Phương pháp lắc callus trong môi trường lỏng có bổ sung colchicine ựã ựược áp dụng ựể tạo ựa bội hóa trên rất nhiều ựối tượng như: hoa cẩm chướng, dưa hấu, ựồng tiền, cam quýt,Ầ. (Nguyễn Thị Lý Anh và cộng sự, 2011). Trên giống hành là con lai F1 giữa Allium fistulosum x A. cepa, tác giả Ping Song và cộng sự ựã tiến hành xử lý colchicine ở các nồng ựộ và thời gian khác nhau ựối với callus tái sinh. Callus ựược xử lý với 0,1 hoặc 0,2% colchicine trên môi trường BDS trong 48 ựến 72h cho kết quả ựa bội cao nhất.
Tác giả Zhang Shuxin và cộng sự ựã nghiên cứu về tác dụng của colchicine tạo cảm ứng ựa bội trên callus của giống hành Trung Quốc cho thấy nồng ựộ colchicine 0,06% trong 72h cho hiệu quả cảm ứng ựa bội tốt nhất. Tỷ lệ callus cảm ứng cao và callus không bị tổn hại nhiều. Từ callus ựã tái sinh ựược cây ựa bội hoàn chỉnh có sự sai khác có ý nghĩa về hình thái so với cây nhị bội (lá dày, thô hơn, khắ khổng to hơn).
Callus ựã phát sinh chồi thu ựược từ thắ nghiệm trên ựược lắc trong nước cất có bổ sung colchicine ở các nồng ựộ 0,1 ựến 0,4% ở các mốc thời gian 24h, 36h và 48h sau ựó cấy chuyển sang môi trường MS rắn. Kết quả thắ nghiệm sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS ựược thể hiện ở bảng 4.9, 4.10, 4.11.
Bảng 4.9. Ảnh hưởng của colchicine ựến sức sống và khả năng phát sinh chồi của callus khi lắc trong 24h Ờ sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS
Công thức Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ phát sinh chồi (%) Số lượng chồi TB/mẫu (chồi) Chiều cao TB/chồi (cm) CT1 Ờ 0,1% 66,67 60,00 2,75 3,61 CT2 Ờ 0,2% 45,83 36,36 2,25 1,85 CT3 Ờ 0,3% 14,28 0 - - CT4 Ờ 0,4% 8,33 0 - -
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 43 Kết quả thắ nghiệm cho thấy, nồng ựộ colchicine có ảnh hưởng mạnh mẽ ựến sức sống và khả năng phát sinh chồi hoàn chỉnh (chồi có thân, lá) của callus. Khi tăng nồng ựộ colchicine tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi giảm dần, ở nồng ựộ 0,4% colchicine mẫu chết 91.67%, từ nồng ựộ 0,3% trở lên mẫu không phát sinh ựược chồi hoàn chỉnh mà chỉ ở dạng callus và chết dần. Như vậy, ở mốc thời gian xử lý 24h nồng ựộ colchicine gây chết 50% mẫu là ≈ 0,2%.
Không có sự sai khác nhiều ở chỉ tiêu số lượng chồi TB/mẫu ở công thức 1 và công thức 2, tuy nhiên chiều cao chồi tạo thành ở công thức 1 lại cao hơn hẳn so với công thức 2 (3,61>>1,85).
Kết quả thắ nghiệm ở bảng 4.10 cho thấy khi tăng thời gian xử lý colchicine (36h), tỷ lệ chết của mẫu tăng so với xử lý ở 24h. Nồng ựộ colchicine càng cao tỷ lệ mẫu sống và mẫu tạo chồi càng giảm (ở CT9 mẫu chết 100%).
Bảng 4.10. Ảnh hưởng của colchicine ựến sức sống và khả năng phát sinh chồi của callus khi lắc trong 36h Ờ sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS
Công thức Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ phát sinh chồi (%) Số lượng chồi TB/mẫu (chồi) Chiều cao TB/chồi (cm) CT6 Ờ 0,1% 63,10 41,20 2,13 1,42 CT7 Ờ 0,2% 28,12 22,22 1,50 1,90 CT8 Ờ 0,3% 6,25 0 - - CT9 Ờ 0,4% 0 - - -
Khi tăng nồng ựộ colchicine số lượng chồi TB/mẫu giảm mạnh (từ 2,13 chồi TB/mẫu ở CT6 chỉ còn 1,5 chồi TB/mẫu ở CT7), nhưng chiều cao TB chồi lại tăng (từ 1,42 cm ở CT6 thành 1,9 cm ở CT7).
