Kết quả đạt được của đềtài: - Đã tách dòng và xác định trình tự thành công các đoạn gen CP, Nib của PRSV; CP, CPm và RDRP củaCTV. - Hoàn thiện quy trình đánh giá cây chuyển gen kháng virus trong phòng thí nghiệm và ngoài nhà lưới. - Tạo ra các dòng cây chuyển gen có triển vọng để phát triển thành giống. Tuy đã được một số kếtquả ban đầu đáng ghi nhận, nhưng để ứng dụng vào thực tiễn, TS. Chu Hoàng Hà vàcác cộng sự vẫn còn thực hiện một số công đoạn tiếp theo về khảo nghiệm giống biến đổi gen theo các quy định của pháp luật và hiện nay Việt Nam chưa có hành lang pháp lý hoàn chỉnh cho phép chúng ta sử dụng các sản phẩm biển đổi gen. Dođó các nghiên cứu này cần phải được tiếp tục thực hiện các bước tiếp theo trước khi đến được tay bà con nông dân. Điều này là tất yếu không thể tránh khỏi, bởi giống cây nào, dù được chăm sóc tốt, cũng chỉ có một ngưỡng giới hạn về năng xuất và khả năng kháng bệnh. Nên nếu không áp dụng các côngnghệ sinh học mới nhất, sẽ khó có thể tạo được hiệu quả kinh tế cao. PGS TS Chu Hoàng Hà và cộng sự hy vọng, kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ tiếp tục được phát triển, được đem khảo nghiệm rộngrãi trên các cánh đồng, để có những đánh giá và nhân rộng, đem lại ấm no cho người nông dân
BỘ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC04 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG CÂY ĂN QUẢ KHÁNG BỆNH VIRUS PHỔ RỘNG BẰNG CHUYỂN GEN ĐA ĐOẠN Mã số: KC.04.03/06-10 Chủ nhiệm đề tài: TS Chu Hoàng Hà Thư ký đề tài: TS Lê Văn Sơn BỘ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC04 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG CÂY ĂN QUẢ KHÁNG BỆNH VIRUS PHỔ RỘNG BẰNG CHUYỂN GEN ĐA ĐOẠN Mã số: KC.04.03/06-10 Chủ nhiệm đề tài: TS Chu Hồng Hà Cơ quan chủ trì: Viện Cơng nghệ sinh học Địa chỉ: Nhà A10, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội Điện thoại: 37562368 E-mail: chuhoangha@ibt.ac.vn Hà Nội, 2010 BỘ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC04 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG CÂY ĂN QUẢ KHÁNG BỆNH VIRUS PHỔ RỘNG BẰNG CHUYỂN GEN ĐA ĐOẠN Mã số: KC.04.03/06-10 Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài TS Chu Hồng Hà Ban chủ nhiệm Chương trình Bộ Khoa học Cơng nghệ Hà Nội, 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10 Lờii cảm ơn Lờ cảm ơn Chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm ơn Văn phòng Các chương trình trọng điểm cấp Nhà nước, Bộ Khoa học Cơng nghệ, Ban Chủ nhiệm Chương trình KC04, Viện Nghiên cứu Rau quả, Viện Nghiên cứu ăn miền Nam, Viện Bảo vệ thực vật, Phịng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen tham gia hỗ trợ cơng trình nghiên cứu CƠ QUAN CHỦ TRÌ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI TS Chu Hoàng Hà Thời gian thực 2007 - 2010 i Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10 CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D Dichlorophenoxy acetic acid bp base pair BAP Benzyladenine purin BSA Bovine serum albumin CaMV35S- P Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotor cDNA Complementary DNA CP Coat protein CPm Minor coat protein CTV Citrus tristeza virus ĐBSCL Đồng sông Cửu Long DNA Deoxyribonucleic acid dNTP deoxyribonucleotide EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay=Phản ứng miễn dịch liên kết enzyme gus IBA β-Glucuronidase gene = gen mã hoá β-Glucuronidase Indole-3-butyric Acid IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside Kb Kilobase Km Kanamycine LB Luria and Bertani MS Môi trường nuôi cấy theo Murashige & Skoog NAA Napthye Acetic Acid Nib Nuclear Inclusion Protein b nptII Neomycine phosphotransferase II gene=Gen mã hóa neomycine phosphotransferase II PBS Phosphate buffer saline PBST Phosphate buffer saline with 0.05 % Tween20 PCR Polymerase Chain Reaction PRSV Papaya ring spot virus RdRp RNA RNA-dependent RNA polymerase Ribonucleic Acid RNAi RNA interference RT-PCR Reverse transcription PCR T-DNA Transfer-DNA=DNA chuyển X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide Thời gian thực 2007 - 2010 ii Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10 MỤC LỤC Lời cảm ơn Báo cáo thống kê ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây đu đủ bệnh đốm vòng 1.1.1 Giới thiệu chung đu đủ 1.1.2 Giới thiệu bệnh đốm vòng virus gây bệnh đốm vòng 1.1.3 Tình hình nghiên cứu tạo đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng 1.1.4 Hiện trạng sản xuất nghiên cứu đu đủ 10 1.2 Cây cam quýt bệnh tàn lụi 11 1.2.1 Giới thiệu chung nhóm cam quýt 11 1.2.2 Giới thiệu bệnh tàn lụi virus gây bệnh tàn lụi 14 1.2.3 Tình hình nghiên cứu tạo cam quýt kháng bệnh tristeza 18 1.2.4 Hiện trạng sản xuất nghiên cứu ăn có múi 19 1.3 Tạo trồng chuyển gen sử dụng kỹ thuật RNAi (RNA interference) sử dụng gen “đa đoạn” nhân tạo để tạo tính kháng phổ rộng 21 1.3.1 Lịch sử phát chế RNAi 21 1.3.2 Cơ chế hoạt động RNAi thực vật 24 1.3.3 Ứng dụng RNAi nghiên cứu tạo