Nghiên cứu nhân giống cây vú bò (Ficus Simplicissima Lour.) bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trưởng đến hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò trong ống nghiệm .... Xuất phát từ giá trị to lớn của câ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY VÚ BÒ

(FICUS SIMPLICISSIMA LOUR.) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY VÚ BÒ

(FICUS SIMPLICISSIMA LOUR.) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ TÂM

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của kĩ thuật viên Trần Thị Hồng (Phòng Công nghệ tế bào - Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên) Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện quá trình nghiên cứu

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa, các thầy

cô giáo, cán bộ khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Tác giả

Nguyễn Thị Bích Ngọc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng

dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây Vú bò 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Vú bò 3

1.1.2 Một số thành phần có hoạt tính dược học của cây Vú bò 4

1.1.3 Ứng dụng của cây Vú bò trong y học 5

1.2 Kỹ thuật nhân giống cây trồng trong công nghệ sinh học thực vật 6

1.2.1 Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro 6

1.2.2 Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro 10

1.3 Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 11

1.3.1 Auxin 11

1.3.2 Cytokinin 13

1.4 Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ở trong nước 14

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 18

2.1.1 Vật liệu thực vật 18

2.1.2 Hoá chất, thiết bị 18

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 19

2.2.2 Đưa cây ra môi trường tự nhiên 21

2.2.3 Phương pháp xử lí và tính toán số liệu 22

2.2.4 Điều kiện thí nghiệm 22

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Kết quả nghiên cứu khử trùng hạt 23

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trưởng đến hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò trong ống nghiệm 25

3.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò 26

3.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò 28

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP (kinetin) và NAA đến hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò 29

3.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA đến hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò 29

3.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa kinetin và NAA đến hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò 31

3.3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP, kinetin và NAA đến hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò 32

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của

chồi Vú bò 34

3.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh trưởng của cây con trong vườn ươm 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

1 Kết luận 38

2 Đề nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 44

IAA: Indole-3-acetic acid

IBA: Indole-3-butyric acid

Kinetin: 6-furfurylaminopurine

LV: Litvay, 1985

MS: Murashige và Skoog, 1962

NAA: Naphthalene acetic acid

2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi và sự

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả nhân chồi và

Bảng 3.4 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA đến hiệu quả

nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò 30

Bảng 3.5 Ảnh hưởng kết hợp giữa kinetin và NAA đến hiệu

quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò 31

Bảng 3.6 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP, kinetin và NAA đến

hiệu quả nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò 33

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh

trưởng của cây Vú bò in vitro trong vườn ươm 37

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỉ lệ nảy mầm

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi và

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ kinetin đến hệ số nhân chồi

Hình 3.4 Ảnh hưởng của của tổ hợp BAP và NAA đến hệ số

nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò 31

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và NAA đến hệ số

nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò 32

Hình 3.6 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP, kinetin và NAA đến hệ

số nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Vú bò 34

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của

Hình 3.8 Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây Vú

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Nước ta may mắn sở hữu nguồn tài nguyên cây thuốc khá dồi dào Hiện nay, có hàng ngàn loài cây thuốc gắn với những bài thuốc cổ truyền bản địa đang được nhân dân khai thác phục vụ cho chữa trị các bệnh Việc khai thác quá mức và thiếu quan tâm đến bảo tồn là nguyên nhân chính khiến tài nguyên cây thuốc ngày càng cạn kiệt, nhiều loài đứng trước nguy cơ tuyệt chủng [16]

Theo kết quả điều tra của Viện Dược liệu, cả nước ghi nhận gần bốn nghìn loài cây thuốc, trong đó chỉ 10% là cây thuốc trồng, còn lại là cây thuốc trong tự nhiên Trước tình hình suy giảm nhanh chóng nguồn cây thuốc, vấn

đề bảo tồn cây thuốc trở nên bức thiết Để thực hiện được phương châm lấy dược liệu làm nền tảng trong chiến lược phát triển của ngành Y - Dược, một trong những trọng điểm của định hướng là đẩy mạnh công tác trồng trọt cây thuốc trên quy mô lớn, phát triển nguồn dược liệu hàng hoá phục vụ cho việc điều trị trong nước và xuất khẩu, mở ra cơ hội lớn cho việc giao thương, tham gia thị trường quốc tế về dược liệu và dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên [4]

Trong dân gian, một trong những cây thuốc được sử dụng chữa nhiều bệnh ở người đó là cây Vú bò Cây Vú bò được phân bố ở Trung Quốc, Ấn

Độ và Việt Nam, rải rác khắp các vùng núi thấp (dưới 600m) đến trung du và đồng bằng Ở nước ta, Vú bò là cây mọc hoang ở các vùng đồi núi [16]

