Nhân giống cây bình vôi tím bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG MÃ SỐ: SV 2013-01 Tên đề tài: “NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI TÍM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO KẾT QUẢ

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

MÃ SỐ: SV 2013-01

Tên đề tài:

“NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI TÍM (Stephanla rotunada Luour)

BẮNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT”

CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI : Đào Bá Tuyên

Thái Nguyên , 2014

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO KẾT QUẢ

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

MÃ SỐ: SV 2013-01

Tên đề tài:

“NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI TÍM (Stephanla rotunada Luour)

BẮNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT”

Chủ trì đề tài : Đào Bá Tuyên

Những người tham gia :

Thời gian thực hiện : Từ 03/2013 – 03/2014

Giảng viên hướng dẫn : ThS Vi Đại Lâm

Địa điểm nghiên cứu : Phòng thí nghiệm

Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Đại học Nông Lâm Thái

Nguyên

Thái Nguyên, 2014

Em xin gửi lời cảm ơn tới Ks Lã Văn Hiền đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đồng thời, em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian học tập

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên để em có tự tin trong học tập và nghiên cứu khoa học

Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô

và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, tháng 03 năm 2014

Sinh viên

Đào Bá Tuyên

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

Tên đề tài: “Nhân giống cây bình vôi tím (Stephania rotunada Luour)bằng

phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật”

- Mã số: SV 2013-01

- Chủ nhiệm đề tài: Sv Đào Bá Tuyên

- Tell: (+84)1658889205 E-mail: tuyen.badao1992@gmail.com

- Cơ quan chủ trì đề tài: Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên

- Cơ quan phối hợp thực hiện :

- Bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học - công nghệ thực phẩm, Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên

- Thời gian thực hiện: từ tháng 3 năm 2013 đến tháng 3 năm 2014

1 Mục đích

Hoàn thiện quy trình nhân giống cây bình vôi tím (Stephania rotunada

Luour) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra

rễ của cây Bình Vôi tím

3 Kết quả chính đạt được

- Sản phẩm khoa học: 01 báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học

- Sản phẩm ứng dụng: Bước đầu hoàn thiện quy trình nhân giống cây bình

vôi tím (Stephania rotunada Luour) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

SUMMARY

- Research Project Title “ Propagation of Stephania rotunada Luour by

Plant tissue culture techni que ”

- Code number: T2013-01

- Coordinator: Dao Ba Tuyen

- Tell: 01658889205 Email: tuyen.badao1992@gmail.com

- Implementing Institution: Thai Nguyen University of Agricultural and

Forestry

- Cooperating Institution: Faculty of Biotechnology and Food

Technology

- Duration: March 2013 to March 2014

1 Objectives: Implement the Plant breeding on Stephania rotunada Luour by

Plant tissue culture

2 Main contents:

- The effects of chemical disinfection on ability to produce sterilized

materials

- The influences of growth stimulants substance on ability to produce roots

of Stephania rotunada Luour

- The influence of growth stimulants on ability to regenerate and proliferate

roots of Stephania rotunada Luour

3 Obtained results:

- Scientific Result: 01 Scientific researched Report

- Applied Result: Construct the general process of Plant breeding on

Stephania rotunada Luour by Plant tissue culture

M ỤC L ỤC

Trang

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 1

1.3 Ý nghĩa của đề tài 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây Bình vôi 3

2.1.1 Phân loại khoa học 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố 3

2.2 Vai trò của cây bình vôi tím 5

2.2.1 Giá trị về kinh tế 5

2.2.2 Giá trị về dược liệu 5

2.3 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

2.3.1 Tính toàn năng (Totipotence ) của tế bào 7

2.3.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 8

2.3.3 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

2.3.3.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

2.3.3.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.3.4 Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro 13

2.3.4.1 Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ 13

2.3.4.3 Nhân nhanh 13

2.3.4.4 Tạo cây in vitro hoàn chỉnh 14

2.3.4.5 Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên 14

2.4 Tình hình nhân giống và sử dụng củ Bình vôi 14

2.5 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 15

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 18

3.2 Thiết bị, hóa chất và dụng cụ nuôi cấy mô 18

3.2.1 Thiết bị 18

3.2.2 Hoá chất 18

3.2.3 Dụng cụ 18

3.3 Nội dung nghiên cứu 18

3.4 Phương pháp nghiên cứu 19

3.4.1 Phương pháp pha chất kích thích sinh trưởng 19

3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến khả năng tạo vật liệu vô trùng 19

3.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh cây Bình Vôi tím 21

3.4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra rễ của cây Bình Vôi tím 22

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 23

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến khả năng tạo vật liệu vô trùng 24

4.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng bằng dung dịch NaOCl đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn 24

4.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch Ca(OCl)2 đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn 25

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi từ chồi nách trên thân cây Bình Vôi 26