trồng kháng bệnh virus 28 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Phương pháp phát bệnh 34 2.1.1 Các phương pháp phát virus tristeza (CTV) 34 2.1.2 Phương pháp phát PRSV 39 2.2 Phương pháp phân lập gen 39 2.2.1 Phương pháp thiết kế mồi 39 2.2.2 Phương pháp tách dòng 40 2.2.3 Phương pháp thống kê xử lý số liệu trình tự gen 40 2.3 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen đa đoạn 40 2.3.1 Thiết kế gen đa đoạn gen CP, Nib HC-pro PRSV 40 2.3.2 Thiết kế Ti-vector mang đa đoạn gen CP, Nib HC-pro PRSV 43 Thời gian thực 2007 - 2010 iii Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10 2.3.3 Thiết kế gen nhân tạo mang đa đoạn gen RdRp-CP-p20-p23 CTV 45 2.3.4 Thiết kế Ti-vector mang đa đoạn gen RdRp-CP-p20-p23 RdRp-CP CTV 46 2.4 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật chuyển gen thông qua Agrobacterium 47 2.4.1 Nuôi cấy mô tế bào chuyển gen đu đủ 47 2.4.2 Nuôi cấy mô tế bào chuyển gen cam quýt 49 2.5 Phương pháp phân tích chuyển gen 53 2.5.1 Phân tích chuyển gen qui mơ phịng thí nghiệm 53 2.5.2 Phương pháp đánh giá chuyển gen nhà lưới 60 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 63 3.1 Kết phân lập thiết kế gen 63 3.1.1 Kết thu mẫu bệnh đốm vòng đu đủ Tristeza cam quýt 63 3.1.2 Kết tách dịng phân tích trình tự gen PRSV 71 3.1.3 Phân lập phân tích gen CTV 96 3.1.4 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi gen đa đoạn PRSV 120 3.1.5 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi gen đa đoạn CTV 131 3.2 Kết tạo đu đủ chuyển gen kháng PRSV 143 3.2.1 Kết xây dựng quy trình chuyển gen vào đu đủ thông qua phôi soma 143 3.2.2 Kết tạo đu đủ chuyển gen mang cấu trúc gen đa đoạn CP-Nib-HCpro 151 3.2.3 Đánh giá dòng đu đủ chuyển gen 155 3.3 Kết tạo cam, quýt chuyển gen kháng CTV 161 3.3.1 Kết xây dựng quy trình chuyển gen vào có múi thơng qua Agrobacterium 161 3.3.2 Kết tạo cam, quýt mang cấu trúc gen RdRp-CP-p20-p23 CTV 188 3.3.3 Kết đánh giá dòng cam, quýt chuyển gen 199 3.4 Thảo luận kết nghiên cứu 201 3.4.1 Kết xây dựng quy trình chuyển gen vào có múi thơng qua Agrobacterium 161 3.4.2 Kết tạo cam, quýt mang cấu trúc gen RdRp-CP-p20-p23 CTV 188 3.4.3 Kết đánh giá dòng cam, quýt chuyển gen 199 3.4.4 Xây dựng quy trình chuyển gen cho đối tượng nghiên cứu………… 206 3.4.5 Tạo đu đủ chuyển gen đánh giá tính kháng PRSV 206 3.4.6 Tạo cam, quýt chuyển gen đánh giá tính kháng CTV 207 3.4.7 Tổng kết kết đánh giá dòng chuyển gen 208 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Thời gian thực 2007 - 2010 210 iv Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10 4.1 Kết luận 210 4.2 Kiến nghị 213 TÀI LIỆU THAM KHẢO 214 PHỤ LỤC Thời gian thực 2007 - 2010 v Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10 MỤC LỤC BẢNG Bảng 1.1: Sản lượng đu đủ giới năm 2002-2004 Bảng 1.2: Vùng phân bố tập trung đu đủ Việt Nam 10 Bảng 1.3: Sản lượng có múi giới năm 2001-2003 12 Bảng 1.4: Một số bệnh cam quýt 13 Bảng 1.5: Diện tích sản lượng cam quýt Việt Nam năm 2007 19 Bảng 1.6: Các loại vector RNAi sử dụng công nghệ Gateway 29 Bảng 2.1: Thành phần phản ứng gắn gen vào vector pBT 41 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng gắn gen đa đoạn vào vector pENTRTM 43 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng LR 44 Bảng 2.4: Kích thước phân đoạn cắt plasmid tái tổ hợp XbaI/HindIII 47 Bảng 2.5: Thành phần môi trường nuôi cấy đu đủ 48 Bảng 2.6: Thành phần môi trường nuôi khuẩn 48 Bảng 2.7: Thành phần môi trường nuôi cấy cam, quýt 50 Bảng 3.1: Danh sách vùng thu mẫu PRSV cho kết dương tính 65 Bảng 3.2: Danh sách vùng thu mẫu CTV kết dương tính 70 Bảng 3.3: Danh sách trình tự nucleotide gen CP PRSV phân lập 73 Bảng 3.4: Hệ số tương đồng gen CP mức độ nucleotide dòng PRSV Việt Nam 75 Bảng 3.5: Hệ số tương đồng CP mức độ amino acid dòng PRSV Việt Nam 76 Bảng 3.6: Danh sách trình tự nucleotide gen Nib PRSV-P phân lập 82 Bảng 3.7: Hệ số tương đồng gen Nib mức độ nucleotide 83 Bảng 3.8: Hệ số tương đồng gen Nib mức độ amino acid 84 Bảng 3.9: Mồi sử dụng cho RT-PCR nhân dòng vùng genome RNA PRSV 86 Bảng 3.10: Hệ số tương đồng trình tự nucleotide chủng PRSV Việt Nam với chủng PRSV khác giới 89 Bảng 3.11: Mức độ tương đồng trình tự amino acid chủng PRSV Việt Nam với chủng PRSV khác giới 90 Bảng 3.12: Đặc điểm số dòng CTV sử dụng để tách dịng gen 97 Bảng 3.13: Trình tự mồi sử dụng nhân đoạn gen CTV 99 Bảng 3.14: Danh sách trình tự A, F, C, P CTV phân lập 100 Bảng 3.15: Danh sách trình tự nucleotide tồn gen CP CPm CTV phân lập 108 Bảng 3.16: Danh sách đoạn gen genome CTV phân lập 115 Bảng 3.17: Trình tự cặp mồi tách dòng gen CP CPm 116 Bảng 3.18: Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D tới khả tạo mô sẹo phôi đu đủ 143 Bảng 3.19: Xác định thời gian siêu âm thích hợp chuyển vào phơi soma đu đủ 146 Bảng 3.20: Xác định ngưỡng nồng độ kanamycin thích hợp cho chọn lọc 148 Bảng 3.21: Xác định mật độ khuẩn thích hợp cho chuyển gen 149 Thời gian