Trong cây Vú bò có nhiều axit hữu cơ, axit amin, các chất triterpen, alkaloid và coumarin Bộ phận dùng làm thuốc ở cây Vú bò là rễ và vỏ rễ, được dùng thay thế Hoàng kỳ nên có tên là Thổ hoàng kỳ Theo Đông y, Vú

bò vị cay, ngọt, hơi ấm, có tác dụng kiện tỳ, bổ phế, hành khí lợi thấp, tráng

gân cốt, chữa phong thấp tê bại, ho do phế lao, ra mồ hôi trộm, chân tay mệt mỏi vô lực, ăn ít bụng trướng, thủy thũng, viêm gan, bạch đới, phụ nữ sau sinh không có sữa [20]

Hiện nay, cây Vú bò chưa được trồng chính thức mà chỉ được sử dụng làm thuốc bằng cách thu hái trong tự nhiên Vú bò có thể trồng bằng hạt nhưng tỉ lệ nảy mầm thấp

Kĩ thuật nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã được áp dụng trên nhiều đối tượng cây trồng như Sa nhân tím [6], Thanh hao hoa vàng [11], Hoắc hương [18], Lô hội [22], Lan Kim tuyến [24], Ba kích [27] …và thu được thành công lớn trong thực tiễn sản xuất

Xuất phát từ giá trị to lớn của cây Vú bò, việc ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm bảo vệ nguồn gen và tạo ra được một số lượng lớn giống cây Vú bò sạch bệnh, cung cấp cho nuôi trồng là hết sức cần thiết,

do vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân giống cây Vú

bò (Ficus simplicissima Lour.) bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được quy trình nhân giống cây Vú bò trong ống nghiệm và giá thể đưa cây ra môi trường tự nhiên nhằm bảo tồn nguồn gen và tạo ra số

lượng nhất định cây con đồng đều cung cấp cho sản xuất

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu khử trùng hạt để có mẫu sạch ban đầu trong ống nghiệm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi Vú bò trong ống nghiệm

- Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh thông qua thăm dò ảnh hưởng của nồng độ NAA

- Nghiên cứu giá thể đưa cây ra môi trường tự nhiên

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây Vú bò

1.1.1 Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Vú bò

Cây Vú bò có tên khoa học là Ficus simplicissima Lour., tên thường gọi: Vú bò sẻ, Vú chó, Vú lợn, Ngải phún, Sung ba thùy [1], [16]

Vú bò thuộc chi Đa đề (Ficus)

cm, mặt trên nháp, mặt dưới có lông nhỏ, mép khía răng, gân gốc 3, cuống lá

có lông dày cứng, lá kèm hình ngọn giáo [2], [16]

Vú bò có cụm hoa mọc ở kẽ lá gồm hoa đực và hoa cái, hoa đực không cuống, lá đài 4, hình dải, dính nhau ở gốc, nhị 2, hoa cái có cuống, lá đài 4, thuôn tù, bầu hình trái xoan Cành, lá, cuống lá, hoa đều có lông mịn màu vàng mốc [16]

Quả Vú bò thuộc loại quả phức không cuống, có ít lông, có vị chát, giòn, màu lục, khi chín thì mềm màu tím, có vị ngọt nhẹ, bên trong có nhiều hạt (quả thực) Tháng 5 đến tháng 12 là mùa ra hoa kết quả của Vú bò Toàn cây Vú bò có nhựa mủ Rễ Vú bò hình trụ, màu vàng, tương đối thẳng [16]

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng,

có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật, thường có dược lực tính rất mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid [25], [33]

Về tầm quan trọng trong dược liệu, alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học Nhiều alkaloid có tác dụng trên hệ thần kinh trung ương gây ức chế hoặc gây kích thích Trong số alkaioid có chất gây tê tại chỗ, có chất làm giãn cơ trơn, chống co thắt Có alkaloid làm tăng huyết áp, có chất làm hạ huyết áp, một số ít alkaloid có thể tác dụng trên tim được dùng làm thuốc chữa loạn nhịp tim Có alkaloid diệt ký sinh trùng dùng để chữa lỵ, trị sán [8], [26]

Coumarin là những dẫn chất α- pyron có cấu trúc C6 - C3 Người ta có thể coi α-pyron là một lacton (este nội) của axit hydroxycinnamic vì khi cho

tác dụng axit vô cơ lên axit hydroxycinnamic, ví dụ HCl thì sẽ đóng vòng lacton Ngược lại, vòng lacton sẽ bị mở vòng khi tác dụng bởi kiềm Sự mở vòng và đóng vòng có tính thuận nghịch [35]