4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi 27

4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây Bình vôi 28

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30

5.1 Kết luận 30

5.2 Kiến nghị 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) [1] 3

Bảng 3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng 20 bằng dung dịch NaOCl đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn 20 Bảng 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch Ca(OCl)2 đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn 20 Bảng 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi từ chồi nách trên thân cây Bình Vôi 21 Bảng 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi 22 Bảng 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và đến 23 khả năng ra rễ của cây Bình Vôi 23 Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng bằng dung dịch NaOCl đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn 24 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch Ca(OCl)2 đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn 25 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng 26 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Bình vôi 27 Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây Bình vôi sau 4 tuần nuôi cấy 28

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour) 4

PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bình Vôi tím, dân tộc Tày ở tỉnh Bắc Kạn thường gọi là “cà tòm đeng” có

nghĩa là bình vôi đỏ, tên khoa học là “Stephania rotunada lour” thuộc họ tiết dê (Menispermaceae) Bình Vôi tím là một cây dây leo giống như các loại Bình

Vôi khác, dưới gốc rễ hình thành củ, mọc bám vào vách đá nhưng củ Bình Vôi tím nhỏ hơn loại trắng nhiều (chỉ nặng khoảng 0,5kg - 1kg), vỏ củ mầu nâu, dây mầu tím, phần thịt củ mầu đỏ, nhựa dây cũng mầu đỏ Phần dây leo và lá y hệt cây bình vôi trắng, nhưng lá nhất là lá ngọn và lá non mầu tím Cây Bình Vôi tím phân biệt đực cái rõ vì hoa đực và hoa cái khác gốc, củ cũng khác, củ cây cái thường tròn, củ cây đực thường dài hơn

Bình Vôi tím là một loại dược liệu quý, ít gặp, thuộc loại hiếm Dùng để điều trị các bệnh về đường ruột (như viêm loét dạ dầy, viêm đại tràng, lỵ cấp mãn…) các bệnh về khớp và thần kinh Đặc biệt, nếu dùng bột củ bình vôi tím với liều lượng 5g - 10g/ngày còn có tác dụng tiêu u (u đại tràng, u phổi) Dùng

củ tươi giã nát tẩm nước vo gạo để đắp các u lành tính bên ngoài kể cả biếu basedow thì có hiệu quả tốt, u nhỏ lại trông thấy chỉ sau một đợt điều trị từ 10 ngày - 15 ngày

Hiện nay với nhu cầu sử dụng ngày càng tăng và việc khai thác liên tục trong nhiều năm không chú ý tới bảo vệ tái sinh, cộng với nhiều nguyên nhân khác làm

Bình vôi tím (Stephania rotunada Lour) vốn phân bố khá phổ biến ở các tỉnh miền

núi phía bắc hiện đang bị suy giảm nghiêm trọng, và đang có nguy cơ bị tuyệt chủng Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật thì việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống đã trở nên phổ biến Nuôi cấy mô tế bào tạo

ra những giống cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, độ đồng đều cao và hệ số nhân lớn Nhận thức được vấn đề bảo tồn và phát triển những loài cây thuốc quí có tiềm năng

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nhân

giống cây bình vôi tím (Stephania rotunada lour) bằng phương pháp nuôi

cấy mô tế bào thực vật ”

1.2 Mục tiêu của đề tài

Hoàn thiện quy trình nhân giống cây Bình Vôi tím (Stephania rotunada

lour)bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống cây

Bình vôi bằng phương pháp nuôi cấy in vitro là cơ sở nhân nhanh loài dược

liệu quí có nguy cơ cạn kiệt

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung cho kĩ thuật nhân giống Bình vôi, nhân nhanh cây giống sạch bệnh, chất lượng đảm bảo và bảo tồn nguồn gen quí hiếm

Thực hiện đề tài giúp sinh viên hoàn thiện về cả kiến thức lý thuyết và thực tiễn, mang lại những kinh nghiệm và tác phong làm việc khoa học cho

công tác sau này

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây Bình vôi

2.1.1 Phân loại khoa học

Bảng 2.1 Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) [1]

Chi Bình vôi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania spp, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có nguồn gốc ở miền đông

và nam châu Á cũng như Australasia[21] Chi Bình vôi có khoảng trên 45

loài Một số loài công bố ở Việt Nam: Stephania glabra (Roxb) Miers, S

kuinanensis, S Pierrei Diels, S Sinica Diels, S.rotunda Lour [14],…

2.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố

Bình vôi là tên gọi của nhiều loài cây là dây leo có rễ củ thuộc chi

Stephania, họ Tiết dê (Menispermaceae) Ở Việt Nam còn có các tên gọi khác

như là: cây củ một, củ mối tròn, dây mối trơn, củ gà ấp,

Các loại Bình vôi có đặc điểm chung như sau: dây leo, thân nhẵn, thường xanh, gốc hóa gỗ, sống lâu năm Thân nhẵn hơi xoắn vặn Rễ củ đa dạng, có thể rất to, vỏ ngoài xù xì màu nâu - nâu đen Lá mọc so le, cuống lá dài, đính vào trong phiến lá khoảng 1/3; phiến lá mỏng, hình tim, gần hình tròn, có cạnh hoặc tam giác tròn, hai mặt nhẵn; gân lá xuất phát từ chỗ đính của cuống lá, nổi rõ ở mặt dưới lá Cụm hoa hình xim tán mọc ở kẽ lá hoặc những cành già đã rụng lá; hoa đực và hoa cái khác gốc, hoa đực có 6 lá đài xếp thành hai vòng, 3 cánh hoa màu vàng cam; nhị: 2-6, thường là 4; hoa cái

