Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh và chuyển gen sử dụng agrobacterium tumefaciens cho đối tượng cây bạch đàn urô (eucalyptus urophylla)

Bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) là một trong những loài bạch đàn chính được trồng chủ yếu ở Việt Nam. Đây cũng là loài cây chủ lực trong dự án trồng mới 5 triệu hecta rừng đã được triển khai trong cả nước giai đoạn 1998 2010. Các nghiên cứu về tỷ trọng gỗ, hàm lượng xenlulozo, chiều dài sợi gỗ, ... đã được thực hiện, kết quả thu được cho thấy các tính trạng sinh trưởng và chất lượng gỗ ảnh hưởng lớn đến hiệu suất bột giấy cho ngành công nghiệp giấy. Các đánh giá về sinh trưởng của bạch đàn Urô tại Việt Nam cũng cho thấy tỷ lệ sinh trưởng của bạch đàn Urô tại Việt Nam chậm hơn so với các nước khác như Trung Quốc, Brazil (Santos, 1990; Wei Borralho, 1998a; Nguyễn Đức Kiên, 2009). Vì vậy, các chương trình chọn giống bạch đàn ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào tăng khả năng sinh trưởng, cải thiện chất lượng gỗ và tăng sức chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi. Hiện nay, diện tích rừng tự nhiên ngày càng bị thu hẹp do nạn khai thác bừa bãi, đất đai bị hoang hóa và tác động tiêu cực gây ra bởi biến đổi khí hậu. Trong khi nhu cầu nguyên liệu cho ngành chế biến gỗ và công nghệ bột giấy đang dần gia tăng và tương lai có thể thiếu hụt trầm trọng nếu không có những giải pháp cụ thể và tích cực. Do đó, vấn đề cải thiện giống cây trồng lấy gỗ phục vụ ngành chế biến gỗ và công nghệ bột giấy đang là vấn đề cấp bách. Công nghệ gen là một giải pháp quan trọng và rất hữu hiệu trong trường hợp này. Thông qua việc sử dụng các kĩ thuật trong công nghệ gen cho phép tạo ra những giống cây trồng mới; đột phá về năng suất, chất lượng cũng như khả năng chống chịu. Không những thế cây trồng tạo ra từ công nghệ gen có nhiều đặc tính ưu việt mà cây trồng hoang dại ban đầu không có được. Để chuyển thành công các gen có giá trị vào cây bạch đàn Urô cần phải có một quy trình tái sinh cây hiệu quả cao từ mô sẹo thông qua tạo đa chồi trực tiếp hoặc tạo phôi soma. Quy trình tái sinh cây một số loài bạch đàn phục vụ chuyển gen đã được các nhà khoa học đầu tư nghiên cứu: Bandyopadhyay và cs (1999) đã tiến hành nghiên cứu tái sinh thành công hai loài bạch đàn E. nitens và E. globules từ vật liệu là mảnh cấy của cây mầm; Cid và cs (1999) đã tiến hành nghiên cứu tái sinh loài bạch đàn lai E. grandis x E. urophylla từ vật liệu cuống lá cây mầm; nghiên cứu tái sinh loài bạch đàn E. tereticornis thông qua phôi soma cũng đã được Parakash và cs (2005) công bố. Dibax và cs (2010) nghiên cứu tái sinh loài bạch đàn E. cammaldulensis Dehn; Huang và cs (2010) đã nghiên cứu thành công quy trình tái sinh loài bạch đàn Eucalyptus urophylla từ đỉnh thân mầm. Cho đến nay, nhiều loài bạch đàn đã được nghiên cứu tái sinh thành công thông qua tạo đa chồi hoặc phôi soma từ các vật liệu là mảnh lá, thân cây mầm. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu thu được cho thấy ở mỗi loài bạch đàn, thậm chí ở các dòng trong cùng một loài thì khả năng tái sinh là rất khác nhau (Ho và cs, 1998; Parthiban và cs, 1999; Dibax và cs, 2005; Hajari và cs, 2006; Gonzales và cs, 2002; Tournier và cs, 2003; Alves và cs, 2004). Trên cơ sở các quy trình tái sinh, một số quy trình chuyển gen vào nhiều loài bạch đàn cũng đã được các nhà khoa học xây dựng thành công bằng việc chuyển các gen chỉ thị, gen chọn lọc và đang áp dụng hiệu quả để chuyển các gen có giá trị. Tetsukawazu và cs (2003) đã được cấp bằng sáng chế về quy trình chuyển gen gus vào loài bạch đàn E. camaldulensis, E. globulus, E. grandis, E. grandis x E. urophylla và E. urophylla từ các mẫu cấy sinh dưỡng lấy từ cây bạch đàn trưởng thành; Chang và cs (2006) cũng đã được cấp bằng sáng chế về quy trình chuyển gen và chọn lọc cây chuyển gen cho loài bạch đàn E. urophylla. Các kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng các dòng bạch đàn E. urophylla khác nhau cho hiệu suất chuyển gen khác nhau. Điều này cho thấy để chuyển gen hiệu quả vào từng loài bạch đàn và từng dòng bạch đàn cụ thể cần có một quy trình thích hợp. Xuất phát từ cơ sở trên tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh và chuyển gen sử dụng Agrobacterium tumefaciens cho đối tượng cây bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla)” nhằm cung cấp cơ sở cho việc tạo giống bạch đàn Urô biến đổi gen sinh trưởng nhanh.

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN Error! Bookmark not defined MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Mục tiêu Ý nghĩa đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Tổng quan bạch đàn nói chung bạch đàn Urơ nói riêng 1.2 Tình hình trồng bạch đàn Urô Việt Nam 1.3 Năng suất bạch đàn Urô Việt Nam 1.4 Các hướng cải thiện giống bạch đàn ứng dụng Công nghệ sinh học 1.4.1 Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro bạch đàn 1.4.2 Nghiên cứu chuyển gen vào bạch đàn 1.4.3 Nghiên cứu phát triển sử dụng thị phân tử chọn tạo lai giống 11 1.4.4 Nghiên cứu thành lập ngân hàng cDNA giải trình tự hệ genome loài bạch đàn12 1.5 Các hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen 12 1.5.1 Hệ thống tái sinh thông qua tạo đa chồi trực tiếp từ mẫu cấy phục vụ chuyển gen 13 1.5.2 Hệ thống tái sinh thông qua mô sẹo 13 1.5.3 Hệ thống tái sinh thông qua tạo phôi soma .14 1.6 Kỹ thuật chuyển gen thực vật 15 1.6.1 Giới thiệu vi khuẩn A tumefaciens .15 1.6.2 Cấu trúc Ti - plasmid T - DNA .16 1.6.3 Các loại vector dùng chuyển gen vào thực vật 16 1.6.4 Cơ chế trình chuyển T - DNA vào tế bào thực vật 18 1.7 Thành tựu nghiên cứu tạo giống bạch đàn chuyển gen 21 1.7.1 Trên giới 21 1.7.2 Tại Việt Nam 27 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .28 