Về tác dụng của coumarin, đáng chú ý là tác dụng của các dẫn chất

coumarin chống co thắt, làm giãn nở động mạch vành Một số coumarin có tác dụng chống đông máu, tác dụng như vitamin P (làm bền và bảo vệ thành mạch), chữa bệnh bạch biến hay bệnh lang trắng và bệnh vẩy nến, tác dụng kháng khuẩn Một số có tác dụng chống viêm [8]

1.1.3 Ứng dụng của cây Vú bò trong y học

Theo Đông y, bộ phận dùng của Vú bò chủ yếu là rễ và vỏ rễ Thường

rễ đào về thái mỏng, phơi hay sấy khô Có khi sao vàng hay tẩm mật sao cho thơm Có khi nấu thành cao đặc mà dùng [14]

Vị thuốc Vú bò được sử dụng trong một số đơn thuốc sau:

(1) Chữa phong thấp: Ngày dùng 15 - 20g dưới dạng thuốc sắc hay ngâm rượu Mỗi lít rượu ngâm 100 - 200g rễ sao vàng, mỗi ngày uống 15 - 20ml rượu này

(2) Chữa đau phong thấp: Rễ Vú bò 60g, móng giò lợn 250g, rượu 60g Thêm ít nước, sắc còn nửa bát, chia làm 2 lần uống trong ngày cách nhau 4 - 6 giờ

(3) Chữa ngã bị ứ huyết, ngực bụng đau nhức, hòn cục: Toàn cây Vú bò giã nát, thêm rượu và ít muối, sao nóng đắp lên nơi đau

(4) Chữa đau dạ dày, viêm tinh hoàn, lòi dom, sa tử cung: Vú bò 30g,

Tô mộc, Hồi đầu thảo, Ngưu tất, Mộc thông mỗi vị 12 g Sắc uống

(5) Chữa bế kinh, sau khi đẻ ứ huyết đau bụng: Rễ Vú bò 30 - 60g Sắc nước rồi thêm ít rượu uống

(6) Chữa thấp khớp mạn tính: Vú bò (sao vàng) 20g, Dây đau xương (sao vàng) 16g, rễ Sung (sao) 12g, củ Ráy tía (sao) 12g, rễ Gối hạc (sao vàng)

16g, Thiên niên kiện 12g, rễ Bạch hoa xà 8g Sắc nước, cho thêm ít rượu để uống

(7) Chữa ứ máu tím bầm do ngã hay bị thương: Lá hay quả giã nát, chưng với rượu, đắp hay chườm

(8) Sưng đau tinh hoàn: Rễ Vú bò tươi 60 - 120g Sắc uống

(9) Bạch đới: Rễ Vú bò khô 60g Sắc uống

(10) Ăn không ngon miệng, tiêu hoá kém, hay đầy bụng, hay bị phân sống: Vú bò 20g, Mộc hương 4g, Thảo quả 6g, Đậu khấu 6g Sắc uống

(11) Các chứng viêm gan mạn, xơ gan, phù do suy dinh dưỡng: Vú bò 20g, Diệp hạ châu 16g, Nhân trần 12g, Rau má 16g Sắc uống

(12) Khử đờm giảm ho (viêm phế quản, ho có đờm): Vú bò 20g, Mạch môn 12g, Diếp cá 20g, lá Táo 16g Sắc uống

(13) Lợi sữa: Vú bò 20g, Trạch tả 20g, Mộc thông 20g, Xuyên sơn giáp 10g Sắc uống

(14) Bổ khí, bổ huyết, bổ tỳ, bổ thận: Vú bò 20g, Đương quy 10g, Bạch truật 10g, Thục địa 10g Sắc uống, ngày 1 thang Có thể dùng đơn này với liều cao hơn để ngâm rượu, ngâm 10 - 15 ngày Uống 30ml mỗi ngày

(15) Chữa bụng trướng đầy, đại tiện táo kết: Nhựa mủ trắng lấy từ cây

Vú bò, trộn với bột Nghệ vàng, làm thành viên Mỗi lần uống 10 - 15g, ngày uống 2 lần chiêu với nước trắng [16], [19]

1.2 Kỹ thuật nhân giống cây trồng trong công nghệ sinh học thực vật

1.2.1 Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro

1.2.1.1 Ưu thế của nhân giống in vitro

Kĩ thuật nhân giống in vitro phát triển và mở rộng trong những năm

gần đây do nhu cầu về lượng giống cây trồng tăng cao Các giống cây trồng cần lượng lớn nhằm phục vụ dự án trồng lại rừng, sản xuất lương thực, thực

phẩm, dược liệu, thức ăn gia súc và bảo vệ môi trường Nhân giống in vitro có

những ưu điểm nổi bật mà các loại hình nhân giống khác không có được, đó là:

(1) Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kì đều có thể tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền

(2) Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ một cây trong vòng 1 - 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây

(3) Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây

mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp

(4) Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống

(5) Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để loại trừ virut, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc

(6) Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản

phẩm khác nhau có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây con in vitro

(trong ống nghiệm) hoặc trong bầu đất Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay thân củ

(7) Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận là sạch bệnh Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các quy định về vệ sinh thực vật quốc tế

(8) Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kì thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ [31]

1.2.1.2 Các phương thức nhân giống in vitro

* Nuôi cấy mô phân sinh (đỉnh sinh trưởng)

Khái niệm mô phân sinh chỉ đúng khi mẫu vật nuôi cấy được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của tháp sinh trưởng Trong thực tế thường gặp khó khăn lớn trong việc nuôi thành công các đỉnh sinh trưởng riêng rẽ như vậy nên người ta chỉ áp dụng hình thức nuôi cấy mô phân sinh với mục đích làm sạch virut cho cây trồng [3], [10]

Độ lớn của chồi (mô) nuôi cấy có mối tương quan chặt chẽ với tỉ lệ sống, khả năng cảm ứng và mức độ ổn định về mặt di truyền Nếu độ lớn chồi tăng thì tỉ lệ sống và tính ổn định tăng, nhưng có thể làm giảm khả năng cảm ứng của chồi/mô nuôi cấy và ngược lại Tuy nhiên, nếu xét về hiệu quả kinh

tế (thể tích bình nuôi, lượng dung dịch môi trường dinh dưỡng…): nếu độ lớn tăng thì hiệu quả kinh tế giảm, nếu độ lớn giảm thì hiệu quả kinh tế tăng Do

đó, phải có sự kết hợp hài hòa giữa các yếu tố trên để tìm ra kích thước mẫu tối ưu [10]

Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh Xét về nguồn gốc của các cây đó có ba khả năng: cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn), cây phát triển từ chồi nách phá ngủ, cây phát triển từ chồi mới phát sinh Tuy nhiên trong thực tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh [30]

Có hai phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đó là: (1) Phát triển cây trực tiếp, thường gặp chủ yếu ở các đối tượng cây hai lá mầm như: hoa cúc, cẩm chướng, khoai tây, thuốc lá…(2) Phát triển cây thông qua giai đoạn protocorm, thường gặp chủ yếu ở các đối tượng cây một lá mầm như phong lan, dứa, huệ…Từ một đỉnh sinh trưởng ban đầu cùng

lúc tạo ra hàng loạt protocorm và các protocorm này có thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh Bằng phương thức này chỉ trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được hàng triệu cá thể [10]

* Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây

Ngoài đỉnh sinh trưởng là bộ phận nuôi cấy dễ thành công thì các bộ phận còn lại của cơ thể thực vật (ngoại trừ các mô đã hóa gỗ) cũng đều có thể

sử dụng cho việc nhân giống in vitro, chẳng hạn như đoạn thân, mảnh lá, các

bộ phận của hoa, vảy củ,… [30]

Sự phát sinh hình thái trực tiếp từ mẫu nuôi cấy bắt đầu từ các tế bào nhu mô nằm ở trong biểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân Một số tế bào này trở thành mô phân sinh và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh phát triển Khả năng cảm ứng của mô thực vật cũng tùy thuộc vào nồng độ của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, chủ yếu phụ thuộc vào tỉ lệ nồng độ giữa auxin

và cytokinin Tỉ lệ này lớn hơn 1 thì thường có khuynh hướng tạo rễ; tỉ lệ này nhỏ hơn 1 thường có khuynh hướng tạo chồi; nếu tỉ lệ này bằng 1 thì mô nuôi cấy thường phát sinh callus [10]

* Nhân giống in vitro thông qua giai đoạn mô sẹo (callus)

Nếu tái sinh cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật cấy ban đầu thì thu được nhanh chóng các cây khá đồng nhất về mặt di truyền, tuy nhiên trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo Tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền, để tránh tình trạng đó cần sử dụng mô sẹo vừa phát sinh để thu được cây tái sinh đồng nhất về di truyền Thông thường, người ta chỉ tiến hành nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đối với những đối tượng khó tái sinh cây trực tiếp [30]

* Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính - công nghệ hạt nhân tạo

Phôi vô tính là các cá thể nhân giống có cực tính bắt nguồn từ các tế bào soma Chúng rất giống phôi hữu tính ở hình thái, quá trình phát triển và

sinh lí, nhưng do không phải là sản phẩm của quá trình thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái, vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền, do đó các phôi vô tính có nội dung di truyền giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra chúng [10]

Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô thực vật, ngoài các điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy, còn phụ thuộc rất lớn vào loài, vào các giống, dòng trong cùng một loài Khả năng này đã được chứng minh là do một hoặc vài gene phụ trách Vì vậy, bằng biện pháp lai tạo có thể chuyển khả năng tạo phôi vô tính cao từ cây này qua cây khác [10]