có 1 lá đài, 2 cánh hoa; bầu hình trứng Quả hạch hơi dẹt, mọng nước màu

đỏ hoặc da cam; hạt cứng, hình móng ngựa, hình trứng hoặc gần tròn mang

4 hàng vân dạng gai, hai mặt bên lõm ở giữa có lỗ thủng hoặc không Mùa hoa: tháng 4-6; mùa quả: tháng 8-10 [5],[15]

Hình 2.1: Cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour)

Bình vôi là cây mộc hoang dại, sống thích hợp ở nhiệt độ trung bình năm 21-230C, lượng mưa 2000 - 2500mm, ưa đất nhiều mùn, thoát nước, độ pH = 6,5-7 Các loại Bình vôi ở nước ta có diện phân bố rất rộng trên cả ba miền Bắc, Trung, Nam Thường tập trung ở vùng núi đá vôi như Tuyên Quang, Cao Bằng, Thái Nguyên, Phú Thọ, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Lâm

Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu Sự phân bố của mỗi loài rất khác nhau, tùy theo

đặc tính sinh học của chúng Đặc điểm riêng của một số loài [15]:

Củ Bình vôi (Stephania rotunda Lour): Dây leo có rễ củ vùi dưới đất một

nửa giống hình củ bình vôi, ruột màu vàng, thơm Lá hình khiên, mọc cách Phổ biến ở các rừng thưa Phú Thọ, Vĩnh Yên, Ninh Bình,…

Stephania pierrei Diels: Ngọn non có nhiều chấm màu tím hồng Lá có

kích thước nhỏ hơn tất cả các loài khác Hoa đực không có cánh hoa

S hainanensis H.S Lo et Y Tsoong: Cành non và cuống lá có dịch màu

trắng hoặc vàng nhạt

S cambodia Gagnep: Cuống cụm hoa và cuống tán giả dài hơn so với các loài

khác

S dielsiana Y.C.Wu: Nửa cuống lá phía đính vào phiến lá và gân lá mặt

sau có màu tím hay tím hồng

S excentria H.S.Lo: Cuống lá rất dài, có khi đến 14cm, giá noãn có lỗ lệch một

bên

S cepharantha Hay: Giá noãn không có lỗ

S sinica Diels: Giá noãn không có lỗ

2.2 Vai trò của cây bình vôi tím

2.2.1 Giá trị về kinh tế

Cây Bình vôi là một loại cây thuốc nam mọc tự nhiên ở một số vùng của nước ta không chỉ có tác dụng về mặt y học cây Bình vôi còn có giá trị về mặt kinh tế và đây cũng là cây trồng “xóa đói giảm nghèo” của người dân tộc vùng cao Tuy nhiên, loại cây quý này đang dần cạn kiệt trước việc khai thác ồ ạt của người dân

Bình vôi là một loại cây dạng leo dễ trồng, phù hợp với điều kiện nước ta, chỉ cần đất tơi xốp, nhiều mùn, thoát nước là có thể phát triển tốt Nó không đòi hỏi tốn công chăm sóc, kỹ thuật canh tác cao nhưng lại mang giá trị kinh tế cao cho người trồng Cây Bình vôi sẽ là cây có tiềm năng lớn trong y học là nguồn nguyên liệu cho ngành dược và mang lại kinh tế cho người trồng

2.2.2 Giá trị về dược liệu

Cây Bình vôi thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae), là cây chứa nhiều hoạt

chất có giá trị về dược liệu Bình vôi có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu ứ,

chỉ thống, khu phong Hoạt chất được nhiều nhà khoa học chiết xuất từ cây Bình vôi là rotundin Nhiều thí nghiệm lâm sàng trên chuột cống trắng cho thấy Bình vôi có tác dụng an thần, gây ngủ

Theo kinh nghiệm trong y học cổ truyền Bình vôi được dùng để chữa bệnh mất ngủ, ho hen, kiết lỵ, sốt, đau bụng,… Trong y học hiện đại, rotundin được dùng làm thuốc an thần gây ngủ, giảm đau, điều trị một số trường hợp rối loạn tâm thần chức năng, trạng thái căng thẳng thần kinh, mất ngủ dai dẳng do nguyên nhân tâm thần [4]