2.1 Vật liệu nghiên cứu 28 2.1.1 Vật liệu thực vật .28 2.1.2 Vật liệu di truyền chủng vi khuẩn 28 2.2 Nội dung nghiên cứu 28 i 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Nuôi cấy mô 29 2.3.2 Chuyển gen vào bạch đàn Urô thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 31 2.3.3 Phân tích thể nhận gen, mô sẹo, chồi chuyển gen phương pháp hóa sinh 33 2.3.4 Phân tích chồi, chuyển gen phương pháp phân tử 33 2.3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm .34 2.3.6 Các tiêu theo dõi .35 2.3.7 Xử lý số liệu 35 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Kết xây dựng quy trình tái sinh bạch đàn Urơ thơng qua mô sẹo .36 3.1.1 Ảnh hưởng BAP NAA đến khả tạo mô sẹo .37 3.1.2 Ảnh hưởng BAP, NAA Kinetin đến khả tạo chồi từ mô sẹo 40 3.1.3 Ảnh hưởng tổ hợp NAA IBA đến khả rễ 43 3.2 Chuyển gen gus plus vào bạch đàn Urô thông qua Agrobacterium tumefaciens 47 3.2.1 Xác định ngưỡng nồng độ chất chọn lọc kanamycin .47 3.2.2 Ảnh hưởng thời gian tiền nuôi cấy tới khả biến nạp gen 51 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn tới khả biến nạp gen 53 3.2.4 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy tới khả biến nạp gen 55 3.2.5 Ảnh hưởng chủng Agrobacterium tumefaciens đến khả biến nạp gen 57 3.2.6 Ảnh hưởng nguồn mẫu tới khả biến nạp gen 58 3.3 Chuyển gen GA20 vào bạch đàn Urô thông qua Agrobacterium tumefaciens 63 3.3.1 Đánh giá khả tái sinh chồi sau chuyển gen 63 3.3.2 Đánh giá khả rễ kiểm tra PCR cho chồi sau chuyển gen 65 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 4.1 Kết luận 68 4.1.1 Xây dựng quy trình tái sinh bạch đàn Urơ thơng qua mô sẹo 68 4.1.2 Xây dựng quy trình chuyển gen gus plus vào bạch đàn Urô .68 4.1.3 Kết chuyển gen GA20 vào bạch đàn Urô 69 4.2 Kiến nghị 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC 78 ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AS : Acetosyringone BAP : - Benzylaminopurine ĐC : Đối chứng GA : Gibberellin IAA : Indole - acetic acid IBA : Indole - butyric acid MS : Murashige Skoog (1962) NAA :  - naphthaleneacetic acid ND : Nước dừa cs : Cộng iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số trồng chuyển gen sử dụng hệ thống tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo 13 Bảng 1.2 Một số trồng chuyển gen sử dụng hệ thống tái sinh qua tạo phôi soma 14 Bảng 1.3 Danh sách nghiên cứu chuyển gen đối tượng Eucalyptus 23 Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn A.tumefaciens .32 Bảng 2.2: Thành phần dung dịch đệm tách chiết 33 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nhân gen GA20 .34 Bảng 3.1 Ảnh hưởng tổ hợp BAP NAA đến khả tạo mô sẹo 38 Bảng 3.2 Ảnh hưởng tổ hợp BAP, NAA Kinetin 40 Bảng 3.3 Ảnh hưởng tổ hợp NAA IBA tới hiệu rễ 44 Bảng 3.4 Ảnh hưởng kanamycin tới khả sống 48 Bảng 3.5 Ảnh hưởng kanacycin đến khả rễ bạch đàn Urô 50 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian tiền nuôi cấy đến khả biến nạp gen 52 Bảng 3.7 Ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn đến khả biến nạp gen 54 Bảng 3.8 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả biến nạp gen .55 Bảng 3.9 Ảnh hưởng chủng A.tumefaciens đến khả biến nạp gen 57 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nguồn mẫu đến hiệu chuyển gen 59 Bảng 3.11 Khả tái sinh mẫu chuyển gen 64 Bảng 3.12 Kết kiểm tra khả rễ chồi sau chuyển gen .66 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Rừng bạch đàn Urô Brazil Hình 1.2 Vai trò GA20 tổng hợp GA dạng hoạt động 10 Hình 1.3 Cấu tạo phân tử Ti - plasmid 16 Hình 1.4 Hệ thống vectơ liên hợp 17 Hình 1.5 Hệ thống vectơ nhị thể 17 Hình 1.6 Cơ chế lây nhiễm A tumefaciens vào tế bào thực vật .20 Hình 2.1 pBI121 chứa gen gus (+) 28 Hình 2.2 pBI121 chứa gen GA20 28 Hình 3.1 Các loại mơ sẹo bạch đàn Urô 39 Hình 3.2 Chồi tái sinh từ mơ sẹo mơi trường C1 41 Hình 3.3 Chồi tái sinh công thức môi trường .42 Hình 3.4 Chồi tái sinh từ mô sẹo môi trường C1 (e) mơi trường C4 (f) 43 Hình 3.5 Chồi rễ môi trường 45 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ kanamycin đến sức sống thân mầm .50 Hình 3.7 Biểu gen gus mẫu thí nghiệm 61 Hình 3.8 Chồi chuyển gen gus plus 61 Hình 3.9 Chồi chuyển gen GA20 tái sinh môi trường chứa Km 150 .65 Hình 3.10 Cây chuyển gen GA20 mơi trường rễ 66 Hình 3.11 Cây chuyển gen trồng nhà lưới 67 Hình 3.12 Kết kiểm tra có mặt gen GA20 .67 v MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) lồi bạch đàn trồng chủ yếu Việt Nam Đây loài chủ lực dự án trồng triệu hecta rừng triển khai nước giai đoạn 1998 2010 Các nghiên cứu tỷ trọng gỗ, hàm lượng xenlulozo, chiều dài sợi gỗ, thực hiện, kết thu cho thấy tính trạng sinh trưởng chất lượng gỗ ảnh hưởng lớn đến hiệu suất bột giấy cho ngành công nghiệp giấy Các đánh giá sinh trưởng bạch đàn Urô Việt Nam cho thấy tỷ lệ sinh trưởng bạch đàn Urô Việt Nam chậm so với nước khác Trung Quốc, Brazil (Santos, 1990; Wei & Borralho, 1998a; Nguyễn Đức Kiên, 2009) Vì vậy, chương trình chọn giống bạch đàn Việt Nam tập trung chủ yếu vào tăng khả sinh trưởng, cải thiện chất lượng gỗ tăng sức chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi Hiện nay, diện tích rừng tự nhiên ngày bị thu hẹp nạn khai thác bừa bãi, đất đai bị hoang hóa tác động tiêu cực gây biến đổi khí hậu Trong nhu cầu nguyên liệu cho ngành chế biến gỗ công nghệ bột giấy dần gia tăng tương lai thiếu hụt trầm trọng khơng có giải pháp cụ thể tích cực Do đó, vấn đề cải thiện giống trồng lấy gỗ phục vụ ngành chế biến gỗ công nghệ bột giấy vấn đề cấp bách Công nghệ gen giải pháp quan trọng hữu hiệu trường hợp Thông qua việc sử dụng kĩ thuật công nghệ gen cho phép tạo giống trồng mới; đột phá suất, chất lượng khả chống chịu Không trồng tạo từ cơng nghệ gen có nhiều đặc tính ưu việt