Hạt nhân tạo là phôi vô tính bọc trong một lớp vỏ polymer như agar, agarose, alginatc… Trong cấu trúc lưới của lớp vỏ đó, nước, chất dinh dưỡng được cung cấp thay cho nội nhũ, giúp cho phôi vô tính có thể nảy mầm trở thành cây hoàn chỉnh [10]

1.2.2 Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro

Theo Nguyễn Hoàng Lộc (2007), quy trình nhân giống vô tính in vitro

được thực hiện theo ba giai đoạn [13]

1.2.2.1 Giai đoạn I – Cấy gây

Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải bảo đảm những yêu cầu: Tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh

Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỉ lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh [13]

1.2.2.2 Giai đoạn II – Nhân nhanh

Ở giai đoạn này, người ta kích thích tạo cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh

Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa

cơ quan, đặc biệt là chồi như: (1) Bổ sung riêng rẽ hoặc tổ hợp chất kích thích sinh trưởng phù hợp Tăng tỉ lệ auxin/cytokinin sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo

rễ và ngược lại sẽ kích thích phát sinh chồi (2) Đảm bảo điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp

Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối ưu [13]

1.2.2.3 Giai đoạn III – Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất

Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo

rễ, huấn luyện thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh

và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn Quá trình thích nghi ở đây là quá trình thay đổi những đặc điểm sinh lí và giải phẫu của bản thân cây non đó Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần, trong thời gian này cây phải được chăm sóc và bảo vệ trước những yếu tố bất lợi như mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô, nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn, cháy lá do nắng [13]

1.3 Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

Ngoài các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin

là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại

mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật thuộc nhóm auxin và nhóm cytokinin [31]

1.3.1 Auxin

Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là axit indol axetic (IAA) và nó là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng nhất trong tất cả các loại thực vật Trong thực vật nó không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà còn ở dạng liên kết không có hoạt tính sinh học như IAA-glucose, IAA-

myoinositol, IAA-glucan, IAA-aspartate…Các dẫn xuất khác của indol cũng thể hiện hoạt tính của auxin là indol tryptamine, indol acetaldehyde, indol pyruvate, indol ethanol [7]

Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn và chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể thực vật như lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổng hợp (IBA, NAA, 2,4-D…) [7]

Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tới hàng loạt các quá trình sinh lý: Kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ, auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa…Do hoocmon thực vật tác động lên sinh trưởng thông qua mối tương quan nồng độ giữa các loại hoocmon khác nhau, nên các quá trình trên đây không chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các hoocmon khác Tùy thuộc vào nồng độ tác dụng mà các mô thực vật có các kiểu phản ứng khác nhau đối với auxin Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào thông qua tác dụng trực tiếp lên sự giãn nở của vách tế bào [7], [31]

Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin gồm một vài hợp chất

đã được sử dụng từ rất lâu trong nông nghiệp Chỉ một thời gian ngắn sau khi IAA được tìm thấy trong tự nhiên, nó đã được tổng hợp và trở thành một hợp chất có giá trị Nhưng IAA không có lợi để dùng trong nông nghiệp bởi nó dễ dàng bị phân hủy thành các hợp chất mất hoạt tính dưới ảnh hưởng của ánh sáng và vi sinh vật Một trong những tác dụng của auxin là kích thích sự hình thành rễ của những lát cắt thân Một số hợp chất tổng hợp nhân tạo có vai trò tương tự như IAA, trong đó có IBA IBA là hợp chất có hoạt tính auxin yếu

nhưng nó có khả năng ổn định và vô hiệu hệ enzyme làm mất hoạt tính của auxin [7]

Các auxin thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích

sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo rễ… Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indol butiric axit), IAA (3-indol axetic axit), NAA (naphthalen axetic axit), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy axetic axit) Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường

ra chồi Auxin thường hòa tan trong ethanol hoặc NaOH pha loãng [31]

1.3.2 Cytokinin

Phần lớn cytokinin là dẫn xuất của purin Loại cytokinin đầu tiên phát hiện được và cũng là dạng phổ biến nhất là zeatin tách từ mầm ngô Ngoài ra còn có hàng loạt cytokinin khác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin, chlorephenylurea…, trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, mà người

ta thu nhận bằng cách xử lý nhiệt DNA [7]

Chứng minh về khả năng ngăn cản sự vàng lá của benzyladenin (BA) là một phát hiện thu hút nhiều nhà sinh lý học từ những năm 1950 Những năm

1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BA có thể kích thích nhiều quá trình, BA được sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các nồng độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy [7]

Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi

và trong quả đang phát triển Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúng tương tác với myo-inositol, nhưng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phần của các glycoside [7]

Cũng như auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây, đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi axit nucleic và protein Cytokinin