Trong nhân dân củ Bình vôi được sử dụng là một vị thuốc dân gian Củ Bình vôi thái nhỏ, phơi khô được dùng dưới dạng sắc hay ngâm rượu chữa hen, ho lao, lỵ, sốt, đau bụng

Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất alcaloid: L-tetrahydropalmatin

(rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin Những hợp chất này được sử

dụng phổ biến để điều chế các loại thuốc, đặc biệt là thuốc an thần Các alkaloid này thuộc nhóm alkaloid dẫn xuất của nhân isoquinolin Trong đó quan trọng nhất là rotundin

Một số kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính sinh học của một số chất trong cây như sau:

Năm 1941, DS.Trần Xuân Thuyết cùng với Giáo Sư, Tiến Sĩ Đỗ Tất Lợi

và P.Bonnet đã phát hiện ra hỗn hợp alkaloid của củ bình vôi, đặt tên là

rotundin - có tác dụng an thần gây ngủ, hạ huyết áp, điều hòa tim, giãn cơ trơn, do đó giảm các cơn đau do co thắt cơ trơn, đưa Việt Nam trở thành nước đầu tiên trên thế giới chiết được rotundin (1944: Nhật; 1957: CHDC Đức; 1960: Liên Xô; 1962: Trung Quốc )

Theo Ngô Đại Quang (1999) tác đụng dược lý của rotundin đã được nghiên cứu ở nước ta từ thời Pháp thuộc Rotundin được áp dụng từ năm 1944

và suốt trong cuộc kháng chiến chống Pháp đã được dùng để điều trị có kết quả một số trường hợp đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và an thần Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất [9]

Phạm Thị Kim, Bùi Minh Đức và các cán bộ khoa học khác ở Viện Dinh dưỡng và Học viện Quân y đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột (150mg/kg thể trọng) tương đương với 7,5g dùng cho người lớn để uống (gấp

15 lần liều dùng theo Dược điển Trung Quốc-1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được LD50 đường uống Điều đó chứng tỏ độ an toàn

lá cao của chế phẩm Rotundin ít độc Khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều 30mg/kg, con vật đó tuy bị mệt nhất thời nhưng lại khỏi sau 1-2 ngày Ở Trung Quốc, ngoài dạng viên 30mg và 60mg, rotundin còn có ở dạng tiêm là rotundin sunfat, mỗi ống chứa 2ml (60mg), dùng làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều trị loét dạ dày, hành tá tràng, đau dây thần kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh v.v

Theo Fakhrutdinov Sf(1962), roemerin gây tê niêm mạc và phong bế Đối với tim ếch cô lập, roemerin có tác dụng ức chế, giảm biên độ và tần số

co bóp, với liều cao tim ếch ngừng đập ở thời kỳ tâm trương Roemerin đối kháng với tác dụng tăng co bóp ruột của acetylcholine Đối với hệ thần kinh trung ương với liều thấp roemerin có tác dụng an thần gây ngủ, liều cao kích thích gây co giật dẫn đến tử vong Roemerin còn có tác dụng dãn mạch hạ huyết áp [17]

Theo kết quả nghiên cứu của Mutsuo Kozuka, Kryoe Miyaji, Tokunosuke Sawada và Masao Tomita (1984), cepharanthin có tác dụng dãn mạch nhẹ trên những mạch vi tuần hoàn, có tác dụng tăng cường sinh sản kháng thể nên có tác dụng rõ rệt đối với các bệnh giảm bạch cầu do bệnh nhân bị bom nguyên tử, do chiếu tia phóng xạ, do dùng thuốc chữa ung thư, sự biến động số lượng hồng cầu

hoặc sắc tố máu hầu như không có thay đổi khi dùng cepharanthin Tác dụng phụ do uống cepharanthin liều cao không thấy xuất hiện [20]

2.3 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80 của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân

giống vô tính in vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh, bảo quản nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân

tạo…[5]

Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn trên thế giới áp dụng và đã nhân được khoảng 500 triệu cây giống trong 1 năm ở các công ty giống cây trồng khác nhau Dự kiến trên thị trường cây giống, kỹ thuật nuôi cấy mô thu được khoảng 15 tỉ USD/năm và tốc độ tăng trưởng của thị trường này hàng năm vào khoảng 15% [5]

Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in

vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng

khác nhau như: cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh, cây dược liệu…

Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn nhưng hiện nay đã bị chặt phá do nhiều nguyên nhân khác nhau Góp phần vào cung cấp nguồn giống cây rừng phục vụ cho công tác phủ xanh đất trống, đồi núi trọc của nhà nước ta, hàng

loạt quy trình nhân giống in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu nhằm tạo ra

lượng lớn cây giống có chất lượng tốt

Thuật ngữ nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật,

trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng [8] Cho đến nay, nuôi cấy

mô tế bào thực vật được xem giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh học nói chung Trên môi trường nhân tạo, từ các mô hoặc các cơ quan thực vật ban đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểm sinh học giống hệt nhau