mà trồng hoang dại ban đầu khơng có Để chuyển thành cơng gen có giá trị vào bạch đàn Urơ cần phải có quy trình tái sinh hiệu cao từ mô sẹo thông qua tạo đa chồi trực tiếp tạo phôi soma Quy trình tái sinh số lồi bạch đàn phục vụ chuyển gen nhà khoa học đầu tư nghiên cứu: Bandyopadhyay cs (1999) tiến hành nghiên cứu tái sinh thành cơng hai lồi bạch đàn E nitens E globules từ vật liệu mảnh cấy mầm; Cid cs (1999) tiến hành nghiên cứu tái sinh loài bạch đàn lai E grandis x E urophylla từ vật liệu cuống mầm; nghiên cứu tái sinh loài bạch đàn E tereticornis thông qua phôi soma Parakash cs (2005) công bố Dibax cs (2010) nghiên cứu tái sinh loài bạch đàn E cammaldulensis Dehn; Huang cs (2010) nghiên cứu thành cơng quy trình tái sinh loài bạch đàn Eucalyptus urophylla từ đỉnh thân mầm Cho đến nay, nhiều loài bạch đàn nghiên cứu tái sinh thành công thông qua tạo đa chồi phôi soma từ vật liệu mảnh lá, thân mầm Tuy nhiên, kết nghiên cứu thu cho thấy loài bạch đàn, chí dòng lồi khả tái sinh khác (Ho cs, 1998; Parthiban cs, 1999; Dibax cs, 2005; Hajari cs, 2006; Gonzales cs, 2002; Tournier cs, 2003; Alves cs, 2004) Trên sở quy trình tái sinh, số quy trình chuyển gen vào nhiều loài bạch đàn nhà khoa học xây dựng thành công việc chuyển gen thị, gen chọn lọc áp dụng hiệu để chuyển gen có giá trị Tetsukawazu cs (2003) cấp sáng chế quy trình chuyển gen gus vào lồi bạch đàn E camaldulensis, E globulus, E grandis, E grandis x E urophylla E urophylla từ mẫu cấy sinh dưỡng lấy từ bạch đàn trưởng thành; Chang cs (2006) cấp sáng chế quy trình chuyển gen chọn lọc chuyển gen cho loài bạch đàn E urophylla Các kết nghiên cứu cho thấy sử dụng dòng bạch đàn E urophylla khác cho hiệu suất chuyển gen khác Điều cho thấy để chuyển gen hiệu vào loài bạch đàn dòng bạch đàn cụ thể cần có quy trình thích hợp Xuất phát từ sở thực đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh chuyển gen sử dụng Agrobacterium tumefaciens cho đối tượng bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla)” nhằm cung cấp sở cho việc tạo giống bạch đàn Urô biến đổi gen sinh trưởng nhanh Mục tiêu - Nghiên cứu, xây dựng quy trình tái sinh bạch đàn Urô thông qua mô sẹo; - Nghiên cứu, xây dựng quy trình chuyển gen vào bạch đàn Urô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Ý nghĩa đề tài Ý nghĩa khoa học: Kết nghiên cứu đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học có giá trị khả tạo bạch đàn Urô biến đổi gen, sinh trưởng nhanh Việt Nam Kết nghiên cứu đề tài tài liệu tham khảo cho việc giảng dạy phương pháp chuyển gen gián tiếp bạch đàn Ý nghĩa thực tiễn: Xây dựng thành cơng quy trình chuyển gen bạch đàn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm sở cho việc tạo giống bạch đàn biến đổi gen sinh trưởng nhanh Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bạch đàn nói chung bạch đàn Urơ nói riêng Bạch đàn (Eucalyptus) chi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae), Sim (Myrtaces), phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp hai mầm (Dicotyledone) Tên bạch đàn Eucalyptus lần nhà thực vật học người Pháp Charles Louis L’Heritier de Brutelle đặt cho vào năm 1788 Từ đến có tới 600 lồi biến chủng mơ tả đặt tên, gần 500 lồi chấp nhận thức Theo Boland cs (1987), Eldridge cs (1993) chi bạch đàn chia làm chi phụ Trong đó, chi phụ Symphyomyrtus có nhiều loài sử dụng vào trồng rừng đại trà, như: Loài E camaldulensis, E urophylla, E tereticornis, E grandis… Bạch đàn có xuất xứ từ Ơxtrâylia có lồi bạch đàn phân bố ngồi Ơxtrâylia lồi E deglupta Blume E urophylla S.T Blake Cho đến nay, bạch đàn gây trồng phổ biến khắp nơi giới, đặc biệt quốc gia vùng nhiệt đới, ôn đới, như: Brazil, Trung Quốc, Ấn độ, Việt Nam, (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2000) Bạch đàn loài thân gỗ lâu năm, mọc nhanh, trồng - năm tuổi thường có chiều cao m đường kính thân khoảng - 10 cm bạch đàn có chế tự bảo vệ nhờ quan mặt đất gọi “củ gỗ” chế phát triển nhanh nhờ chồi bất định búp phụ, có khả thích nghi cao với nhiều loại lập địa khí hậu Gỗ bạch đàn coi nguồn cung cấp ngun liệu cho ngành cơng nghiệp sản xuất giấy gỗ bạch đàn có thành phần hóa học cấu tạo sợi thích hợp cho sản xuất bột giấy Mỗi năm giới có hàng triệu bột giấy sản xuất từ gỗ bạch đàn Bên cạch đó, gỗ bạch đàn sử dụng làm đồ mộc, sản phẩm thủ công mỹ nghệ, sản xuất ván dăm, ván sợi xuất khẩu, gỗ xây dựng, cột chống,… Ngoài ra, số lồi bạch đàn sử dụng để tách chiết tinh dầu, tanin chế biến dược phẩm Trên giới, bạch đàn trồng rừng sản xuất với diện tích ngày mở rộng Theo số liệu công bố vào năm 1993 rừng trồng bạch đàn năm 1990 đạt khoảng 10 triệu hecta châu lớn châu Phi, châu Mỹ châu Á Thái Bình Dương, chiếm tới 23% tổng diện tích rừng trồng Brazil nước có diện tích rừng trồng bạch đàn lớn giới, năm 1993 ước tính có khoảng triệu hecta (Nguyễn Hồng Nghĩa, 2000) Ở Việt Nam, bạch đàn người Pháp đưa vào gây trồng từ trước năm 1945, song việc gây trồng bạch đàn quy mô lớn năm 1960 (Bùi Thị Huế, 1996) Trong thời gian ngắn, bạch đàn phát triển mạnh mẽ trở thành số loài lâm nghiệp trồng rừng quan trọng nước ta Thực tế trồng rừng Việt Nam cho thấy, hầu hết vùng quy hoạch để trồng rừng vùng đất trống bạc màu đồi trọc nghèo dinh dưỡng mà suất trồng giảm mạnh sinh trưởng chậm kéo dài luân kỳ khai thác Do đó, việc nghiên cứu cải thiện giống lâm nghiệp với đặc tính sinh trưởng nhanh đất bạc màu Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn trọng.Việc nghiên cứu chọn tạo giống bạch đàn sinh trưởng nhanh vùng đất nghèo dinh dưỡng định đến việc nâng cao suất rừng trồng bạch đàn, mang lại giá trị kinh tế ổn định bền vững cho người dân trồng rừng Giống bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) Bạch đàn Urô (E urophylla) có nguyên sản Indonesia (tập trung số đảo Flores, Adona, Pantar Timor), phân bố từ 7030 - 100 vĩ Nam 1220 1270 kinh Đông dốc núi thung lũng, loại đất bazan, diệp thạch phiến thạch, mọc núi đá vôi Bạch đàn Urô phân bố độ cao 300 - 2960 m so với mặt nước biển Nơi nguyên sản, bạch đàn Urô cao 25 45 m, cá biệt cao 55 m, đường kính đạt từ - m (Turnbull & Brooker, 1978; Eldridge cs, 1993; Davidson, 1998) Hình 1.1 Rừng bạch đàn Urơ Brazil Nguồn: http://www.panoramio.com/photo/45954997 Lần bạch đàn Urơ có mặt Việt Nam chương trình khảo nghiệm lồi xuất xứ bạch đàn năm 1979 vùng nguyên liệu giấy trung tâm Bắc Bộ Các vườn giống trồng hạt (Seedling Seed Orchard - SSO) loài xây dựng địa bàn tỉnh Phú Thọ Hà Tây cũ Theo thơng tin từ Xí nghiệp giống Lâm nghiệp vùng trung tâm Bắc Bộ Đồng sơng Hồng hạt giống bạch đàn Urơ thu rừng giống chuyển hoá xã Trạm Thản, Phù Ninh, Phú Thọ nguồn cung cấp hạt giống cho việc trồng rừng bạch đàn tỉnh Bắc Bộ đáp ứng phần nguyên liệu cho nhà máy giấy Bãi Bằng Cho đến nay, Việt Nam, lồi bạch đàn Urơ có xuất xứ (Lembata cho vùng Bắc Trung Bộ, Lewotobi Egon cho tỉnh miền Bắc Tây Ngun) dòng vơ tính cơng nhận giống tiến kỹ thuật: PN2, PN14, PN10, PN46, PN47, PN3d (Lê Đình Khả cs, 2006) Bạch đàn Urô đánh giá lồi có dáng thân đẹp, chất lượng gỗ tốt Tại nơi nguyên sản, gỗ bạch đàn sử dụng với nhiều mục đích như: Gỗ xây dựng, làm đồ dùng gia đình, gỗ trụ mỏ, Tuy nhiên, bạch đàn Urô xem nguyên liệu cho cơng nghiệp sản xuất giấy giới Việt Nam 1.2 Tình hình trồng bạch đàn Urô Việt Nam Bạch đàn nhập vào Việt Nam từ năm 1930, nhiên đến đầu năm 1960 phát triển mở rộng sau xem lồi chủ lực để phủ xanh đất trống đồi trọc trồng phân tán Bạch đàn Urô sinh trưởng tốt lập địa có tầng đất sâu miền Bắc miền Trung, vùng thấp cao nguyên Việt Nam Gỗ bạch đàn Urô dùng làm nguyên liệu giấy (hiệu suất bột giấy 49,5 %), ván dăm, ván sợi ép, trụ mỏ, gỗ lớn dùng xây dựng, đóng đồ mộc gỗ nhỏ dùng làm gỗ củi Tính đến tháng 12 năm 1999, nước trồng 349.043 hecta rừng bạch đàn Trong rừng trồng bạch đàn lồi 249.324 hecta rừng trồng hỗn giao với loài khác 69.719 hecta Ở vùng Đơng Bắc có diện tích trồng bạch đàn lớn (88.341 hecta), duyên hải Nam Trung Bộ (77.538 hecta), Bắc Trung Bộ (69.910 hecta), đồng sông Cửu Long (58.643 hecta), vùng Tây Nguyên (10.556 hecta) Theo số liệu thống kê Ban đạo kiểm kê rừng Trung ương (2001), diện tích trồng loài bạch đàn lớn so với loài khác, đạt 349.043 hecta chiếm 24.03% so với tổng diện tích rừng trồng nước (1.452.470 hecta) Vào năm 1970, diện tích rừng trồng bạch đàn chiếm khoảng 10% so với tổng diện tích rừng trồng tồn quốc Giai đoạn 1986 – 1992 diện tích rừng trồng bạch đàn chiếm khoảng 11,75 % Nhưng đến hết năm 1999, diện tích rừng trồng bạch đàn tăng lên 24,03 % Từ năm 2000 đến tháng gen Kết chồi tái sinh thu môi trường chứa chất chọn lọc kanamycin 150 mg/l thể bảng 3.11 Bảng 3.11 Khả tái sinh mẫu chuyển gen Vật liệu ĐC Thân mầm Lá mầm Số lần lặp Số mẫu TN TB TB TB 52 57 60 275 256 264 262 267 283 Số mẫu sống tái Tỷ lệ mẫu sinh chồi /Km sống tái sinh 150 chồi (%) 0 0 0 15 5,5 13 5,1 14 5,3 5,3 14 5,3 11 4,1 14 4,9 4,8 Số chồi tái sinh/ Km 150 0 54 46 51 57 49 57 Kết mẫu sống tái sinh chồi thu môi trường chứa kanamycin nồng độ 150 mg/l thu thấp so với tỷ lệ môi trường tái sinh không chứa kháng sinh mẫu không chuyển gen Trên vật liệu thân mầm, tỷ lệ mẫu sống tái sinh chồi đạt 5,3 % tổng số mẫu thí nghiệm; với mầm tỷ lệ trung bình đạt 4,8 % tổng số mẫu Giải thích nguyên nhân sụt giảm ảnh hưởng kháng sinh chọn lọc, kháng sinh diệt khuẩn vi khuẩn Agrobacterium dư thừa tồn đọng môi trường nuôi cấy tác động đến hiệu tái sinh chồi sau biến nạp Các kháng sinh vừa có tác dụng diệt khuẩn chọn lọc mẫu gây độc cho mẫu cấy sử dụng nồng độ cao Chủng vi khuẩn Agrobacterium dư thừa tồn đọng mơi trường ni cấy có chứa gen gây độc vir có khả ức chế sinh trưởng phát triển tế bào giống loại kháng sinh chọn lọc kháng sinh diệt khuẩn, chí gây chết tế bào, chúng ảnh hưởng lâu dài đến sinh trưởng phát triển sau Trong công thức đối chứng (công thức sử dụng vật liệu chưa chuyển gen) khơng có mẫu tái sinh chồi mơi trường có kháng sinh 64 kanamycin 150 mg/l Như vậy, hiệu chọn lọc kháng sinh kanamycin nồng độ 150 mg/l bạch đàn Urơ tìm qui trình chuyển gen gus plus thích hợp cho việc sàng lọc mẫu giai đoạn đầu Số chồi tái sinh môi trường có bổ sung 150 mg/l kanamycin thu lần lặp tổng cộng 151 chồi từ thân mầm 163 chồi từ mầm Các chồi chồi sống sót, hình thái bình thường sau chu kì cấy chuyển mơi trường kháng sinh chọn lọc a b c d Hình 3.9 Chồi chuyển gen GA20 tái sinh môi trường chứa Km 150 a,b: chồi chuyển gen tái sinh từ thân mầm; c,d: chồi chuyển gen tái sinh từ mầm 3.3.2 Đánh giá khả rễ kiểm tra PCR cho chồi sau chuyển gen Các chồi sau biến nạp sống mơi trường tái sinh chồi có chứa chất chọn lọc 150 mg/l kanamycin có chiều cao đạt từ - 2,5 cm tách thành chồi đơn lẻ cấy chuyển sang môi trường rễ MS* + 0,5mg/l NAA + 0,2 mg/l IBA, có bổ sung thêm 75 mg/l kanamycin để đánh giá khả rễ Sau lần cấy chuyển môi trường rễ, chồi rễ sinh trưởng tốt kiểm tra diện gen GA20 nhờ phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Kết thí nghiệm trình bày bảng 3.12 65 Bảng 3.12 Kết kiểm tra khả rễ chồi sau chuyển gen Tổng chồi Vật liệu 51 45 50 TB 54 46 51 TB 58 49 57 TB ĐC Thân mầm Lá mầm Số chồi rễ/Km75 lần 0 Số chồi rễ/Km75 lần 0 3 1 2 4 2 Số chồi (+) PCR 0 Tỷ lệ chồi (+) PCR/Tổng chồi (%) 0 0 1,9 2,2 2,0 2,0 3,4 2,0 3,5 3,0 Số chồi tái sinh thành hoàn chỉnh sinh trưởng tốt môi trường rễ cho ̣n lo ̣c lầ n (Km 75) đạt 7/151 chồi (4,3%) thân mầm, 8/163 chồi (4,9%) mầm Trên môi trường rễ cho ̣n lo ̣c lần (Km 75) đạt 10/151 chồi (6,6%) - thân mầm, 12/163 chồi (7,4%) - mầm; phầ n còn la ̣i không rễ, sinh trưởng châ ̣m hoă ̣c ngừng sinh