điều chỉnh sinh trưởng bằng nhiều cách như điều chỉnh tốc độ tổng hợp ADN khi phân chia tế bào, làm chậm sự lão hóa của lá, góp phần phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, kích thích ra hoa và sinh trưởng của quả, gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô, làm tăng diện tích phiến lá

do kích thích sự lớn lên của tế bào [31]

Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào, tạo và nhân mô sẹo, phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh, tăng cường phát sinh chồi phụ Các loại cytokinin thường được dùng là: kinetin, BAP… Cytokinin hòa tan trong dung dịch HCl pha loãng [31]

1.4 Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô

tế bào thực vật ở trong nước

Ở Việt Nam, công nghệ nuôi cấy mô tế bào phục vụ nhân giống cây trồng đã được triển khai trên 20 năm nay Nhân giống thương mại quy mô lớn đã đạt được ở một số cây trồng như nhân nhanh giống chuối (khoảng 2 triệu cây/năm), nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh, nhân nhanh các giống mía mới nhập nội năng suất cao, nhân nhanh các dòng bạch đàn chọn lọc và keo lai đạt 3 triệu cây/năm Công nghệ nhân giống cũng được áp dụng trên nhiều cây trồng khác nhau như dứa, dứa sợi, cà phê, tếch, các cây thuốc quý, các loài lan và cây hoa, cây cảnh, cây ăn quả…Việc thương mại hóa các quy trình công nghệ trên đây là chìa khóa quan trọng để mở ra sự bùng nổ ứng dụng công nghiệp vi nhân giống ở nước ta trong những năm tới [10]

Đối với tài nguyên cây thuốc việc bảo tồn có ý nghĩa hết sức quan trọng Nhiều loài cây thuốc đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng do khai thác quá mức Với những ưu thế của công nghệ nuôi cấy mô tế bào, việc ứng dụng vào bảo tồn nguồn gen cây thuốc đã được nhiều tác giả quan tâm như:

Năm 2006, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Phú Lịch và cs đã tiến hành

nhân giống Thanh hao hoa vàng bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro Nghiên cứu

cho thấy có thể sử dụng môi trường MS cơ bản hoặc môi trường MS bổ sung BAP 1,5 mg/l hay kinetin 1,5 mg/l để nhân giống cây Thanh hao hoa vàng, môi trường bổ sung NAA 0,3 mg/l là môi trường ra rễ thích hợp nhất [11] Trong một nghiên cứu khác về cây Thanh hao của tác giả Nguyễn Thị Kim Uyên và cs (2007) đã đề xuất môi trường thích hợp cho sự nhân chồi là LV có

bổ sung BAP 0,3 mg/l, môi trường thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh tế bào soma là LV + BA 0,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l [29]

Nghiên cứu nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh của tác giả Nguyễn Trung Thành và cs đã cho thấy môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 2,4-D

1 mg/l là tối ưu cho sự hình thành và phát triển mô sẹo của sâm Ngọc Linh; số

rễ bất định hình thành cao nhất và tăng trưởng tốt ở nồng độ IBA 2 mg/l; nồng độ đường 50 g/l là tối ưu cho sự sinh trưởng của rễ bất định [23]

Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thanh (2008) đã tiến hành

nhân giống vô tính in vitro cây Lô hội và thu được kết quả: Môi trường MS

bổ sung BAP 2,5 mg/l cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt Bổ sung than

hoạt tính 1,5 - 2 g/l cho khả năng ra rễ đạt cao nhất Giá thể ra cây Lô hội in vitro thích hợp là cát mịn, tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng phát triển tốt [22]

Tác giả Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư (2010) đã đưa ra môi trường

tái sinh chồi in vitro cây Ba kích tím là MS bổ sung kinetin 0,25 mg/l, môi

trường nhân chồi là MS bổ sung BAP 3,5 mg/l + IBA 0,2 mg/l, môi trường tạo rễ là MS bổ sung IBA 0,2 - 0,25 mg/l [27]

Vũ Thị Lan và cs (2011) đã đề xuất môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung để thu sinh khối là: SB1 (MS + NAA 2,0 mg/l + BAP 0,5 mg/l) và SB2 (MS + NAA 2,0 mg/l + 1,0 mg/l BAP); SK6 (MS + NAA 2,0 mg/l + kinetin 1,0 mg/l) và SK7 (MS + NAA 2,0 mg/l + kinetin 1,5 mg/l); SN9 (MS + NAA 2,0 mg/l + 10% nước dừa) và SN10 (MS + NAA 2,0 mg/l + 20% nước dừa) [9] Cũng thông qua giai đoạn mô sẹo