2.3.1 Tính toàn năng (Totipotence ) của tế bào

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902 Haberlandt lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều

có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Theo quan

điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ

đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào [11]

2.3.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau

Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh

để thực hiện chức năng phân chia

Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng

2.3.3 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho

sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy

2.3.3.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

a) Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm

bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi

cấy mô in vitro [12]

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao Thông thường hay sử dụng một số hoá chất như: NaOCl, cồn 700, Ca(OCl)2, HgCl2

Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy

Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000 lux, ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của

mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so

với ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ

2000 - 2500 lux người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy

từ 35 - 40cm

- Nhiệt độ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây Tuỳ thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±20C [11]

- pH

pH của môi trường là một yếu tố quan trọng Sự ổn định của pH môi trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào pH của đa số môi trường được điều chỉnh giữa 5,5-6 trước khi hấp khử trùng pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng [16]

2.3.3.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy mô đều gồm các thành phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng vi lượng, đường làm nguồn cacbon, cac vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng Ngoài ra, người ta còn

bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA, ) và một

số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch trích nấm men…

a) Nước

Cần đặc biệt chú ý đến thành phần này vì nước chiếm đến 95% môi trường dinh dưỡng Nên sử dụng nước cất khi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu Nếu môi trường chuẩn bị cho nuôi cấy protoplast, tế bào hay

meristem thì nên dùng nước cất 2 lần Hoàn toàn không nên sử dụng nước máy trong nuôi cấy mô Trong trường hợp không có sẵn cũng chỉ nên sử dụng nước khử ion, mặc dầu nước này vẫn có thể chứa nguồn lây nhiễm hữu cơ và các loài vi khuẩn [11]

b) Dinh dưỡng vô cơ

Dinh dưỡng vô cơ được chia ra làm 2 loại: các nguyên tố dinh dưỡng đa lượng và nguyên tố dinh dưỡng vi lượng Theo thống nhất của Hội sinh lí học thực vật quốc tế (IAPP), nguyên tố khoáng mà thực vật cần với nồng độ lớn hơn 0,5 mmol/l gọi là nguyên tố đa lượng, nguyên tố khoáng mà thực vật cần

có nồng độ nhỏ hơn 0,5 mmol được gọi là nguyên tố vi lượng Nguyên tố khoáng là nhu cầu rất cần thiết đối với nuôi cấy mô thực vật Giống như cây trồng ngoài tự nhiên các mô và cơ thể thực vật khi nuôi cấy trong ống nghiệm trên môi trường nhân tạo chúng cần được cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển Trong tự nhiên cây trồng muốn sinh trưởng

và phát triển mạnh thì cần phải lấy từ đất các nguyên tố sau [11]:

- Các nguyên tố đa lượng: các ion của nitơ (N), photpho (P), kali (K), canxi (Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S)

- Các nguyên tố vi lượng: sắt (Fe), niken (Ni), clo (Cl), mangan (Mn), kẽm (Zn), bo (B), đồng (Cu), và molipden (Mo)

Mười bốn nguyên tố trên cùng với cacbon, oxy, hidro được xem là các nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu của thực vật

Nhu cầu của mô thực vật nuôi cấy đối với nguyên tố dinh dưỡng khoáng khác nhau so với thực vật ngoài đồng ruộng Hệ rễ thực vật lấy dinh dưỡng từ đất chủ yếu theo phương thức hấp thu chủ động, còn mô nuôi cấy dinh dưỡng khoáng từ môi trường theo phương thức hấp thu bị động là chính Theo nguyên tắc thành phần môi trường nuôi cấy sẽ được xây dựng trên thành phần các nguyên tố dinh dưỡng có mặt trong mô Môi trường nhân tạo sử dụng phổ biến nhất thường được sử dụng trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật là môi trường MS (Murashige và Skoog (1962) cũng được thiết lập dựa trên nguyên tắc này [11]

c) Đường

Đường là thành phần quan trọng trong tất cả các môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật Đường cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển vì quá trình quang hợp của mô hoặc cây nuôi cấy là không đủ cho sự sinh trưởng của chúng được đặt trong điều kiện không thích hợp cho quang hợp hay thậm chí

hoàn toàn không có quang hợp (nuôi cấy trong bóng tối) Các mô có màu

xanh cũng không đủ khả năng để tự dưỡng in vitro Mặt khác, quá trình quang

hợp cũng bị hạn chế ở nồng độ CO2 trong bình cấy Trên thực tế việc bổ sung CO2

là rất khó khăn và tốn kém

Đường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật là đường saccharose ở nồng độ 1-5% Đường saccharose là dạng đường được tổng hợp