trưởng; công thức ĐC (chồi không chuyển gen) có 100% chồi khơng rễ, vàng dần chết (hin ̀ h 3.10) a b c d Hình 3.10 Cây chuyển gen GA20 môi trường rễ a, b: chuyển gen GA20; c, d: đối chứng 66 Hình 3.11 Cây chuyển gen trồng ngồi nhà lưới Các chồi rễ đẹp tách chiết ADN tổng số chạy phản ứng kiểm tra có mặt gen GA20 với cặp mồi F - ga20 Ara R - ga20 Ara Kết thu dòng cho sản phẩm PCR dương tính (3 dòng từ thân mầm dòng từ mầm - chiếm 2,0 % 3,0 % so với tổng số chồi sử dụng cho thí nghiệm rễ) Trong đối chứng khơng phát thấy sản phẩm phản ứng PCR M (-) (+) 1,12 kb 1,0 kb Hình 3.12 Kết kiểm tra có mặt gen GA20 Như vậy, kết thí nghiệm cho thấy chuyển gen GA20 vào bạch đàn Urơ thực tỷ lệ chuyển gen (qua kiểm tra PCR) thấp Trong hai loại vật liệu sử dụng cho chuyển gen mầm cho hiệu chuyển gen cao so với thân mầm Kết ghi nhận báo cáo Hồ Văn Giảng cs (2010) chuyển gen GA20 cho đối tượng Xoan ta (Melia azedazach L.) 67 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 4.1.1 Xây dựng quy trình tái sinh bạch đàn Urô thông qua mô sẹo - Môi trường thích hợp tạo mơ sẹo: Thân mầm: MS (1/2N2) + 20g/l sucrose + 2,0g/l phytagel + 100ml/l ND + 0,5 mg/l BAP + 0,2mg/l NAA cho hiệu tạo mô sẹo đạt 95 % sau tuần Lá mầm: MS (1/2N2) + 20g/l sucrose + 2,0g/l phytagel + 100ml/l ND + 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA cho hiệu tạo mô sẹo đạt 94% sau tuần Thân thật: MS (1/2N2) + 20g/l sucrose + 2,0g/l phytagel + 100ml/l ND + 0,5 mg/l BAP + 0,2mg/l NAA cho hiệu tạo mô sẹo đạt 31,6% sau tuần - Mơi trường thích hợp tạo chồi từ mơ sẹo: MS (1/2N2) + 20 g/l sucrose + 2,0 g/l phytagel + 100 ml/l ND + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 0,1 mg/l Kinetin cho tỷ lệ phát sinh chồi đạt 87,7 %, 8,4 chồi/mẫu, chồi tạo đồng đều, mập - Mơi trường thích hợp cho chồi in vitro rễ: MS (1/2N2) + 20 g/l sucrose + 2,0 g/l phytagel + 100 ml/l ND + 0,5 mg/l NAA + 0,2 mg/l IBA cho tỷ lệ rễ đạt 91,2 %, chồi đạt trung bình 4,9 rễ/chồi, rễ tạo mập màu trắng, ngày bắt đầu rễ sau ngày nuôi cấy 4.1.2 Xây dựng quy trình chuyển gen gus plus vào bạch đàn Urơ - Nồng độ kháng sinh kanamycin thích hợp cho chọn lọc 150 mg/l cho giai đoạn đầu qui trình ni cấy, 75 mg/l cho giai đoạn rễ chuyển gen - Thời gian tiền nuôi cấy thích hợp cho mẫu ngày, hiệu biến nạp gen gus plus sau tuần biến nạp đạt 46,1 % cho thân mầm 47,4 % cho mầm 68 - Thời gian biến nạp thích hợp cho A.tumefaciens 10 phút với tỷ lệ mẫu sống 88,1 % cho thân mầm 87,7 % cho mầm Tỷ lệ mẫu biểu tạm thời gen gus plus thu cao, 46,1 % cho thân mầm tương ứng cho mầm 47,4 % - Thời gian đồng ni cấy thích hợp ngày, tỷ lệ mẫu sống đạt 87,8 % 87,5 % cho thân mầm mầm, tỷ lệ mẫu biểu tạm thời gen gus plus sau tuần đạt 48,5 % 49,6 % thân mầm mầm - Chủng vi khuẩn thích hợp sử dụng cho chuyển gen gus plus A tumefaciens C58 - Nguồn mẫu thích hợp cho chuyển gen thân mầm mầm với tỷ lệ mẫu biểu gen gus plus 48,1 % 49,1 % Tỷ lệ chồi biểu gen gus plus/ tổng mẫu thí nghiệm 2,5 % thân mầm 2,9 % mầm 4.1.3 Kết chuyển gen GA20 vào bạch đàn Urô - Với nguồn mẫu thân mầm: Tỷ lệ mẫu sống tái sinh chồi 5,3 %, tỷ lệ chồi tạo rễ môi trường chứa kanamycin 75 mg/l chọn lọc lần 6,6 % Trong có 2,0 % mẫu cho kết dương tính kiểm tra phản ứng PCR - Với nguồn mẫu mầm: Tỷ lệ mẫu sống tái sinh chồi 4,8%, tỷ lệ mẫu tạo rễ môi trường chứa kanamycin 75 mg/l chọn lọc lần 7,4 % Trong có 3,0 % mẫu cho kết dương tính kiểm tra phản ứng PCR - Thu dòng chuyển gen GA20 cho kết dương tính phản ứng PCR, có dòng tạo từ vật liệu thân mầm dòng tạo từ vật liệu mầm 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố khác đến hiệu trình chuyển gen bạch đàn Urô thông qua vi khuẩn A tumefaciens - Nghiên cứu tối ưu hóa hồn thiện qui trình chuyển gen quan tâm vào bạch đàn Urơ Hồn thiện qui trình biến nạp, lựa chọn gen mang đặc tính có giá trị để chuyển vào bạch đàn Urô 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1999) Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa NXB Đại học quốc gia, Hà Nội Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997) Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Giáo trình cao học nông nghiệp NXB Nông nghiệp, Hà Nội (188 trang) Bộ NN & PTNT (2013) Quyết định số 65/QĐ-BNN-TCLN: Về việc công nhận giống trồng lâm nghiệp Lê Phương Dung (2009) Phân lập Promoter gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl CoA reductase (CCR) từ bạch đàn Uro (Eucalyptus Urophylla S.T Blake Luận văn Thạc sĩ Sinh học, ĐH Thái Nguyên Đỗ Xuân Đồng, Hồ Văn Giảng, Nông Văn Hải, Chu Hoàng Hà, Bùi Văn Thắng (2008) Nghiên cứu hệ thống tái sinh xoan ta (Melia Azedarach L.) thông qua phôi soma từ thân mầm phục vụ chuyển gen Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (2): 227 - 232 Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2003) “Tạo Hông (Paulownia fortune) chuyển gen kháng sâu thông qua Agrobacterium tumefaciens” Hội nghị Công nghệ sinh học tồn quốc 2003, tr 1088-1090 Lê Đình Khả, Nguyễn Hoàng Nghĩa, Nguyễn Xuân Liệu (2006) Cẩm nang ngành lâm nghiệp Đoàn Thị Mai, Lê Sơn, Lương Thị Hoan, Lê Trần Bình, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội (2003) “Nhân giống số lồi trồng rừng có suất, chất lượng cao phương pháp nuôi cấy mô” Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2003, tr 910 - 914 Đỗ Tiến Phát (2009) Xây dựng quy trình tái sinh thử nghiệm khả chuyển gen gus vào thông nhựa (Pinus merkusii Jungh & de Vries) Luận văn Thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Bùi Văn Thắng (2009) Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh chuyển gen thị Gus vào Xoan ta (Melia azedarach Linn) thong qua Agrobacterium tumefaciens Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Thái Nguyên Nguyễn Đức Thành (2000) Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu ứng dụng NXB Nông nghiệp, Hà Nội Bùi Phương Thảo (2007) Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro bạch đàn (Eucalyptus) phục vụ chuyển gen Luận văn tốt nghiệp, trường ĐH /Tr6 70 Nguyễn Quang Trung, Nghiên cứu sử dụng gỗ bạch đàn Urophylla cho sản xuất đồ mộc Nguyễn Văn Uyển (1992) Công nghệ sinh học cải thiện giống trồng NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Uyển (1993), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống rừng NXB Nông nghiệp, Hà Nội Vũ Văn Vụ (2005), Công nghệ sinh học thực vật NXB Giáo dục, Hà Nội Vũ Văn Vụ (2007) Công nghệ sinh học, tập NXB Giáo dục, Hà Nội Tài liệu tham khảo Tiếng nước Alcantara G.B.; João Carlos Bespalhok Filho; Marguerite Quoirin (2011) Organogenesis and transient genetic transformation of the hybrid Eucalyptus grandis× Eucalyptus urophylla Sci Agric (Piracicaba, Braz.), v.68, n.2, p.246-251 Anderson, L.B., Hertzel, A.V and Das A (1996) Agrobacterium tumefaciens VirB7 and VirB9 form a disulfide linked protein complex Proceedings of the National Academy of Sciences USA (93): pp 8889-8894 Bandyopadhyay S, Cane K, Rasmussen G, Hamill JD (1999) Efficient plant regeneration from seedling explants of two commercially important temperate eucalyptus species - Eucalyptus nitens and E globulus Plant Sci 140 (2):189–198 Berger, B.R and Christie, P.J (1994) Genetic complementation analysis of the Agrobacterium tumefaciens virB operon: virB2 through virB11 are essential virulence genes Journal of Bacteriology (176), pp 3646-3660 Binns A.N., Beaupre C.E and Dale M (1995) Inhibition of virB mediated transfer of diverse substrate from Agrobacterium tumefaciens by the IncQ plasmid RSF-1010 Journal of Bacteriology (177), pp 4890 Bravo Angel A.M., Hohn B., Tinland B (1998) The omega sequence of virD2 is important but not essential for efficient transfer of the T-DNA by Agrobacterium tumefaciens Molecular Plant Microbe Interactions (11), pp 57-63 Brukhin V, Clapham D, Elfstrand M, Arnol SV (2000) Basta tolerance as a selectable and screening marker for transgenic plants of Norway spruce Plant Cell Rep 19: 889 - 903 Cangelosi G.A., Ankenbauer R.G and Nester E.W (1990) Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding and a transmembrane signal protein PNAS of USA (87), pp 6708-6712 Cervera, M., Pina, J A., Juárez, J., Navarro, L., PENA, L (1998) Agrobacterium-mediated transformation of citrange: factors affecting transformation and regeneration Plant Cell Reports, 18 (3-4), 271-278 71 Chan, M-T., Cheng, H-H., Ho, S-L., Tong, W-F and Yu, S-M (1993) Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric a-amylase promoter/β-glucuronidase gene Plant Molecular Biology, 22, 491-506 Chen ZZ, Chang SH, Ho CK, Chen YC, Tsai JB and Chiang VL (2001) Plant production of transgenic Eucalyptus camaldulensis carrying the Populus tremuloides cinnamate 4-hydroxylase gene Taiwan J For Sci 16: 249–258 Cheng, Z.; Tsay, J.; Chung, J (1996), Callus culture of Eucalyptus grandis x urophylla and preliminary studies on organogenesis and Agrobacterium mediated transformation Taiwan Journal of Forest Sciences, 11 (1), 43-52 Cheng (2006) Eucalyptus urophylla transformation and selection Patent: US20060101537 A1, May 11, 2006 Chriqui D, Adam S, Caissard JC, Noin M, Azim A (1992) Shoot regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of E globulus and E gunni South African Institute of Forestry, pp: 70–80 Christie P.J (1997) Agrobacterium tumefaciens T-complex transport apparatus a paradigm for a new family of multifunction transporters in Eubacteria Journal of Bacterriologie (179), pp 3085-3094 Cid LPB, Machado ACMG, Carvalheira SBRC and Brasileiro ACM (1999) Plant regeneration from seedling explants of E grandis x E urophylla Plant Cell, Tissue and Organ Culture 56: 17-23 Costa Pinto (2007) REGENERAÇÃO DE PLANTAS DE Eucalyptus globulus POR EMBRIOGÉNESE SOMÁTICA Eucalyptus globulus plant regereration via somatic embryogenesis Doutor em Biologia, Universidade de Aveiro Dibax R., Eisfeld CL, Cuquel FL, Koehler H and Quoirin M (2005) Plant regeneration from cotyledonnary explants of Eucalyptus cammaldulensis Science Agriculture (Piracicaba, Braz.) 62: 406- 412 Dibax R, Deschamps C, Bespalhok Filho JC, Vieira E, Molinari C, Campos D, Quoirin M (2010) Organogenesis and Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of Eucalyptus saligna with P5CS gene Biol Plant 54(1):6–12 Doty S.L and Heath J.D (1996) Mutation analysis of the imput domain of the virA protein of Agrobacterium tummefaciens Journal of Bacteriology (9), pp 178 Durrenberger F., Crameri A., Hohn B and Nicola K.Z (1998) Covalently bound virD2 protein of Agrobecterium tumefaciens protects the T-DNA from exonucleolytic degradation PNAS of USA (86), pp 9154-9158 72 Eriksson EE, Isaelsson M, Olsson O and Moritz T (2000) Increased gibberellin biosynthesis in transgenic trees promotes growth, biomass production and xylem fiber length Nature Biotechnology, 18: 784-788 FAO Regional Office for Asia and the Pacific (1996) Reports submitted to the regional expert consultation on eucalyptus Volume II Fernandez D., Spudich G.M., Zhou X.R., Berger B.R., Christie P.J (1996) Agrobacterium tumefaciens virB7 lipoproetin is required for stabilization of virB proteins during assembly of the T-complex transport apparatus Journal of Bacteriology (178), pp 3168-3176 Finberg K.E., Muth T.R., Young S.P., Maken J.B., Heitritter S.M., Binns A.N., Banta L.M (1995) Interaction of virB9-10 and -11 with the membrane fraction of Agrobacterium tumefaciens virD1/D2 endonuclease, Molecular Microbiology (18), pp 915-926 Gelvin S.B (2003) Agrobacterium-mediated plant transformation the biology behind