thực 2007 - 2010 vi Báo cáo Tổng kết đề tài KC04.03/06-10 Bảng 3.22 Hiệu suất chuyển gen phôi soma 151 Bảng 3.23: Kết chuyển gen CP-Nib-HcPro vào phôi soma đu đủ 153 Bảng 3.24: Thí nghiệm tính kháng virus với dịng đu đủ Lạng Sơn T0 156 Bảng 3.25: Ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng đến khả tạo mơ sẹo cam Sành 162 Bảng 3.26: Ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng đến khả tạo mơ sẹo qt Đường canh 163 Bảng 3.27: Kết tạo mô sẹo ba loại môi trường khác 164 Bảng 3.28: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng tới khả tạo cụm chồi 166 Bảng 3.29: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng BAP tới khả tạo đa chồi cam Sành bổ dọc thân 167 Bảng 3.30: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng tới khả rễ quýt Đường Canh 169 Bảng 3.31: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng tới khả rễ 171 Bảng 3.32: Ảnh hưởng giá thể tới khả tái sinh 173 Bảng 3.33: Ảnh hưởng Km tới khả sống sót quýt Đường Canh 176 Bảng 3.34: Ảnh hưởng Km tới khả sống sót cam Sành 177 Bảng 3.35: Ảnh hưởng mật độ Agrobacterium tới hiệu chuyển gen 178 Bảng 3.36: Ảnh hưởng môi trường lây nhiễm khuẩn tới khả chuyển gen 180 Bảng 3.37: Ảnh hưởng nồng độ sucrose tới hiệu chuyển gen 182 Bảng 3.38: Ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn tới khả chuyển gen 184 Bảng 3.39: Kết phân tích chuyển gen gus 187 Bảng 3.40: Kết chuyển gen vào quýt Đường Canh 190 Bảng 3.41: Kết chuyển gen cam Xã Đoài 192 Bảng 3.42: Kết chuyển gen vào cam Sành 192 Bảng 3.43: Kết đánh giá mức độ nhiễm bệnh Tristeza số dòng cam 195 Bảng 3.44: Kết đánh giá mức độ nhiễm bệnh Tristeza số dòng quýt 200 Bảng 3.45: Tổng kết kết phân tích chuyển gen phịng thí nghiệm ngồi nhà lưới 208 Thời gian thực 2007 - 2010 vii Báo cáo tóm tắt kết thực đề tài KC04.03/06-10 thấy CTV virus có độ đa dạng cao khả tái tổ hợp dòng virus với để tạo chủng virus cao đặc biệt chủng VL1 Vì vậy, để nghiên cứu sâu virus CTV, tiến hành phân lập toàn genome VL1 3.1.3.5 Biểu CP CPm E coli Rossetta gami™ Gen CTV-CP CTV-CPm tách dòng biểu tế bào E coli Rosetta-gamiTM với điều kiện tối ưu 1mM IPTG 37oC CTV-CP CTV-CPm biểu chủ yếu pha cặn tế bào có kích thước tương ứng 25 kDa 27 kDa Dựa vào tính tan protein điểm thuận lợi kháng nguyên vỏ tái tổ hợp CTV tinh CTV-CP CTV-CPm, đạt tiêu chuẩn để phục vụ cho bước sản xuất kháng thể (hình 13) Hình 11: Kết Hình 12: Kết điện di sản phẩm Hình 13 Kết điện di điện colony-PCR dòng khuẩn lạc sản phẩm tinh protein biến nạp gen CP CPm CP di sản phẩm PCR tách dòng gen CP CPm: Thang CPm gel polyacrylamide DNA 1kb 3.1.4 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi gen đa đoạn PRSV 3.1.4.1 Kết thiết kế gen nhân tạo mang đa đoạn gen cp, HCpro, Nib dòng PRSV Sử dụng phần mềm DNAstar chọn vùng có độ bảo thủ cao gen CP, Nib, HC-pro để thiết kế cặp mồi đặc hiệu Sau thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu, tiến hành nhân đoạn gen CP, Nib HC-pro PCR (hình 14) Sau đoạn gen nối với phương pháp PCR gắn vào vector để đọc trình tự lưu giữ phục vụ cho thí nghiệm thiết kế tạo vector chuyển gen cấu trúc RNAi (hình 15) Hình 14: Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen CP, Nib, Hcpro Hình 15: Kết PCR gắn gen đa đoạn CPNib CP-Nib-Hcpro 14 Báo cáo tóm tắt kết thực đề tài KC04.03/06-10 3.1.4.2 Kết tạo Ti-vector mang cấu trúc RNAi đoạn gen nhân tạo CP, Nib Hc-pro Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen đa đoạn: mồi PRSV-CP-Fi PRSV-HC-Ri khuôn DNA vector pBT mang gen đa đoạn PRSV, nhân thành công đoạn gen đa đoạn CP-Nib-HCpro CP-Nib (hình 16)và gắn đoạn gen đa đoạn vào vector pENTR (hình 17) Tiến hành phản ứng LR gắn gen đa đoạn vào pK7GWIWG2(II) Hình 16: Kết điện di sản Hình 17: Kết điện di Hình 18: Kết điện di phẩm PCR nhân gen đa đoạn colony-PCR dòng colony-PCR CP-Nib CP-Nib-HCpro E.coli biến nạp pENTR/CP- Agrobacterium Nib-Hcpro; pENTR/CP-Nib pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro dòng biến nạp Các vector pK7GWIWG2(II)/CP-Nib pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro biến nạp vector vào tế bào A tumefaciens pGV2260 Các dòng vi khuẩn Agrobacterium mang vector chuyển gen chứa cấu trúc lưu giữ cho nghiên cứu tạo cam quýt chuyển gen 3.1.5 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi gen đa đoạn CTV 3.1.5.1 Thiết kế gen nhân tạo mang đa đoạn gen cp, p20, p23 RdRp dòng CTV Sử dụng phần mềm BioEdit chọn vùng có độ bảo thủ cao gen cp, p20, p23 RdRp để thiết kế cặp mồi đặc hiệu Sau thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu, tiến hành nhân đoạn gen cp, p20, p23 RdRp PCR (hình 19) Sau đoạn gen nối với phương pháp PCR gắn vào vector để đọc trình tự lưu giữ phục vụ cho thí nghiệm thiết kế tạo vector chuyển gen cấu trúc RNAi (hình 20, 21) Hình 19: Kết Hình 20: Kết điện Hình Kết Hình 22: Kết điện điện di sản di sản phẩm PCR nối điện di sản di sản phẩm colony- phẩm PCR bốn phân đoạn gen phẩm PCR nối PCR từ khuẩn lạc