để nhân nhanh in vitro cây Hoắc hương, tác giả Vũ Thanh Sắc và cs đã đi đến

kết luận: Môi trường phù hợp nhất cho tạo mô sẹo từ lá và thân cây Hoắc hương là môi trường MS bổ sung 2,4-D 1,5 mg/l; nồng độ than hoạt tính thích

hợp nhất cho tạo mô sẹo từ lá hoắc hương in vitro là 0,5 g/l; môi trường tái

sinh chồi từ mô sẹo cây hoắc hương tốt nhất là MS bổ sung than hoạt tính 0,5 mg/l, kinetin 1,0 mg/l [18]

Nghiên cứu của Nguyễn Quang Thạch và cs đã cho thấy: môi trường

thích hợp nhất để thực hiện nhân nhanh in vitro Lan Kim Tuyến là Knud*

+ BAP 0,5 mg/l + kinetin 0,3 mg/l + NAA 0,3 mg/l + sucrose 20 g/l + nước dừa

100 ml/l + dịch chiết khoai tây 100 ml/l + agar 7g/l Môi trường thích hợp nhất cho sự hình thành rễ tạo cây hoàn chỉnh là: Knud*

+ IBA 0,5 - 1 mg/l hoặc NAA 1 mg/l + sucrose 20 g/l + nước dừa 100 ml/l + than hoạt tính 5% + agar 7g/l [24]

Kỹ thuật nhân giống cây Sa nhân tím của Nguyễn Văn Hồng và cs (2013) đã đi đến kết quả: Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 15 phút cho tỉ lệ mẫu sạch cao nhất; môi trường phù hợp cho quá trình nhân nhanh chồi là môi trường nền (MS + Đường 30 g/l + Agar 5,2 g/l + Inositol 100 mg/l) bổ sung BAP ở nồng độ 4 mg/l kết hợp với IAA ở nồng độ 0,1 mg/l; môi trường phù hợp cho quá trình ra rễ là môi trường nền (MS + Đường 30 g/l + Agar 5,2 g/l + Inositol 100 mg/l) bổ sung 0,1 mg/l IBA [6]

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ và bạc nitrat (AgNO3)

lên sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro của

Nguyễn Việt Cường và cs cho thấy dịch chiết chuối ở nồng độ 10 g/l, tảo spirulina ở nồng độ 5 mg/l và nước dừa ở tỉ lệ 5% tăng cường sự sinh trưởng

và phát triển của sâm Ngọc Linh Dịch chiết khoai tây ức chế khả năng sinh

trưởng của sâm Ngọc Linh in vitro Riêng AgNO3 làm tăng khả năng sinh

trưởng và phát triển in vitro của cây sâm Ngọc Linh ở nồng độ 2 mg/l [5]

Tác giả Vũ Thị Bạch Phượng và cs đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in vitro nguồn nguyên liệu có hoạt tính kháng oxi hóa của cây Thổ tam thất và

xác định được rễ in vitro của cây Thổ tam thất có hoạt tính kháng oxi hóa cao nhất, trong rễ in vitro có chứa nhóm hợp chất saponin và flavonoid, đồng thời

xác định được NAA 2 mg/l thích hợp cho sự tạo rễ ở cây Thổ tam thất [15]

Nhóm nghiên cứu của Ngô Thanh Tài đã tiến hành nghiên cứu tác động của ánh sáng đèn LED lên khả năng tăng sinh mô sẹo và sự hình thành cây hoàn chỉnh từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh và nhận thấy mô sẹo tăng sinh cao nhất khi được nuôi cấy dưới ánh sáng đèn LED vàng; ánh sáng đèn LED

đỏ và LED xanh dương được kết hợp với tỉ lệ 6R + 4B thích hợp cho sự hình

thành cây con từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro [21]

Tóm lại, hiện nay các tài liệu nghiên cứu về cây Vú bò rất hạn chế Theo “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của GS.TS Đỗ Tất Lợi (2004) thì chưa có tài liệu nào nghiên cứu về thành phần hóa học trong cây Vú bò Cây Vú bò là một vị thuốc chỉ được dùng theo kinh nghiệm dân gian Tuy vậy, ngày nay việc sử dụng các loại dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên thay thế cho các loại tân dược đã và đang được quan tâm rất lớn trong cộng đồng,

do tính ưu việt của dược phẩm thiên nhiên ít gây phản ứng phụ cho người bệnh Việc nghiên cứu, bảo tồn và phát triển các loại dược liệu, nhất là dược liệu hoang dại là một trong những lĩnh vực phát triển mạnh đi cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật Do đó việc nghiên cứu nhân giống cây Vú bò bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn Hi vọng trong thời gian tới sẽ có các nghiên cứu tìm hiểu sâu hơn để có thể xác định được loại, hàm lượng của các hợp chất hóa học trong cây và tác dụng chữa bệnh của nó Từ đó làm cơ sở cho việc phát triển, bảo tồn và ứng dụng nhiều hơn của cây Vú bò trong y học