the “Gen-jockeying” Tool Microbiology and Molecular Biology Review (27), pp 16-37 Gonzỏlez, E R (2002) Transformaỗóo genộtica de Eucalyptus grandis e híbrido E grandis x E urophylla via Agrobacterium Piracicaba, 93 f Tese (Doutorado, Agronomia) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo Gubis J Zuzana L., Jurai F., Zuzana J., (2004) Effect of growth regulators on shoot induction and plant regerenation in tomato Biologia, Brastislava, 59/3, p405-408 Gustavo A., Cabrera J (1998a) The Agrobacterim tumefaciens gene transfer to plant cell Molecular Microbiology (26), pp 1-14 Gustavo A., Cabrera J (1998b) The Agrobacterim tumefaciens: a natural tool for plant transformation Plant Cell Rep (26), pp 1-11 Harcourt RL, Kyozuka J, Floyd RB, Bateman KS, Tanaka H, Decroocq V, Llewellyn DJ, Zhu X, Peacock WJ, Dennis ES (2000) Insect- and herbicideresistant transgenic Eucalyptus Mol Breed 6:307–315 Hille J., Wullems G., Schilperoort R.A (1983) Non-oncogenic T-Region mutants of Agrobacterium tumefaciens transfer T-DNA into plant cells Plant Molecular Biology (2), pp 155-163 Ho CK, Chang SH, Tsay JY, Tsai CJ, Chiang VL, Chen ZZ (1998) Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Eucalyptus camaldulensis and production of transgenic plants Plant Cell Rep 17:675–680 73 Huang Z.C., F -H Zeng, X -Y Lu (2010) Efficient regeneration of Eucalyptus urophylla from seedling-derived hypocotyls Biologia Plantarum, Volume 54 (1), pp 131-134 Jia S.R (2004) Transgenic Cotton Science Press, Beijing/New York Jin S., Roitisch T., Christie P.J and Nester E.W (1990) The regulatory virG protein specifically binds to a cis acting regulatory sequence involved in transcriptional activation of Agrobacterium tumefaciens virulence genes Journal of Bacteriology (172), pp 531-562 Jones A.L., Lai, E.M., Shirasu, K and Kado, C.I (1996) Vir B2 is a processed pilin-like protein encoded by the Agobacterium tumefaciens Ti plasmid Journal of Bacteriology (178), pp 5706-57112 Kawaoka A, Nanto K, Ishii K, Ebinuma H (2006) Reduction of lignin content by suppression of expression of the LIM domain transcription factor in Eucalyptus camaldulensis Silvae Genet 55(6):269–277 Kawasu T, Doi K, Ohta T, Shinohara Y, Ito K, Shibata M (1990) Transformation of Eucalyptus saligna using electroporation Plant tissue and cell culture, Amsterdam IAPTC 24–29, June, pp 64 Kawasu T, Susuki Y, Wada T, Kondo K, Koyama H (2003) Over expression of a plant mitochondrial citrate synthase in eucalyptus trees improved growth when cultured by alphosphate as a sole phosphate source Plant Cell Physiol 44:S91 Kawazu T, Keigo Doi K and Keiko Kondo K (2003) Process for transformation of mature trees of Eucalyptus plants Patent No.: US 6.563.024 B1 Kien N.D., Jansson G., Harwood C & Thinh HH (2009) Genetic control of growth and form in Eucalyptus urophylla in Northern Vietnam Journal of Tropical Forest Science 21(1): 50–65 Kondo K, Furuyjyo A, Ishigi N, Kasuga M, Shinozaki K, YamaguchiShinozaki K, Hibino T (2003) Analysis of the stress response genes in eucalyptus and effect of introducing several stress tolerance-giving genes into eucalyptus; A development situation and a practical possibility of an environmental stress resistant tree Plant and Animal Genome 11th, San Diego California Laine E and David A (1994) Regeneration of plants from leaf explants of micropropagated clonal Eucalyptus grandis Plant Cell Rep., 13 473-476 Laudete M S., Luis Pedro Barrueto Cid and Ana Cristina Miranda Brasileiro (2002) Biolistic transformation of Eucalyptus grandis x E urophylla callus Functional Plant Biology 29(8) 917 - 924 Macrae S, Van Staden J (1999) Transgenic Eucalyptus Bajaj YPS (ed) Biotechnology in agriculture and forestry 44:88–114 74 Mard (2002) Statistics of agriculture and rural development 1996–2000 Agricultural Publishing House, Hanoi, Vietnam Mead D.J., (2001) Mean annual volume increment of selected industrial forest plantation species Consultants Edited, FAO Michael, Meyrick, Amanda, Martin, Jack, Simon (2000) Modification of plant fibres WO 2000/012715 A1R6 Moralejo, M., Rochange, F., Boudet, A M., Teuliéres, C (1998) Generation of transgenic Eucalyptus globulus plantlets through Agrobacterium tumefaciens mediated transformation Australian Journal of Plant Physiology 25 (2), p.207 – 212 Mullins, K V., Llewellyn, D J., Hartney, V J., Strauss, S., Dennis, E S (1997) Regeneration and transformation of Eucalytus camaldulensis Plant Cell Reports 16: 787-791 Nora G., Medkovska M.; Todorovska E., Todorovska E., Velitchka R., Stanislava G., (2005) Development of genetically engineered tomato forms resistant to heavy metals Genetics and Breeeding N0 Sofia Osvaldo A Castellanos-Hernández, Araceli Rodríguez-Sahagún, Gustavo J Acevedo-Hernández and Luis R Herrera-Estrella (2011) Genetic Transformation of Forest Trees InTech: pp 196 - 197 Picoli, E A DE T.; Cecon, P R.; Fári, M G.; Otoni (2002) Organogenesis in eggplant (Solanum melongena L cv Embú) as affected by antibiotics and growth regulators International Journal of Horticultural Science, (2), 76-82 Prakash MG and Gurumurthi K 2005 Somatic embryogenesis and plant regeneration in Eucalyptus tereticornis Sm Current Science 88: 1311-1316 Quisen R., Yohana de Oliveira, Marcos Pileggi, Francine Cuquel, Marguerite Quoirin (2009) Selective Agent and A tumefaciens Overgrowth-control Antibiotics in Eucalyptus camaldulensis Cotiledonary Culture Braz Arch Biol Technol v.52 n.6: pp 1485-1492 Rossi L., Hohn B and Tinland B (1996) Integation of complete transferred DNA units is dependent on the activity of virulence E2 protein of Agrobacterium tumefaciens Abstract Scott A.M and Jeffrey F.D (2000) Forest tree biotechnology Elsevier Science, (5), pp 289-302 SHA Yue, WU Zhi, OUYANG Le, HUANG Zhen, ZENG Fu, LI Zai (2013) Tissue culture and regeneration of Eucalyptus pellita Journal of Southern Agriculture 44 (9):1511-1516 75 Shao Z, Chen W, Luo H, Ye X and Zhang J 2002 Studies on the introduction of the cecropin D gene into Eucalyptus urophylla to breed the resistant varieties to Pseudomonas solanacearum Scientia Silvae Sinicae, 38: 92-97 Shirasu K., Morel P and Kado C.I (1990) Charaterization of the virB operon of an Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid: nucleotide sequence and protein analysis Molecular Microbology (134), pp 1153-1163 Shirasu K., Nicola K.Z., Hohn B and Kado C.I (1994) An innermembrane-associated virulence protein essential for T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to plants exhibits ATPase activity and similarities to conjuration transfer genes Molecular Microbiology (11), pp 581-588 Sophie Nourissier and Olivier Monteuuis (2008) In vitro rooting of two Eucalyptus urophylla X Eucalyptus grandis mature clones In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant Volume 44 (4):263-272 Spokevicius AV, Beveren KV, Leitch MA and Bossinger G (2005) Agrobacterium mediated in vitro transformation of wood – producing stem segments in eucalyptus Plant Cell Reports, 23: 617-624 Stephens K.M., Roush C and Nester E.W (1995) Agrobacterium tumefaciens virB11 protein requires a consensus nucleotit-binding site for function in virulence Journal of Bacteriology (1), pp 27-36 Sung HP., Jay L M., Jung Eun P., Kendal D H., Roberta H S., (2003) Efficinet and genotype - independent Agrobacterium - mediated tomato transformation Journal of Plant Physiol 160: 1253-1257 Suzuki S and Nakano M (2002) Agrobacterium-mediated production of transgenic plants of Muscari armeniacum Leichtl.ex Bak Plant Cell Rep (20), pp 835-841 Suzuki Y, Kawazu T, Tsuyama M, Wada T, Kondo K, Mizuno R, Hara T, Koyama H (2004) Characteristics of transgenic eucalyptus hybrids with an over expression of a plant mitochondrial citrate synthase Nippon Shokubutsu Seiri Gakkai Nenkai oyobi Shinpojiumu Koen Yoshishu 45:07 Teasdale, Robert, Dixon, Mouradova, Ekaterina, Yang, Yumin, HE, Ding, G.O'DWYER, CeciliaA (1999) A method of transformation WO 99/48355 Teulieres C, Marque C, Boude AM (1994) Genetic transformation of eucalyptus Biotechnology in agriculture and forestry V, plant protoplasts and genetic engineering 29:289–307 Tibok A (1990) Micropropagation, Regeneration and Transformation Studies on Eucalyptus urophylla and E nitens M.Sc Thesis, Wye College, University of London 76 Tibok’ A., N.W Blackhall, J.B Power, M.R Davey* (1995) Optimized plant regeneration from callus derived from seedling hypocotyls of Eucalyptus urophylla Plant Science 110: 139-145 Tournier V, Grat S, Marque C, El Kayal W, Penchel R, Andrade DG, Boudet AM, Teulieres C (2003) An efficient procedure to stably introduce genes into an economically important pulp tree (Eucalyptus grandis × Eucalyptus urophylla) Trans Res 12:403–411 Ward J.E., Akiyoshi D.E., Regie D., Datta A., Gordon N.P and Nester E.W (1988) Characterization of the virB operon from an Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid Journal of Biological Chemistry (265), pp 4768 Xiang Yu, Akira Kikuchi, Etsuko Matsunaga, Yoshihiko Morishita, Kazuya Nanto, Nozomu Sakurai, Hideyuki Suzuki, Daisuke Shibata, Teruhisa Shimada, Kazuo N Watanabe (2009) Establishment of the evaluation system of salt tolerance on transgenic woody plants in the special netted-house Plant Biotechnology 26, 135–141 Yamada-Watanabe K, Kawaoka A, Matsunaga K, Nanto K, Sugita K, Endo S, Ebinuma H, Murata N (2003) Molecular breeding of Eucalyptus: analysis of salt stress tolerance in transgenic Eucalyptus camaldulensis that overexpressed choline oxidase gene (codA) IUFRO tree biotechnology Umea Plant Science Centre, Umea, pp S7–S9 Yun Ling Xu, LiLi, Keqiang Wu, Anton J M Peeters, Douglas A Gage, Jan A D Zeevaart (1995) The GA5 locus of Arabidopsis thaliana encodes a multifunctinal gibberellin 20-oxidase: Molecular cloning and functinal expression Proc Natl Acad Sci USA, 92: 6640-6644 Zhou, X.R and Christie, P.J (1997) Suppression of mutant phenotypes of the Agrobacterium tumefaciens VcirB11 ATPase by overproduction of VirB proteins Journal of Bacteriology (179), pp 5835-5842 Zupan J.R., Citovski V and Zambryski P.C (1996) Agrobacterium virE2 protein mediates nuclear uptake of single-stranded DNA in plant cells PNAS of USA (93), pp 2392 Tài liệu tham khảo trang Web http://www.tchdkh.org.vn/tin-tuc-su-kien/cong-nghe-moi-san-phammoi/3347-giong-bach-dan-uro-262.html http://vafs.gov.vn/vn/2013/09/giong-moi-duoc-cong-nhan/ 77 PHỤ LỤC Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) Thành phần Hàm lượng (mg/l) 1900 KNO3 NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 CaCl2 332 H3BO3 6,2 MnSO4.H2O 22,3 ZnSO4 8,6 Na2MO4 0,25 CuSO4.7H2O 0,025 CoCl2 0,025 Na2EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Glycin Myo-inositol 100 Nicotimic acid 0,5 Thiamin.HCl 0,1 Pyrdoxin HCl 0,5 78 ... chuyển gen hiệu vào lồi bạch đàn dòng bạch đàn cụ thể cần có quy trình thích hợp Xuất phát từ sở thực đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh chuyển gen sử dụng Agrobacterium tumefaciens cho. .. cho đối tượng bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) nhằm cung cấp sở cho việc tạo giống bạch đàn Urô biến đổi gen sinh trưởng nhanh Mục tiêu - Nghiên cứu, xây dựng quy trình tái sinh bạch đàn. .. chế quy trình chuyển gen chọn lọc chuyển gen cho loài bạch đàn E urophylla Các kết nghiên cứu cho thấy sử dụng dòng bạch đàn E urophylla khác cho hiệu suất chuyển gen khác Điều cho thấy để chuyển