E.coli đoạn gen RdRp, phân đoạn gen Top10 mang cấu trúc CP, p20, p23 RdRp, pK7GWIWG2(II)/RdRp p23 21: CP, p20 -CP-p20-p23 15 Báo cáo tóm tắt kết thực đề tài KC04.03/06-10 3.1.5.2 Thiết kế Ti-vector mang đoạn gen nhân tạo RdRp, CP, p20, p23 virus CTV Hai đoạn gen đa đoạn nối vào vector pENTR để tiến hành gắn gen đa đoạn vào pK7GWIWG2(II) phản ứng LR Các vector pK7GWIWG2(II)/RdRp-CP-p20-p23 pK7GWIWG2(II)/RdRp-CP biến nạp vector vào tế bào A tumefaciens pGV2260 Các dòng vi khuẩn Agrobacterium mang vector chuyển gen chứa cấu trúc lưu giữ cho nghiên cứu tạo cam quýt chuyển gen 3.2 Kết tạo đu đủ chuyển gen kháng PRSV 3.2.1 Kết xây dựng quy trình chuyển gen vào đu đủ thông qua phôi soma 3.2.1.1 Nghiên cứu hệ thống tạo mô sẹo tái sinh đu đủ Khả tạo mô sẹo giống đu đủ Lý Nhân Lạng Sơn thử nghiệm nồng độ 2,4-D khác Kết cho thấy sau tuần mô sẹo phát triển tốt nồng độ 10 mg/l 2,4-D, với tỷ lệ 95-98% Các cụm mô sẹo phát triển tốt môi trường tạo phôi chứa mg/l 2,4-D Sau khoảng tháng, thu lượng phơi lớn Khoảng 20% số phơi có khả nẩy mầm môi trường tạo phôi Tuy nhiên, số chồi bình thường thu từ g phơi khoảng 30 – 40 Các chồi bình thường chuyển sang mơi trường có chứa g/l casamino acid Sau tuần, 22% chồi hình thành rễ Sau tuần, chồi đơn phát triển thành hoàn chỉnh, điều kiện nhà lưới (hình 23) 3.2.1.2 Tối ưu quy trình chuyển gen vào đu đủ thơng qua Agrobacterium Các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu chuyển gen thời gian siêu âm tạo vết thương phơi đu đủ; ngưỡng nồng độ Km thích hợp cho chọn lọc; mật độ khuẩn thích hợp cho chuyển gen tối ưu hóa Kết nhận thời gian siêu âm thích hợp tạo vết thương phơi đu đủ 50 giây, nồng độ Km thích hợp cho chọn lọc chuyển gen 50 mg/l, mật độ khuẩn thích hợp cho chuyển gen OD600 = 0,5 Hình 23 Một số hình ảnh tái sinh đu đủ Hình 24: Một số hình ảnh quy trình qua phơi soma biến nạp gen 3.2.2 Kết tạo đu đủ chuyển gen mang cấu trúc gen đa đoạn CP-NibHCpro Phôi soma giống đu đủ Lạng Sơn Lý Nhân dùng để biến nạp cấu trúc 16 Báo cáo tóm tắt kết thực đề tài KC04.03/06-10 gen RNAi CP-Nib-Hcpro quy trình biến nạp tối ưu Kết cho thấy giống đu đủ Lạng Sơn tỷ lệ chuyển gen trung bình đạt từ 0,3 đến 0,57%, tổng số thu 23 dòng mang gen chuyển Ở giống đu đủ Lý Nhân thu tỷ lệ chuyển gen cao gấp đôi so với giống Lạng Sơn (1,26 %) số chuyển gen thu 19 Các dòng đu đủ tách chiết DNA tiến hành phản ứng PCR kiểm tra có mặt gen chuyển Kết cho thấy có 23 dòng đu đủ chuyển gen đa đoạn PRSV hệ T0 xuất băng dự đoán khoảng 314 bp 3.2.3 Đánh giá dòng đu đủ chuyển gen 3.2.3.1 Kết thử tính kháng virus với dịng đu đủ chuyển gen T0 Chúng tơi dùng phương pháp gây bệnh nhân tạo để đánh giá tính kháng PRSV dòng đu đủ chuyển gen T0 Sau tuần lây nhiễm, kết cho thấy 4/23 dòng đu đủ Lạng Sơn chuyển gen A19, B1, B38, D10 khơng có biểu nhiễm bệnh Các dịng kiểm tra virus elisa, cho thấy hồn tồn khơng có virus (hình 25) 3.2.3.2 Kết lai Southern Dựa kết đánh giá tính kháng bệnh dòng đu đủ chuyển gen T0, chúng tơi lựa chọn 10 dịng có biểu bệnh nhẹ hồn tồn kháng bệnh để phân tích southern Hình 26 cho thấy, dịng có vị trí cấu trúc gen chuyển chèn vào hệ gen Các dòng chuyển gen lại có băng DNA, đối chứng hồn tồn khơng có vạch 3.3.2.1 Kết lai Nothern Chúng sử dụng gen chọn lọc nptII nằm cấu trúc gen chuyển vào để kiểm tra mức độ biểu Kết lai hình 27 cho thấy sản phẩm phiên mã dòng B3, B38 D27 biểu mạnh nhất, dịng cịn lại gen nptII biểu mức trung bình yếu ĐC Hình 25: Cây đu đủ chuyển gen thử tính 10 Hình DNA gemone đu đủ kiểm tra biểu gen nptII Lai Hình 26: Ảnh phim lai Southern kháng virus PRSV 27: dòng Nothern đu đủ chuyển gen 3.3 Kết tạo cam, quýt chuyển gen kháng CTV 3.3.1 Kết xây dựng quy trình chuyển gen vào có múi thơng qua Agrobacterium 3.3.1.1 Tái sinh thơng qua tạo mơ sẹo Mơi trường MS có bổ sung tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng 2,4D BAP 17 Báo cáo tóm tắt kết thực đề tài KC04.03/06-10 thử khả tạo mô sẹo quýt Đường Canh, cam Sành Kết cho thấy công thức MC2(3 mg/l 2,4 D, 0,75 mg/l BAP), MC3 (3 mg/l 2,4 D, 0,75 mg/l BAP) tạo mơ sẹo có chất lượng tốt cho cam Sành quýt đường Canh tương ứng 3.3.1.2 Tái sinh thông qua tạo đa chồi Thân mầm tạo đa chồi mơi trường tạo chồi CT1 có chứa từ BAP 0,5-3 mg/l Sau - ngày, tỷ lệ mẫu quýt Đường Canh tạo chồi dao động từ 12,5 - 82,7 %, cao công thức CT1b; cam Xã Đoài 58,5-91,3 %, cao công thức CT1r Với cam Sành 11,2% - 82,5%; cao cơng thức CT1l Ngồi nhận thấy thân mầm quýt Đường Canh 6-7 tuần tuổi, cam Sành cam Xã Đoài tuần tuổi cho 100 % mảnh cấy tạo chồi, số chồi trung bình cao chồi phát triển nhanh môi trường tái sinh Các chồi sau tạo môi trường đa chồi chuyển sang môi trường kéo dài chồi với có mặt NAA GA3 giúp chồi đơn phát triển đồng đều, chất lượng tốt Sau - tuần chồi đơn đảm bảo cho việc tách khỏi cụm chồi chuyển sang môi trường tạo rễ Môi trường MS bổ sung 0,2-1,5 mg/l NAA sử dụng tạo rễ quýt Đường Canh, cam Sành, cam Xã đoài Kết nhận thấy với quýt đường Canh môi trường CT3b chứa 0,2 mg/l NAA; với cam Sành cam Xã đoài môi trường CR2; chứa 0,5mg/l NAA cho tỷ lệ rễ cao, chất lượng rễ tốt, đảm bảo cho việc Cơng thức giá thể thích hợp cho ba giống cam quýt vườn ươm ½ cát vàng + ½ trấu hun 3.3.1.3 Kết xây dựng qui trình chuyển gen có múi thơng qua tạo đa chồi Các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu chuyển gen ngưỡng nồng độ Km cho chọn lọc, mật độ khuẩn, môi trường lây nhiễm Agrobacterium, áp suất thẩm thấu mẫu nuôi cấy thời gian nhiễm khuẩn ảnh hưởng tới hiệu chuyển gen tối ưu hóa sử dụng gen thị gus Kết nhận thấy ngưỡng nồng độ Km thích hợp cho chọn lọc cam quýt chuyển gen 100 mg/l; mật độ khuẩn thích hợp OD600 = 0,5-0,75; môi trường MS bổ sung 3% sucrose xác định môi trường lây nhiễm Agrobacterium tốt nhất; môi trường MS bổ sung 8% sucrose làm môi trường cảm ứng mẫu nuôi cấy; thời gian nhiễm khuẩn tối ưu cho qui trình chuyển gen vào thân mầm quýt Đường Canh cam Sành 10 phút cam Xã Đoài 25-30 phút A B C Hình 28: Biểu gen gus chuyển gen 18 Báo cáo tóm tắt kết thực đề tài KC04.03/06-10 3.3.2 Kết tạo cam, quýt mangcấu trúc gen RdRp-CP-p20-p23 CTV 3.3.2.1 Kết tạo quýt Đường Canh chuyển gen Quá trình chuyển gen đa đoạn RdRd – Cp – p20 – p23 CTV gen chọn lọc nptII vào thân mầm quýt thông qua A tumefaciens CV58 pGV2260 thực theo bước tối ưu hóa (phần 3.3.1) Từ 1500 mảnh thân, nhận 960 mảnh có tạo đa chồi, chiếm tỷ lệ bật chồi 64 % Các chồi sau hồn thiện mơi trường tạo chồi cắt khỏi mảnh thân mầm chuyển sang môi trường chọn lọc, tuần lại chuyển sang mơi trường Những chồi cịn sống sót mơi trường chọn lọc sau tuần phần ghép lên gốc bưởi để chúng phát triển nhanh, phần chuyển sang môi trường phát triển chồi kích thích rễ Kết nhận 130 chồi sống sót phát triển tốt gốc ghép, chiếm tỷ lệ 87 % Khi xuất 3-4 nhà lưới, tiên hành tách chiết DNA để phân tích có mặt gen biến nạp phương pháp PCR Kết cho thấy 21/235 dòng có sản phẩm PCR băng vạch có kích thước tương đương với kích thước lý thuyết đoạn gen đa đoạn khoảng 653 bp (hình 29) Hiệu chuyển gen quýt Đường Canh 1,4 % Hình 29: Hình ảnh minh họa bước chuyển gen đa đoạn vào cam quýt 3.3.2.2 Kết tạo cam Xã Đoài chuyển gen Kết chuyển gen đa đoạn CTV vào đoạn thân mầm cam nhận 3714/5314 đoạn thân có tạo đa chồi, chiếm tỷ lệ 69,9 % Sau tuần môi trường rễ, số chồi tự rễ đạt 639/2130 chồi chiếm 30% Cây hoàn thiện chuyển giá thể huấn luyện điều kiện nhà lưới Trong 1491 chồi, số chồi không tự rễ ghép gốc bưởi có 1238 chồi sống sót phát triển tốt, chiếm 83 % Tỷ lệ sống sót giá thể TN2 đạt 89 % Sử dụng phương pháp PCR phân tích có mặt gen chuyển, kết cho thấy 147/1587 dòng xuất băng DNA có kích thước tương đương đoạn gen đa đoạn, chiếm tỷ lệ 9,26 % Hiệu chuyển gen cam Xã Đoài 2,77 % 3.3.2.3 Kết tạo cam Sành chuyển gen Từ 1322 mẫu ban đầu thu nhận 81 chồi cam Sành sống sót mơi trường chọn lọc, đạt tỉ lệ 5,64 % Trong số 79 sinh trưởng phát triển tốt điều kiện nhà lưới có 32 cho kết dương tính với phản ứng PCR kiểm tra có mặt cấu trúc gen chuyển đạt hiệu suất 2,4% 3.3.3 Kết đánh giá dòng cam, quýt chuyển gen 3.3.3.1 Đánh giá cam Xã Đoài chuyển gen a Đánh giá tính kháng virus dịng cam Xã Đồi chuyển gen 34/147 dịng cam Xã Đồi khẳng định có mang cấu trúc gen chuyển 19 Báo cáo tóm tắt kết thực đề tài KC04.03/06-10 PCR, sử dụng đánh giá tính kháng virus CTV Chúng ghép mắt chứa mầm bệnh virus lên chuyển gen sau đánh giá xuất virus sau 15, 30, 45, 60, 90, 120 ngày Trong số dòng kiểm tra sau 60 ngày sau lây nhiễm nhân tạo, dòng XĐ1-1 XĐ1-15-3 hồn tồn chưa có xuất virus, dòng lại bắt đầu nhiễm virus có mức độ từ nhẹ đến trung bình Tuy nhiên để khẳng định tính kháng CTV dịng chuyển gen cịn cần phải có nghiên cứu quy mơ với thời gian dài b Kết lai Southern Dựa kết đánh giá khả kháng virus, dòng biểu khả kháng tốt bị nhiễm nhẹ (XĐ1-1, XĐ1-15-3, XĐ1-72, XĐ2-3, XĐ2-81, XĐ3-39) chọn để tiến hành phân tích lai southern Kết phim (hình 30) cho thấy: đối chứng (hàng 8) hoàn tồn khơng xuất băng vạch DNA Ở dịng chuyển gen có xuất băng với kích thước khác (hàng 1, 2, 3, 4, 6) Kết có nghĩa dịng có cấu trúc gen đa đoạn chèn vào hệ genome vị trí khác Có thể có (một vị trí chèn) cấu trúc gen đa đoạn So sánh với kết lây nhiễm nhân tạo thấy dịng XĐ1-1, XĐ1-15-3 có tính kháng virus tốt nhất, giống kết phân tích southern So sánh với kết đánh giá PCR trước kết luận có tương đồng cao phương pháp phân tích c Đánh giá biểu gen nptII mức độ RNA Các dòng cam chuyển gen tiếp tục kiểm tra biểu gen mức độ mRNA Tuy nhiên, cấu trúc gen đa đoạn chuyền vào phiên mã biểu tạo dạng RNA hình kẹp tóc bị phân cắt thành phân tử nhỏ Do chúng tơi lựa chọn giải pháp phân tích biểu gen kháng Km (nptII) nằm cấu trúc gen chuyển vào cam để thay Kết hình 31 cho thấy xuất băng vạch RNA dòng chuyển gen (hàng 1, 2, 3, 4, 6) Như vậy, gen nptII chuyển gen phiên mã tạo sản phẩm mRNA với mức độ biểu khác dịng chuyển gen Hình 30: Lai Southern DNA gemone dịng cam Xã Đồi Hình 31: Lai Nothern kiểm tra biểu gen nptII dịng cam Xã Đồi chuyển gen 3.3.3.1 Đánh giá quýt Đường Canh chuyển gen a Đánh giá tính kháng virus dịng qt Đường Canh Tương tự cam Xã Đồi, 21 dịng qt Đường canh chuyển gen đánh giá tính 20 Báo cáo tóm tắt kết thực đề tài KC04.03/06-10 kháng CTV Sau 60 ngày lây nhiễm, có dịng QC83 QC89 khơng tìm thấy virus Các dịng cịn lại phát thấy virus Tuy nhiên dòng sinh trưởng phát triển tốt điều kiện nhà lưới, chưa biểu triệu chứng bệnh bên Vì cần phải theo dõi thêm giai đoạn tháng, tháng, tháng để có kết luận xác tính kháng bệnh dịng quýt chuyển gen b Kết lai Southern dòng (QC22, QC37, QC83, QC89, QC91) đối chứng khơng chuyển gen chọn để phân tích lai southern Kết phim lai DNA (hình 32) cho thấy: đối chứng hồn tồn khơng xuất băng vạch DNA Ở dòng chuyển gen QC22, QC37, QC83, QC89 xuất băng DNA, dòng QC91 xuất băng DNA Kết có nghĩa dịng tương ứng có vị trí cấu trúc gen đa đoạn chèn vào hệ gen M ĐC ĐC Hình 32: Lai Southern DNA gemone quýt Đường Canh 21 Báo cáo tóm tắt kết thực đề tài KC04.03/06-10 TỔNG QUÁT HÓA KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC Trong thời gian 40 tháng từ 1/2007 đến hết tháng năm 2010, đề tài KC.04.03/0610 hoàn thành tốt kết đăng ký hợp đồng KH & CN với Ban chủ nhiệm KC.04.03 Các kết thống kê qua bảng sau: TT Nội dung Đăng ký Đã đạt Kết Các đoạn gen CP, Nib PRSV 20-30 đoạn gen 28 CP; Nib genome Vượt ký đăng Các đoạn gen CP, CPm RDRP CTV 20-30 đoạn gen 28 CP; CPm RdRP; 18 p20; 35 p349; genome Vượt ký đăng Các đoạn mang đa diện PRSV Nam 2-4 gen nhân tạo 04 Đạt Các vector chuyển gen có mang gen nhân tạo tổng hợp 4-8 Ti-vector 04 Đạt Các dịng chuyển gen có triển vọng để phát triển thành giống 2-3 dòng đu đủ; 1-2 dòng cam quýt có triển vọng để phát triển thành giống dịng đu đủ chuyển gen đa đoạn có tính kháng PRSV, dịng qt đường Canh, dịng cam xã Đồi chuyển gen âm tính với virus CTV sau 60 ngày lây nhiễm Vượt ký Quy trình chuyển gen thơng qua Agrobacterium cho đu đủ 01 01 Đạt Quy trình chuyển gen thơng qua Agrobacterium cho cam, quýt 01 01 Đạt Quy trình đánh giá chuyển gen phịng thí nghiệm nhà lưới 01 01 Đạt Bài báo khoa học 5-10 Đạt 01 giải pháp hữu ích quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium cho cam, quýt + 02 sáng chế đoạn gen nhân tạo mang đa đoạn gen Vượt ký đăng TS Th.S CN Vượt ký đăng 10 11 gen nhân tạo đoạn gen đại cho dòng CTV Việt Đăng ký quyền phát minh sáng chế Đào tạo TS 3-5 Th.S CN đăng 22 Báo cáo tóm tắt kết thực đề tài KC04.03/06-10 Một số đánh giá hiệu đề tài mang lại: Hiệu khoa học công nghệ: Đề tài ứng dụng cách thành công kỹ thuật sinh học phân tử phân lâp, xác định, phân tích so sánh trình tự gen đánh giá đa dạng di truyền số lượng lớn cách có hệ thống chủng virus gây bệnh đốm vòng bệnh tàn lụi, kết thu đạt trình độ tương đương nghiên cứu giới Tạo quy trình kỹ thuật, cơng nghệ như: cơng nghệ RNAi ứng dụng tạo trồng kháng bệnh virus cơng nghệ đại có tính hiệu cao ứng dụng giới, quy trình kỹ thuật chuyển gen ăn có múi đu đủ đối tượng gỗ lâu năm khó chuyển gen, qui phạm đánh giá ăn chuyển gen góp phần phát triển lĩnh vực khoa học tạo giống trồng kháng bệnh virus nói riêng tạo giống trồng nói chung, góp phần tăng cường lực quản lý nhà nước an toàn sinh học sinh vật chuyển gen Đưa công nghệ tạo chuyển gen thành công cụ hỗ trợ đắc lực cho công tác tạo giống truyền thống cho ăn nói tiêng trồng nói chung, đồng thời nâng cao lực tiếp cận lĩnh vực khoa học đại lĩnh vực tạo giống khoa học trồng nói chung Góp phần đưa sinh học phân tử kết hợp với phương pháp miễn dịch enzyme vào chuẩn đoán bệnh, quản lý chuyển gen quản lý dịch bệnh Góp phần nâng cao lực cán nghiên cứu tham gia đề tài, lĩnh vực tạo giống trồng chuyển gen góp phần đào tạo nhân lực khoa học lĩnh vực công nghệ sinh học đại, góp phần đưa khoa học nước ta bước hội nhập khu vực quốc tế lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật nói chung cơng nghệ tạo trồng biến đổi gen nói riêng Hiệu kinh tế xã hội: Giảm chi phí sản xuất khơng phải dùng nhiều thuốc sâu, thuốc bệnh hoá chất, đảm bảo người mơi trường khơng bị nhiễm hố chất độc Giảm chi phí bảo vệ thực vật, hạ giá thành nông sản, tăng thu nhập cho người nơng dân Đa dạng hố sản phẩm, kéo dài tuổi thọ sản phẩm mở rộng thị trường (hoa tươi, nhiệt đới) tạo thêm công việc cho nông dân, góp phần chuyển dịch cấu sản xuất nơng nghiệp Đưa nước ta hội nhập bình đẳng vào trào lưu phát triển nông nghiệp công nghệ cao khu vực giới thông qua giảm sử dụng hoá chất tăng cường chất lượng sản phẩm 23 Báo cáo tóm tắt kết thực đề tài KC04.03/06-10 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã tách dịng xác định trình tự thành cơng gen mã hoá cho protein vỏ CP 28 chủng PRSV (16 chủng PRSV-p 12 chủng PRSV-w) đoạn gen Nib dòng PRSV phân lập khu vực khác Việt Nam Kết phân tích trình tự đoạn gen sử dụng thiết kế thành công đoạn gen nhân tạo mang đa đoạn gen đại diện cho dòng PRSV Việt Nam Đã phân lập va đọc trình tự tồn hệ gen PRSV Lý Nhân, Kontum TP Hồ Chí Minh đại diện cho chủng PRSV Việt Nam Kết phân tích phát sinh chủng loại cho thấy PRSV Việt Nam thuộc vào nhóm Đơng Á chia làm ba nhóm có nguồn gốc du nhập vào Việt Nam khác Đã tách dịng xác định trình tự thành công 31 đoạn gen CP va CPm; 18 đoạn gen p20; 02 đoạn gen RdRp 36 đoạn gen P349 chủng virus CTV phân lập khu vực khác Việt Nam Kết phân tích trình tự đoạn gen sử dụng thiết kế thành công đoạn gen nhân tạo mang đa đoạn gen đại diện cho dòng CTV Việt Nam Kết phân tích đa dạng di truyền phát sinh chủng loại dựa tình tự đoạn gen thu chủng CTV Việt Nam cho thấy virus Việt Nam tập trung thành hai nhóm: nhóm đại diện cho miền Bắc gồm chủng phân lập từ miền Bắc nhóm đại diện cho miền Nam gồm dòng phân lập từ miền Nam Đã biểu thành công gen CTV-CP CTV-CPm tế bào E.coli Rosetta-gamiTM Các protein tái tổ hợp tinh đạt tiêu chuẩn để phục vụ cho bước sản xuất kháng thể Từ kết phân lập đoạn gen PRSV CTV, thiết kế thành công đoạn gen nhân tạo mang đa đoạn gen: CP Nib CP, Nib HC-pro PRSV đoạn gen đa đoạn RdRp-CP RdRp-CP-p20-p23 CTV Đã thiết kế thành công vector chuyển gen (Ti-plasmid) mang cấu trúc RNAi: vector chuyển gen mang đoạn gen nhân tạo CP-Nib-HC-pro CP-Nib PRSV vector chuyển gen mang gen đa đoạn RdRp-CP-p20-p23 RdRp-CP CTV Đã tạo lưu giữ dòng vi khuẩn Agrobacterium mang vector chuyển gen chứa cấu trúc RNAi gen đa đoạn Đã hoàn thiện quy trình tái sinh chuyển gen vào thân mầm cam Canh, cam Sành cam Xã Đồi thơng qua A tumefaciens Đã tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào phôi soma đu đủ thông qua A tumefaciens Đã hồn thiện quy trình đánh giá chuyển gen kháng virus phịng thí nghiệm ngồi nhà lưới 10 Kết tạo chuyển gen: thu 42 dòng đu đủ chuyển gen đa đoạn CPNib-HCpro PRSV, 147 dịng cam Xã đồi, 32 dòng cam Sành 21 dòng quýt đường Canh chuyển gen đa đoạn RdRp-CP-p20-p23 CTV 11 Kết đánh giá tính kháng virus 23 dịng đu đủ Lạng Sơn chuyển gen qua lây 24 Báo cáo tóm tắt kết thực đề tài KC04.03/06-10 nhiễm virus nhân tạo, chúng tơi kết luận có dòng đu đu chuyển gen (A19, B1, B38, D10) biểu tính kháng virus nhà lưới 12 Kết đánh giá tính kháng virus 21 dịng qt đường Canh 20 dịng cam Xã đồi chuyển gen đa đoạn “RdRp-CP-p20-p23” nhận thấy có dịng qt đường Canh QC83 QC89, dòng cam Xã XĐ1-1, XĐ1-15-3, XĐ4-56-2, XĐ4-102, XĐ5-1-13 chưa phát virus CTV sau 45 ngày lây nhiễm Cây sinh trưởng phát triển tốt Kiến nghị Để tiếp tục phát triển hồn thiện kết nghiên cứu, chúng tơi đề xuất số kiến nghị sau: − Đối tượng nghiên cứu đề tài ăn dài ngày nên đòi hỏi thời gian cho sinh trưởng đảm bảo tính xác cho kết theo dõi đánh giá tính kháng virus dịng chuyển gen Vì vậy, chúng tơi xin đề nghị tiếp tục giai đoạn để đánh giá tính kháng virus dịng chuyển gen triển vọng để phát triển thành giống qui mô lớn − Khả ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo trồng chuyển gen kháng bệnh virus xu nhiều phịng nghiên cứu giới Kính đề nghị Bộ Khoa học Cơng nghệ, Ban chương trình tiếp tục hỗ trợ kinh phí cho đề tài để mở rộng kết đối tượng trồng khác phong lan, cà chua, lúa, khoai tây… 25 Báo cáo tóm tắt kết thực đề tài KC04.03/06-10 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bau HJ, Cheng YH, Yu TA, Yang JS, Yeh SD (2003) Broad-spectrum resistance to different geographic strains of Papaya ringspot virus in coat protein gene transgenic papaya Phytopathol 93(1):112-120 Baulcombe D (2004) “RNA silencing in plants” Nature 431: 356-363 Bekolo N, Zachée A, Lous BM, Baptiste NMJ, Yvette O (2007) Vigour and behaviour of fifteen citrus varieties against tristeza in the forest zone of Cameroon, African Journal of Biotechnology (12):1403-1409 Bộ NN PTNN (2002), Báo cáo thường niên ngành nông nghiệp năm 2002, Trung tâm thông tin Bộ Nông nghiệp Phát triển Nơng thơn, Hà Nội Domínguez A, Fagoaga C, Navarro L, Moreno P, Pena L (2002), Regeneration of transgenic citrus plants under non selective conditions results in high-frequency recovery of plants with silenced transgenes, Mol Genet Genomics 267(4):544-56 FAO (2003), Annual statistics Citrus Fruit: Fresh and Process, Rome, Italy Febres VJ, Niblett CL, Lee RF, Moore GA (2003) Characterization of grapefruit plants (Citrus paradise Macf.) transformed with citrus tristeza closterovirus genes, Plant Cell Rep 21:421–428 Fermin G, Inglessis V, Garboza C, Rangel S, Dagert M, Gonsalves D (2004) Engineered reisistance against Papaya ringspot virus in Venezuelan Transgenic Papayas, Plant Disease 88(5):516-522 Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, and Mello CC (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans Nature 391: 806-811 10 Fitch MM, Manshardt RM, Gonsalves D, Slightom JL, Sanford JC (1992) Virus resistent papaya plants devired from tissues bombarded with the coat protein gene of papaya ringspot virus Biotechnology 10: 1466-1472 11.Ghorbel R, Navarro L, Dura´ n-Vila N (1998) Morphogenesis and regeneration of whole plants of grapefruit (Citrus paradisi), sour orange (C aurantium) and alemow (C macrophylla), J Hort Sci Biotechnol 73:323–327 12.Gutiérrez MA, Luth DE, Moore GA (1997) Factors affecting Agrobacteriummediated transformation in Citrus and production of sour orange (Citrus aurantium L.) plants expressing the coat protein gene of citrus tristeza virus, Plant Cell Rep16:745–753 13 Gutiérrez MA, Moore GA, Jacano C, McCaffery M, Cline K (1992) Production of transgenic citrus plants expressing the Citrus tristeza coat protein gene, Phytopathology 82: 1148 14 Habibuddin H, Pillai V, AbuBaka UK, Tan CS, Ong CA, Chan YK, Hassan MD (2005) Progress on the screening of transgenic Eksotika papaya for resistance against the papaya ringspot virus in Malaysia Country progress report Technical and Coordination Meeting of the Papaya Network of SEAsia sponsored by ISAAA Kuala Lumpur 22-24 Nov 2005 26 Báo cáo tóm tắt kết thực đề tài KC04.03/06-10 15 Hautea DM, Magdalita PM, Dolores LM, Galvez HF, Taylo LD, Valencia LD, Colle MG, Canama AO, Oropesa R, Argayoso MO, Alcachupas AL, Ocampo EM (2005) Development and commercialization of PRSV resistant GM papaya for fresh fruit and papain production Country progress report Technical and Coordination Meeting of the Papaya Network of SEAsia sponsored by ISAAA Kuala Lumpur 22-24 Nov 2005 16 Herron CM (2003) Citrus Tristeza Virus: Characterization of Texas Isolates, studies on aphid transmission and pathogen-derived control strategies, PhD Thesis of Plant Pathology Texas A and M University, USA 17 ICTV, ICTVdB Virus Descriptions (2002), 00.057.0.01.045 Papaya ringspot virus, http://www.ictvdb.othamsted.ac.uk/ICTVdB/57010045.htm 18 Jones DT (1990) A background for the utilization of citrus genetic resources in Southest Asia I: Classification of Aurantioideae In "Proceeding of the 4th Intern Asia Pacific Conference on Citrus Rehabilitaton, Changmai Thailand, 4-10 Feb.1990, Ed Aubert et al: 31-37 19 Le BT, Tran YTO (1999), Papaya research and development in Vietnam, ISAAA Briefs: 101-104 20 Lines RE, Persley D, Dale JL, Drew R, Bateson MF (2002) Genetically engineered immunity to Papaya ringspot virus in Australian papaya cultivars, Mol Breeding 10(3):119-129 21 Nguyễn Thành Hối, Dương Minh (2003), Kỹ thuật trồng đu đủ, NXB Nông nghiệp 22 Reddy DVR, Sudarshanaw MR, Fuchs M, Rao NC, Thottappilly G (2009) Genetically engineered virus-resistant plants in developing countries: Current status and future prospects Advances in Virus Research 75: 185-220 23 Roistacher CN, Moreno P (1991) The worldwild threat from destructive isolates of citrus tristeza virus - a view, p 7-19 In Brlansky RH, Lee RF, Timmer LW(ed), Prceedings of the 11th Conference of the International Organization of Citrus Virologists, Department of Plant Pathology, University of California, Riverside 24 Souza JR, Gonsalves D (1999) Partial molecular characterization of the genome of the Brasil Fitopatol Bras 24: 362 25 Swingle WT and Reece PC (1967) The botany of citrus and its wild relatives, The citrus industry 1: 190 – 430 26 Tennant PF (1996) Evalution of coat protein transgenic papaya ringspot virus isolates and development of transgenic papaya for Jamaica, PhD thesis, Ithaca, Cornell University 27 Tennant PF, Fermin G, Fitch MM, Manshardt RM, Slightom JL, Gonsalves D (2001) Papaya ringspot virus resistance of transgenic Rainbow and SunUp is affected by gene dosage, plant development, and coat protein homology, Eur J Plant Pathol 107: 645-653 28 Tennant PF, Gonsalves C, Ling KS, Fitch MM, Manshardt RM, Slightom J, Gonsalves D (1994) Differential protection against papaya ringspot virus isolates in coat protein gene transgenic papaya and classically cross protected papaya, Phytopathol 87: 1359-1366 29 Trần Thế Tục (1997), Sổ tay người làm vườn, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 27 Báo cáo tóm tắt kết thực đề tài KC04.03/06-10 30 Villegas VN (1997), Edible fruits and nuts – Carica papaya L In EWM verheij, RE Coronel, volume 2, Wageningen university, the Netherlands 31 Vũ Công Hậu (1999) Trồng ăn Việt Nam, NXB Nông nghiệp 32 Yang ZN, Mathews DM, Dodds JA, and Mirkov TE (1999) Molecular characterization of an dòng of Citrus Tristeza Virus that causes severe symptoms in sweet orange Virus Genes, 19(2), p 131-173 28 ...BỘ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC04 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG CÂY ĂN QUẢ KHÁNG BỆNH VIRUS PHỔ RỘNG BẰNG CHUYỂN GEN ĐA ĐOẠN... thiết phải có giống đu đủ cam quýt kháng bệnh khả công nghệ RNAi tạo giống kháng bệnh virus, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo giống ăn kháng bệnh virus phổ rộng kỹ thuật chuyển gen đa đoạn? ?? với... KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC04 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG CÂY ĂN QUẢ KHÁNG BỆNH VIRUS PHỔ RỘNG BẰNG CHUYỂN GEN ĐA ĐOẠN Mã số: KC.04.03/06-10 Chủ nhiệm đề tài