và vận chuyển tự nhiên trong cây nên rất thuận lợi cho các mô nuôi cấy Cũng

có thể sử dụng đường glucose hoặc fructose trong nuôi cấy mô thực vật Nồng độ đường sử dụng phụ thuộc vào loại và tuổi của mẫu cấy [11]

d) Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Đại

đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng

số lượng thấp, có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vitamin B1), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy

e) Agar

Agar là một loại polysacharit của tảo Agar là chất keo đông thường được sử dụng nhất, nguồn gốc chủ yếu của nó là rong biển đỏ, là một phức chất polysacharit do đường saccloze và galactose tạo thành Nồng độ của thạch dùng trong nuôi cấy rất dao động tùy theo độ tinh khiết của hóa chất và mục tiêu nuôi cấy (thường 4-12 g/l, trung bình 6-12 g/l) nếu nồng độ quá cao môi trường dinh dưỡng sẽ rất cứng chất dinh dưỡng khó khuếch tán để nuôi dưỡng mô cấy Ở 800C thì ngậm nước chuyển sang trạng thái sol còn ở 400C thì trở về trạng thái gel Khả năng ngậm nước của thạch khá cao: 6-12 gam/lít nước Thạch ở dạng gel nhưng vẫn để cho các ion vận chuyển dễ dàng [11]

f) Chất điều hoà sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật nuôi cấy mô Hiệu quả tác động của nó phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng, mẫu nuôi cấy và hoạt tính vốn có của nó [11]

Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính auxin và cytokinin, ngoài ra còn có gibberlin và etylen cũng là nhóm chất tham gia điều tiết sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan

Auxin:

Auxin được chia thành 2 loại: auxin tự nhiên và auxin tổng hợp Auxin

tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3- acid acetic (IAA) và auxin tổng hợp là indole-3-butylric acid (IBA), 2,4-diclorophenolxy acetic acid (2,4-D), 1-napthalene acetic acid (NAA) Hoạt tính của các chất điều tiết sinh trưởng này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4-

D IAA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng

do đó không ổn đinh trong môi trường nuôi cấy mô NAA và 2,4-D không bị biến tính trong quá trình hấp tiệt trùng Tuy nhiên chất 2,4-D là chất dễ gây

độc nhưng có tác dụng rất nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus

Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, nhóm auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính Tùy loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay hình thành mô sẹo (callus) Nồng độ auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1- 2mg/l tùy từng chất và đối tượng nuôi cấy

Cytokinin:

Nhóm chất cytokinin kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hóa chồi Tỉ lệ auxin/cytokinin quyết định sự phân hóa của mô theo hướng tạo rễ, chồi hay mô sẹo Nồng độ sử dụng là 0,1-2mg/l Ở nồng độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy

Các cytokinin thường được sử dụng là Benzyladenin (BA) hay Benzyl amino purin (BAP), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2 iP) và Zeatin (cytokinin

tự nhiên) Trong các chất này, BAP và sau đó kinetin được dùng phổ biến nhất vì có hoạt tính cao và giá không đắt Zeatin làmột loại cytokinin tự nhiên

có hoạt tính rất mạnh chỉ dùng trong những trường hợp đặc biệt do rất đắt Trong nhiều trường hợp, người ta còn sử dụng một số chất cytokinin khác như Diphenylurea, Thidiazuron (TDZ) trong đó TDZ là một cytokinin có hoạt tính cao thường dùng trong nuôi cấy nhân nhanh cây thân gỗ

g) Than hoạt tính

Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc Than hoạt tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các hợp chất

phenol… trong trường hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có nó vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinh trưởng của

rễ Than hoạt tính còn là một trong những chất chống oxy hóa tốt Nhìn chung

nó có ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường

2.3.4 Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro

Theo Goer (1993) quá trình nhân giống in vitro bao gồm các bước sau [11]:

2.3.4.1 Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây

mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này cần phải sạch bệnh đặc biệt là bệnh vi rút và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm và tăng khả năng sống và

sinh trưởng của mẫu cấy in vitro

2.3.4.2 Nuôicấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần

đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại sinh trưởng tốt

Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của mẫu Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa

và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá,

2.3.4.3 Nhân nhanh

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính

Vấn đề là phải xác định môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp

để có hiệu quả cao nhất Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi Chế độ nuôi cấy thường là 25-27ºC, có 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau như nhân nhanh súp lơ cần quang chu kì chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân nhanh phong lan Phaleanopsis ở giai đoạn đầu cần che tối,

2.3.4.4 Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng Theo Murashige, giai đoạn này là giai đoạn ưu tiên cho sự tạo rễ của chồi để sau đó có thể chuyển chúng sang môi trường trồng trọt tự nhiên Tạo

rễ cho chồi là một phần rất quan trọng của bất kì quy trình nhân giống in vitro

nào Đôi khi một số chồi cần kéo dài trước khi tạo rễ Để giảm chi phí nhân

giống, nhiều phòng thí nghiệm chuyển chồi không rễ từ môi trường in vitro

và tạo rễ ở bên ngoài bình nuôi cấy

2.3.4.5 Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:

- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số

lá, số rễ, chiều cao cây)

- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát

nước

- Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp

2.4 Tình hình nhân giống và sử dụng củ Bình vôi

Trồng Bình vôi bằng hạt hoặc phần đầu của củ Thu hái quả chín vào khoảng tháng 8-10, đãi vỏ lấy hạt Bảo quản hạt trong cát ẩm Gieo hạt vào mùa xuân (tháng 2-3), tỉ lệ mọc sẽ cao Hạt để cách năm có tỉ lệ mọc thấp Chọn đất nhiều mùn, tiện tưới và thoát nước làm vườn ươm Ở Việt Nam vào tháng 2-3, khi cây hồi xuân, có thể tìm kiếm cây con ở rừng đem về trồng Ngoài ươm cây giống từ hạt, có thể cắt phần đầu của củ để làm giống Mỗi đầu có thể xẻ làm 4 mảnh Thời vụ trồng vô tính này cũng vào tháng 2-3 Đất trồng cao thoáng nước Bình vôi trồng ở Việt Nam mới có thấy sâu xanh hại

lá từ tháng 4-10 và củ thối khi bị úng nước Thu hoạch cây trồng sau 2-3 năm, thời gian càng lâu năng suất càng cao Trồng bằng hạt có năng suất cao hơn trồng từ mầm củ thu hoạch vào mùa đông tháng 11-12 khi cây tàn lụi Khi đào tránh làm sây xát củ Năng suất trung bình 1 tấn củ khô/ha [15]

Trong nhân giống in vitro, năm 2010 Trịnh Ngọc Nam và Nguyễn Văn Vinh nghiên cứu nhân giống in vitro và khảo sát hợp chất anlkaloid rotudine

từ cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour) đã đưa ra kết luận [7]:

- Khả năng tạo mô sẹo từ khúc cắt đoạn thân đạt hiệu quả cao trên môi trường MS bổ sung 2,4-D 5mg/l, BA 0,2mg/l

- Trên môi trường MS bổ sung BA 1mg/l, NAA 0,2mg/l, quá trình hình thành chồi từ chồi ngủ xảy ra thuận lợi

Hiện nay, nước ta thu hái củ Bình vôi chủ yếu từ nguồn mọc hoang dại Khi thu về cạo sạch vỏ nâu đen, thái lát mỏng đem phơi hoặc sấy khô được sử dụng làm thuốc uống hoặc đem chiết rotundin Từ củ Bình vôi ta có thể chế biến

ra chất rotudin thô hay tinh khiết như sau: Thái hay xát củ Bình vôi như ta sát nâu Ép lấy nước, bã còn lại them nước vào khuấy đều rồi lại ép nữa Làm như vậy cho tới khi bã hết đắng (alkaloid ra hết) Nước ép để lắng, thêm nước vôi trong hoặc dung dịch Cacbonat kiềm sẽ cho tủa rotudin thô Lọc hay gạn lấy phơi hoặc sấy khô Như vậy ta sẽ thu được rotudin thô vừa gọn, vừa dễ bảo quản

và dễ vận chuyển Từ rotudin thô ta có thể chiết rotudin tinh khiết bằng cách dùng cồn hay dung dịch axit sunfuric 5 hay 10% nóng, lọc rồi kết tinh Làm đi làm lại nhiều lần, theo nguyên tắc chung của kết tủa alkaloid, ta sẽ thu được rotudin tinh khiết

2.5 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

Việt Nam có hàng ngàn cây thuốc quý hiếm được ghi tên trong danh lục đỏ Nhiều cây thuốc quý có nguy cơ bị tuyệt chủng do bị khai thác mạnh phục vụ cho việc sản xuất trên quy mô công nghiệp Để bảo tồn nguồn gen những cây thuốc quý này, quy trình nhân giống cây dược liệu được nhiều tác

giả nghiên cứu hoàn thiện như: nhân giống vô tính các dòng Kava (Piper

methysticum G Forster) có hoạt tính sinh học cao (Đinh Đoàn Long và cs

(2004)) [18] Nguyễn Trung Thành, Lê Văn Cần, Pack Kee Youep đã nuôi

cấy rễ bất định của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamnenis Ha et Grush v.) trên

môi trường MS cơ bản

Đối với cây bình vôi, năm 1940, Bùi Đình Sang đã chiết từ củ Bình vôi mọc ở Việt Nam các chất tinh bột, đường khử oxy, axít malic, men oxydaza

và một alkaloit với tỉ lệ 1,2-1,5% (tính trên củ tươi), được Bùi Đình Sang đặt tên là rotudin [5]

Năm 1944, Kondo (Nhật) đưa ra công thức khai triển của rotudin như sau với công thức thô là C13H19(OCH3)3CH3N

Tại Ấn Độ, năm 1950 và 1952 Qiaudry G R và Siddiqui nghiên cứu và

chiết từ củ cây Stephania Glabra (Roxb) Miers nhiều alkaloit và đặt tên là

hyndarin C23H25O4N, Stefarin C18H9O3N và cyckanin C38H42O6N trong đó hyndarin chiếm thành phần chủ yếu (chừng 30% hyndarin, 15-18% stefarin

và rất ít cyckanin) Nghiên cứu cấu tạo hyndarin người la thấy rằng hyndarin thực ra cũng chỉ là một alkaloit đã biết có tên là tetrahydropanmatin [5]

Trước năm 1965, người ta vẫn cho rằng hyndarin và rotundin là hai alkaloit khác nhau vì chiết từ hai cây khác nhau, mọc tại hai nước khác nhau Nhưng đến năm 1965, Viện nghiên cứu cây thuốc và cây có tinh dầu toàn liên bang Xô Viết cũ (VILAR) có dịp so sánh hai cây, một di thực từ Ấn Độ, một di thực từ Việt Nam, thấy rằng hai cây chỉ là một loài nên đã kiểm tra lại tính chất của rotundin và đã xác định rotundin và hyndarin chỉ là một chất và có cấu tạo của tetrahydropanmatin

Ngoài rotundin ra, năm 1964, tại Bộ môn dược liệu (Trường Đại học Dược khoa, Hà Nội) Ngô Văn Thu còn chiết từ củ Bình vôi Việt Nam một

ancaloit mới là roemerin Từ rễ củ loài S.pierei Diels thu hái ở vùng ven biển

Bình Định, Ngô Thị Tâm đã phân lập được cepharantin (1%)

Năm 1965 tại Liên Xô cũ, Phan Quốc Kính và cộng sự cũng chiết từ củ Bình vôi mang từ Việt Nam sang một số alkaloit và đặt tên là alkaloit A, alkaloit

C và D với tỷ lệ 0,08% mỗi thứ (Hoá học các hợp chất thiên nhiên, 6-1965) [5]

Năm 1997 Phạm Thanh Kỳ chiết từ rễ củ của loài S.brachyandra có:

isocorydin (1,5%), tetrahydropalmatin (0,2%), dicentrin (0,3%) ,sinomenin (0,1%), corytuberin (0,04%), sinoacutin (0,006%), dehydrodicentrin (0,006%), isoboldin (0,004%), dihydrosalutaridin (0,001%) và N-metyllaurotetanin

(0,006%) Trong rễ củ loài S.kwangsiensis có: tetrahydropalmatin, capaurin,

isocorydin, roemerin, dihydroromerin, dehydrostephanin, stephanin, dihydropalmatin và palmatin [4]

Trong rễ củ loài S.sinica có alkaloid chính là Rotundin (1,2-1,5%)

Từ rễ củ loài S.cepharantha đã phân lập được alkaloid chính là

cepharanthin và những alkaloid phụ khác: isotetrandin, berbamin, cepharanolin, cycleanin, stephanin, crebanin, o-nornuciferin, stesakin, palmatin, cepharamin

Trong rễ củ loài S.dielsiana có: crebanin (0,3%), sinoacutin (0,2%), stephanin(0,2%),

tetrahydropalmatin (0,1%) và dehydrostephanin

Theo Bùi Thị Bằng (2006), hàm lượng rotundin đạt tới 3,55% ở loài

S.brachyandra Diels (thu ở Hoàng Liên Sơn), 1,31% ở loài S.sinica Diels (thu ở

Hà Nam Ninh), 1,30% ở loài S.kwangsiensis H.S.Lo (thu được ở Quảng Ninh), 0,72% ở loài S.hainanensis H.S.Lo et Y.TSoong (thu ở Thanh Hóa), 0,62% ở loài S.cambodia Gagnep (thu ở Lâm Đồng), 0,29% ở loài S.cepharantha (thu ở

Hà Sơn Bình), 0,21% ở loài S.peirrei Diels (thu được ở Tây Nguyên) [3]

Năm 2010, Trịnh Ngọc Nam và Nguyễn Văn Vinh đã tiến hành nghiên

cứu nhân giống in vitro và khảo sát hợp chất anlkaloid rotudine từ cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour)

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Giống Bình vôi (Stephania rotunda Lour)

khỏe mạnh, sạch bệnh được trồng tại vườn bảo tồn quỹ gen, Khoa CNSH & CNTP, Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng, khả năng tái sinh chồi, nhân nhanh và ra rễ của cây Bình vôi bằng phương pháp nuôi cấy

- Canxi hypoclorit: Ca(OCl)2

- Natri hypoclorit: NaOCl

- Môi trường cơ bản: Môi trường MS gồm các muối đa lượng, muối vi lượng, các chất hữu cơ và vitamin; ngoài ra có đường saccharose, agar và các

chất kích thích sinh trưởng như BA, NAA,…

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến khả năng tạo vật liệu

vô trùng