Ở thời gian xử lý dài nhất 48h, tỷ lệ sống của mẫu là thấp nhất, ở các nồng ựộ 0,3% - 0,4% toàn bộ mẫu ựều chết. Tỷ lệ phát sinh chồi của mẫu cũng giảm mạnh (chỉ còn 15,1% ở nồng ựộ 0,1% và 11,67% ở nồng ựộ 0,2%).
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 44
Bảng 4.11. Ảnh hưởng của colchicine ựến sức sống và khả năng tái sinh chồi của callus khi lắc trong 48h Ờ sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS Công thức Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ phát sinh chồi (%) Số lượng chồi TB/mẫu (chồi) Chiều cao TB/chồi (cm) CT11 Ờ 0,1% 60,00 15,10 2,50 1,50 CT12 Ờ 0,2% 13,33 11,67 1,80 0,68 CT13 Ờ 0,3% 0 - - - CT14 Ờ 0,4% 0 - - -
Chỉ tiêu số lượng chồi TB/mẫu và chiều cao chồi TB/mẫu cũng giảm khi tăng nồng ựộ colcicine từ 0,1 Ờ 0,2%. Như vậy, trong thời gian xử lý dài (48h) sự chênh lệch nồng ựộ thấp (0,1 và 0,2%) cũng làm ảnh hưởng ựến số lượng chồi TB/mẫu và chiều cao chồi tạo thành.
Hình 4.10. Ảnh hưởng của nồng ựộ colchicine ựến sức sống và khả năng phát sinh chồi từ callus trong thời gian lắc 24h
Ghi chú: CT1: MS0 + 0,1% colchicine CT2: MS0 + 0,2% colchicine
CT3: MS0 + 0,3% colchicine CT4: MS0 + 0,4% colchicine
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 45
Hình 4.11. Ảnh hưởng của nồng ựộ colchicine ựến sức sống và khả năng phát sinh chồi từ callus trong thời gian lắc 36h
Ghi chú: CT6: MS0 + 0,1% colchicine CT7: MS0 + 0,2% colchicine
CT8: MS0 + 0,3% colchicine CT9: MS0 + 0,4% colchicine
Hình 4.12. Ảnh hưởng của nồng ựộ colchicine ựến sức sống và khả năng phát sinh chồi từ callus trong thời gian lắc 48h
Ghi chú: CT11: MS0 + 0,1% colchicine CT12: MS0 + 0,2% colchicine
CT13: MS0 + 0,3% colchicine CT14: MS0 + 0,4% colchicine
Kết quả so sánh tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi giữa 3 mốc thời gian xử lý 24h, 36h và 48h ựược thể hiện ở hình 4.15 và hình 4.16.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 46
Hình 4.13. So sánh tỷ lệ mẫu sống khi lắc callus trong 24h, 36h và 48h
Khi tăng thời gian xử lý tỷ lệ mẫu sống giảm dần, ở nồng ựộ càng cao tỷ lệ mẫu sống càng giảm mạnh. Ở nồng ựộ 0,1% tỷ lệ mẫu sống chênh lệch khá ắt giữa các mốc thời gian xử lý khác nhau (≈ 3%), nhưng từ nồng ựộ 0,2% ựến 0,4% tỷ lệ sống giảm mạnh (>>50%) khi tăng thời gian xử lý. Như vậy, thời gian xử lý colchicine ựể tỷ lệ mẫu chết 50% ở nồng ựộ 0,1% là ≈ 48h, nồng ựộ 0,2% là ≈ 24h.
Hình 4.14. So sánh tỷ lệ mẫu phát sinh chồi khi lắc callus trong 24h, 36h và 48h
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 47 Thời gian xử lý mẫu tăng làm giảm tỷ lệ mẫu phát sinh chồi (ở nồng ựộ 0.1% từ 60% ở 24h còn 15,1% ở 48h; nồng ựộ 0,2% từ 36,36% ở 24h còn 11,11% ở 48h). Ở nồng ựộ xử lý từ 0,3% trở lên colchicine ức chế hoàn toàn quá trình phát sinh chồi của callus ở cả 3 mốc thời gian. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Callus và chồi thu ựược sau xử lý colchicine ựược cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi và nhân nhanh chồi tốt nhất. Cây tái sinh ựược ựánh giá ựộ bội bằng các phương pháp quan sát hình thái và quan sát tế bào khắ khổng.