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Sử dụng hạt giống cây Vú bò (Ficus simplicissima Lour.) thu thập tại

khu vực đồi thuộc thị trấn Trại Cau, huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên Hạt

giống còn tươi Hạt nhỏ, có màu vàng đậm

2.1.2 Hoá chất, thiết bị

Hoá chất

Các thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường

cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) [30]

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và thông dụng có nguồn gốc từ Đức, Trung Quốc như các chất kích thích sinh trưởng BAP, kinetin, NAA, đường sucrose, thạch, than hoạt tính, ethanol, NaOH…

Thiết bị

Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào: Bình tam giác 250ml, pipet, cốc thủy tinh định mức, đũa thủy tinh, bông, giấy làm nút, giấy thấm Bộ đồ cấy: dao cấy, que cấy, đĩa cấy, buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie (Mĩ), nồi khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy (Nhật), tủ sấy (Carbolite, Anh), máy đo pH, cân kĩ thuật, cân phân tích, bếp điện

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 5 năm 2013 đến tháng 4 năm 2014 tại phòng Công nghệ tế bào - Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro

2.2.1.1 Khử trùng hạt

Chọn quả Vú bò chín tím, không bị sâu bệnh Sau đó, loại bỏ lớp thịt quả, thu hạt và rửa hạt bằng nước sạch nhiều lần

Khử trùng box cấy và buồng cấy bằng đèn UV trong khoảng thời gian

45 - 60 phút, khử trùng bộ đồ cấy bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn

Hạt được đưa vào trong box cấy để khử trùng Hạt được lắc trong ethanol 70% trong khoảng thời gian 45 giây Tráng hạt 5 lần bằng nước cất khử trùng Tiếp tục lắc hạt trong dung dịch javen 60%, lắc đều trong khoảng thời gian 5, 10, 15, 20, 25 phút Sau đó rửa sạch hạt 5 lần bằng nước cất khử trùng Với công thức đối chứng hạt không được lắc trong ethanol và javen

Sau khi khử trùng, hạt được cấy lên môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l, agar 10 g/l, pH = 5,8

Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, 90 hạt/công thức

Đánh giá kết quả sau 30 ngày nuôi cấy Theo dõi các chỉ số sau:

+ Tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm

+ Tỉ lệ hạt nhiễm

+ Tỉ lệ hạt chết

+ Kích thước, hình thái mầm

2.2.1.2 Nghiên cứu môi trường nuôi cấy

Sau khi vào mẫu hạt thành công, thu được các cây con nảy mầm từ hạt Các đoạn thân mang chồi nách của các cây con nói trên được sử dụng làm vật liệu cấy trên môi trường nhân nhanh Để tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho nhân nhanh và tạo rễ Vú bò, chúng tôi đã bố trí các thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy Tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều sử dụng nền môi trường MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + nước

dừa 50 ml/l + than hoạt tính 1 g/l và chất kích thích sinh trưởng có nồng độ thay đổi

(1) Môi trường nhân chồi

Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ BAP, kinetin, tổ hợp BAP + NAA, tổ hợp kinetin + NAA, tổ hợp BAP + kinetin + NAA đến hệ số nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi: Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường nhân chồi bổ sung BAP với nồng độ từ 0,5 mg; 1,0 mg; 1,5 mg; 2,0 mg; 2,5

mg cho 1 lít môi trường hoặc kinetin với nồng độ từ 0,5 mg; 1,0 mg; 1,5 mg; 2,0 mg; 2,5 mg cho 1 lít môi trường hoặc cấy lên môi trường bổ sung tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP + NAA, kinetin + NAA, BAP + kinetin + NAA Đối chứng là môi trường MS cơ bản không bổ sung kích thích sinh trưởng Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Mỗi công thức nuôi cấy 30 mô, lặp lại 3 lần Kết quả được đánh giá sau 60 ngày nuôi cấy Theo dõi các chỉ số sau:

+ Hệ số nhân chồi

+ Chiều cao của chồi

+ Chất lượng chồi:

Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá xanh

Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi hơi gầy, lá xanh

Chồi sinh trưởng kém: Chồi gầy, lá xanh nhạt hoặc xoăn, chồi bị dị dạng

(2) Môi trường tạo cây hoàn chỉnh (môi trường tạo rễ)

Những chồi tạo ra trên môi trường nhân nhanh có từ 4 - 5 lá được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ bổ sung chất kích thích sinh trưởng NAA với nồng độ 0,1 mg; 0,3 mg; 0,5 mg; 0,7 mg trong 1 lít môi trường Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 chồi, lặp lại 3 lần Kết quả được đánh giá sau 30 ngày Theo dõi các chỉ số sau: