khử trùng Ờ ựối với thắ nghiệm nuôi cấy trực tiếp trên môi trường; và bổ sung vào nước cất ựã hấp khử trùng Ờ ựối với thắ nghiệm lắc callus (thể tắch bổ sung tùy theo nồng ựộ).
3.3.4. Phương pháp ựánh giá ựộ bội của chồi tái sinh
1. Quan sát hình thái cây tái sinh, ựo ựếm kắch thước lá, chiều cao, số chồi từ ựó bước ựầu xác ựịnh cây ựa bội.
2. Phương pháp quan sát khắ khổng
Lấy lá của các cây thu ựược sau xử lý colchicine sau ựó tách lấy một lớp mỏng trên mặt lá. đặt lớp mỏng lên lam kắnh nhỏ một giọt nước, ựậy lamen, thấm hết phần nước thừa. Chú ý ựậy lamen không ựể hình thành các bóng khắ.
đặt lam kắnh lên kắnh hiển vi quan sát ở vật kắnh 20 ựể tìm vị trắ ựánh giá tốt nhất sau ựó chuyển sang vật kắnh 40 ựể ựếm số lượng khắ khổng trong một
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 22 hiển vi trường và ựo kắch thước của khắ khổng (mỗi mẫu ựo, ựếm 3 lần ở các hiển vi trường khác nhau và lấy giá trị trung bình).
Kắch thước tế bào khắ khổng ựược ựo theo phương pháp của John William Henry Eyre (2009) như sau:
Bước 1. Xác ựịnh giá trị mỗi khoảng của thước ựo thị kắnh: Tháo thấu kắnh trên của thị kắnh ra, lắp thước ựo thị kắnh vào màn chắn của thị kắnh sao cho vạch chia nằm ở phắa dưới; dùng vật kắnh có bội giác nhỏ lấy tiêu cự và dịch thước ựo vào giữa thị trường, thay vật kắnh có bội giác lớn mà ta ựịnh dùng ựể ựo kắch thước tế bào; ựiều chỉnh bản kắnh sao cho
một vạch của 2 thước này trùng khắt lên nhau và tìm chỗ trùng khắt của vạch thứ 2, rồi xác ựịnh khoảng cách giữa 2 vạch của thước ựo thị kắnh bằng ộm. Qua quan sát ở ựộ phóng ựại 40x cho thấy khoảng cách giữa 2 vạch của thước ựo thị kắnh là 2,5ộm.
Bước 2. đo kắch thước: đặt tiêu bản có tế bào cần ựo lên bàn kắnh, ựiều chỉnh bàn kắnh sao cho thấy rõ tế bào và thước ựo thị kắnh; ựiều chỉnh bàn kắnh sao cho tế bào nằm gọn và dọc theo thước ựo thị kắnh; ựếm số khoảng mà tế bào choán chỗ; tắnh kết quả.
3.3.5. điều kiện thắ nghiệm
+ Ánh sáng: các mẫu ựều ựược nuôi cấy dưới ánh ựèn neon cường ựộ chiếu sáng 2000lux, thời gian chiếu sáng 16h sáng/ 8h tối.
+ Nhiệt ựộ: Duy trì ở nhiệt ựộ 20 Ờ 22oC (ựêm) và 25 Ờ 27oC (ngày). + độ ẩm phòng: Luôn ựược duy trì ở 70% ựộ ẩm tối ựa.
3.3.6. Bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm ựược bố trắ theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn CRD, mỗi công thức lặp lại 3 lần mỗi lần 10 mẫu.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 23
3.3.7. Phương pháp theo dõi
Theo dõi thắ nghiệm ựịnh kỳ 7 Ờ 15 ngày/lần (tùy theo yêu cầu của thắ nghiệm).
Chỉ tiêu theo dõi:
- Quan sát sự biến ựổi hình thái màu sắc của mô nuôi cấy. - Hình thái callus (nhỏ, to, xốp, mọng nước, vàng, nâuẦ.). - Tỷ lệ mẫu sống (%)
- Tỷ lệ mẫu tái sinh tạo chồi (%) - Tỷ lệ mẫu tái sinh tạo rễ (%) - Tỷ lệ tạo callus (%)
- Chiều cao chồi tái sinh (cm/chồi) - Số lá trên cây (lá/cây)
- Số lượng rễTB/mẫu (rễ) - Tỷ lệ mẫu biến dị
3.3.8. Xử lý số liệu
Số liệu ựược xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học sử dụng phần mềm IRRISTAT 5.0 (Phạm Tiến Dũng, 2002).
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 24
PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY HÀNH đẺ (Allium wakegi) TỪ CALLUS TỪ CALLUS
4.1.1. Ảnh hưởng của chất ựiều tiết sinh trưởng ựến sự hình thành callus từ ựỉnh sinh trưởng cây hành đẻ ựỉnh sinh trưởng cây hành đẻ
Auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo callus. Trong môi trường nuôi cấy, auxin thường gây ra sự tạo bướu ở các mô và cơ quan, kắch thắch sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo), kắch thắch sự tạo rễ bất ựịnh, gây ra sự phát sinh phôi từ tế bào soma hoặc từ các huyền phù tế bào (Pierik, 1987). Khi nồng ựộ auxin thấp thì sự tạo rễ bất ựịnh chiếm ưu thế, khi nồng ựộ auxin cao sẽ không có sự tạo rễ nhưng lại xảy ra sự tạo mô sẹo (callus) (Torres, 1989).
Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen (Torres, 1989). Sự tăng sinh của mô sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác ựộng của các chất ựiều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong môi trường nuôi cấy (Pal, Banerjee và Dhar, 1985). Do vậy, việc chọn lựa cơ quan ựể tiến hành xử lý tạo callus là rất quan trọng, ở thắ nghiệm này mẫu cấy là những ựỉnh sinh trưởng có kắch thước 0,8 Ờ 1,2 mm. đây là phần mô non nhất của cây, có khả năng cảm ứng và phản phân hóa mạnh ựồng thời trong mô nuôi cấy cũng có thể tồn tại một lượng auxin nội sinh khá cao nên mẫu cấy có khả năng tạo mô sẹo và lên chồi.
Trên ựối tượng hành tỏi, 2,4D và picloram ựã ựược sử dụng ựể cảm ứng tạo callus trên rất nhiều nguồn mẫu (ựỉnh chồi, mô lá ...) cũng như trên rất nhiều cây thuộc họ hành tỏi như A. sativum L, A. fistulosum, A. altaicum, A. galanthum, A. roylei ... (Phillips G. C., Luteyn K. J. (1983); Phillip G. C., Hubstenberger J. F. (1987); Havranek P., Novak F. J. (1993)).
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 25
4.1.1.1. Ảnh hưởng của 2,4 D ựến sự tạo thành callus từ ựỉnh sinh trưởng
đỉnh sinh trưởng cây hành đẻ ựược tách ở kắch thước 0,8 Ờ 1,2 mm và cấy chuyển vào môi trường MS có bổ sung 2,4 D ở các nồng ựộ 0,5 mg/l; 0,75 mg/l; 1 mg/l và 1,5 mg/l công thức ựối chứng là môi trường MS. Kết quả thắ nghiệm ựược thể hiện ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của 2,4D ựến sự tạo thành callus từ ựỉnh sinh trưởng sau 6 tuần nuôi cấy
Kắch thước callus (%) Công thức Nồng ựộ 2,4D (mg/l) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chồi (%) Tỷ lệ callus (%) To (≥ 1 cm) Trung bình (0.5-1 cm) Nhỏ (≤ 0.5 cm) MS 0 53,3 50 3,3 0 100 0 CT1 0,5 90,12 0 100 0 0 100 CT2 0,75 75,34 0 100 0 0 100 CT3 1 60,00 0 100 0 0 100 CT4 1,5 57,13 0 100 0 25,00 75,00
Kết quả thắ nghiệm cho thấy 2,4D có ảnh hưởng ựến sức sống của mẫu cấy, khi tăng nồng ựộ 2,4D tỷ lệ sống của mẫu giảm dần. đặc biệt 2,4D ức chế hoàn toàn quá trình bật chồi của mẫu, 100% mẫu cấy trên môi trường có bổ sung 2,4D chỉ hình thành callus.
Callus tạo thành trên môi trường có bổ sung 2,4D có màu trắng ựến vàng
nhạt, sần sùi và chủ yếu có kắch thước nhỏ (≤ 0.5 cm). Nồngựộ 2,4D tốt nhất cho sự tạo thành callus là 1.5 mg/l.
Hình 4.1. Callus tạo thành trên môi trường 2,4D
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 26
4.1.1.2. Ảnh hưởng của picloram ựến sự tạo thành callus từ ựỉnh sinh trưởng
đỉnh sinh trưởng cây hành đẻ ựược tách ở kắch thước 0,8 Ờ 1,2 mm và cấy chuyển vào môi trường MS có bổ sung picloram ở các nồng ựộ 0,5 mg/l; 0,75 mg/l; 1 mg/l và 1,5 mg/l công thức ựối chứng là môi trường MS. Kết quả thắ nghiệm ựược thể hiện ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của picloram ựến sự tạo thành callus từ ựỉnh chồi sau 6 tuần nuôi cấy
Kắch thước callus (%) Công thức Nồng ựộ picloram (mg/l) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chồi (%) Tỷ lệ callus (%) To (≥ 1 cm) Trung bình (0.5-1 cm) Nhỏ (≤ 0.5 cm) đC 0 53,3 50,00 3,30 0 100 0 CT1 0,5 92,16 9,68 100 0 19,15 80,85 CT2 0,75 77,50 11,53 100 0 16,13 83,87 CT3 1 57,14 0 100 0 25,00 75,00 CT4 1,5 40,00 0 100 25,00 16,67 58,33
Picloram có ảnh hưởng mạnh mẽ ựến tỷ lệ sống của mẫu cấy, khi tăng nồng ựộ picloram tỷ lệ sống của mẫu cấy
giảm dần.
Khác với 2,4D - ức chế hoàn toàn quá trình hình thành chồi của mẫu cấy, trên môi trường bổ sung picloram ở nồng ựộ thấp 0,5 Ờ 0,75 mg/l có một tỷ lệ nhỏ mẫu cấy hình thành chồi.
Callus hình thành trên môi trường
bổ sung picloram rắn chắc, có màu vàng sáng có khả năng phát sinh chồi cao khi
Hình 4.2. Callus hình thành trên môi trường bổ sung picloram
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 27 cấy chuyển sang môi trường tạo chồi. Callus tạo thành chủ yếu vẫn có kắch thước nhỏ (≤ 0.5 cm). Nồng ựộ picloram có ảnh hưởng ựến kắch thước của callus, khi tăng nồng ựộ picloram, tỷ lệ callus có kắch thước trung bình và to cũng tăng lên (từ 19,5% ở CT1 ựến 41,67% ở CT4). Ở nồng ựộ picloram bổ sung vào môi trường là 1,5mg/l cho tỷ lệ callus trung bình và to là cao nhất ựây là công thức tốt nhất cho sự tạo thành callus từ ựỉnh sinh trưởng.
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Phillips G. C., Luteyn K. J. (1983) và Phillip G. C., Hubstenberger J. F. (1987) cho thấy picloram là một nguồn auxin rất phù hợp cho việc tạo callus từ nuôi cấy ựỉnh chồi trên hành và các cây họ hành tỏi như (A. fistulosum, A. altaicum, A. galanthum và A. roylei).
4.1.2. Ảnh hưởng của ựường và chất ựiều tiết sinh trưởng ựến sự phát sinh chồi từ callus chồi từ callus
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ựường thường ựược bổ sung vào môi trường nuôi cấy ựể cung cấp dưỡng chất cho mô và cây sinh trưởng và phát triển vì trong quá trình nuôi cấy mô và cây không có quá trình quang hợp hoặc quang
Ghi chú: đ/C: MS
CT1: MS + 0,5 mg/l picloram CT2: MS + 0,75 mg/l picloram
CT3: MS + 1 mg/l picloram CT4: MS + 1,5 mg/l picloram
Hình 4.3. Ảnh hưởng của picloram ựến sự phát sinh callus
CT2 CT3 CT4
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 28 hợp xảy ra rất ắt (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2009). Vì vậy việc bổ sung ựường vào môi trường nuôi cấy là rất quan trọng trong quá trình nuôi cấy mô.
Theo nghiên cứu của Ruby Thapa và cộng sự, 2007 trên lúa các loại ựường sucrose, glucose, maltose và nồng ựộ ựường khác nhau có ảnh hưởng khác nhau ựến khả năng tạo chồi của mẫu cấy. Bổ sung ựường glucose vào môi trường nuôi cấy cho kết quả tái sinh cây và phát sinh rễ tốt hơn so với ựường sucrose và maltose. Chiều cao chồi và chiều dài rễ ựạt cao nhất ở nồng ựộ ựường là 0,25%.
Nghiên cứu trên ngô của DP Gauchan, 2012 cho thấy khi bổ sung ựường maltose và sucrose ở nồng ựộ thấp (0,25 Ờ 2,5%) cho kết quả phát sinh chồi và tạo rễ của mẫu là cao nhất.
Theo Nguyễn Thị Thanh Phương và cộng sự (2010), nuôi cấy callus tỏi trên môi trường MS bổ sung 3 loại ựường sucrose, glucose, maltose và BA cho hiệu quả tái sinh chồi tỏi cao hơn so với nuôi cấy trên môi trường MS chỉ bổ sung sucrose.