nghiên cứu bảo tồn vốn gen cây ngưu tất (achyranthes bidentata blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHÓ THỊ THUÝ HẰNG NGHIÊN CỨU BẢO TỒN VỐN GEN CÂY NGƯU TẤT (ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHÓ THỊ THUÝ HẰNG NGHIÊN CỨU BẢO TỒN VỐN GEN CÂY NGƯU TẤT (ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ TÂM Thái Nguyên, 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin trân thành cảm ơn Th.S. Vũ Anh Tuấn, KTV Lƣơng Thị Hồng Vân - bộ môn Hoá hữu cơ - Khoa Hoá học trƣờng Đại học Sƣ phạm đã tận tình hƣớng dẫn tôi thực hiện một số thí nghiệm trong luận văn. Tôi xin cảm ơn KTV Đào Thu Thuỷ (PTN Công nghệ Tế bào thực vật), KTV Trần Thị Hồng (PTN Di truyền học), đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tiến hành các thí nghiệm. Tôi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm cùng các thầy cô giáo, cán bộ Khoa Sinh - KTNN, Khoa Hoá học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Tác giả Phó Thị Thuý Hằng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố. Tác giả Phó Thị Thúy Hằng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Những chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 3 3. Nội dung nghiên cứu 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Giới thiệu chung về cây Ngưu tất 4 1.1.1. Đặc điểm phân loại 4 1.1.2. Một số đặc điểm nông sinh học của cây Ngƣu tất 4 1.1.3. Kĩ thuật trồng, chăm sóc, thu hái và bảo quản sau thu hoạch 5 1.2.Tình hình sản xuất Ngưu tất trên thế giới và ở Việt Nam 6 1.3. Ứng dụng cây Ngưu tất trong y học 8 1.3.1. Cơ sở hoá học tính chữa bệnh của cây Ngƣu tất 8 1.3.2. Một số nghiên cứu ứng dụng cây Ngƣu tất trong y học 10 1.4. Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực trong công tác nhân giống cây trồng 12 1.4.1. Ƣu thế của nhân giống in vitro 12 1.4.2. Các phƣơng thức nhân giống in vitro 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.4.3. Một số thành tựu trong nhân giống cây trồng bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro 15 1.5. Ứng dụng kĩ thuật PCR - RAPD trong phân tích sự đa dạng di truyền 19 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Vật liệu……………………………… 23 2.1.1. Vật liệu thực vật 23 2.1.2. `Hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 24 2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu hợp chất saponin trong rễ cây Ngƣu tất 28 2.2.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử 29 2.2.4. Phƣơng pháp xử lí và tính toán số liệu 33 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1. Nghiên cứu nhân giống cây Ngƣu tất và trồng thử nghiệm ngoài đồng ruộng 34 3.1.1. Nghiên cứu khử trùng hạt 34 3.1.2. Ảnh hƣởng riêng rẽ của chất KTST đến khả năng nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Ngƣu tất trong ống nghiệm 36 3.1.3. Ảnh hƣởng của α-NAA tới sự tạo rễ của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm 42 3.1.4. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến khả năng nhân chồi và sự sinh trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm 44 3.1.5. Kết quả đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2. Hàm lƣợng saponin tổng số trong rễ cây Ngƣu tất in vitro trồng ngoài đồng ruộng và cây trồng bằng hạt 51 3.3. Sử dụng kĩ thuật RAPD đánh giá hệ gen cây Ngƣu tất in vitro và cây trồng bằng hạt 53 3.3.1.Kết quả tách chiết ADN tổng số 53 3.3.2. Kết quả phản ứng RAPD 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC 64 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ĐC: Đối chứng HS: Hệ số IBA: Axit 3-indolebutiric KLK: Khối lƣợng khô KTST: Kích thích sinh trƣởng PCR: Polimease Chain Reaction (phản ứng chuỗi Polimease) TĐST: Tốc độ sinh trƣởng TN: Thí nghiệm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG trang Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trƣờng MS 23 Bảng 2.2. Trình tự nucleotit của 5 đoạn mồi ngẫu nhiên………… 32 Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt Ngƣu tất 34 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng riêng rẽ của BAP và kinetin đến khả năng nhân chồi của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm …………………… 38 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng riêng rẽ của BAP và kinetin đến tốc độ sinh trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm ……………………… 40 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của α-NAA đến hình thành rễ của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm (sau 30 ngày) 42 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến khả năng nhân chồi của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm 44 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến tốc độ sinh trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm………………………………… 46 Bảng 3.7. Kết quả đƣa cây Ngƣu tất ra môi trƣờng tự nhiên 49 Bảng 3.8 . Theo dõi một số chỉ tiêu sau 30 ngày đƣa cây ra vƣờn ƣơm… 50 Bảng 3.9. Một số chỉ tiêu theo dõi rễ cây in vitro và rễ cây trồng bằng hạt khi thu hoạch 50 Bảng 3.10. Hàm lƣợng hợp chất saponin trong rễ cây in vitro và cây trồng bằng hạt 52 Bảng 3.11. Tổng số phân đoạn ADN xuất hiện của 5 mẫu ngƣu tất khi phân tích với 5 mồi ngẫu nhiên………………………………… 55 Bảng 3.12. Số phân đoạn ADN đa hình thu đƣợc từ 5 mẫu Ngƣu tất với tƣờng mồi nghiên cứu……………………………………… 56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 3.1. Biểu đồ so sánh ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ bình không nhiễm và tỷ lệ hạt nảy mầm của hạt Ngƣu tất 35 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nảy mầm và sự phát triển của chồi mầm Ngƣu tất 36 Hình 3.3. Biểu đồ so sánh khả năng nhân chồi giữa BAP và kinetin 39 Hình 3.4. Biểu đồ so sánh tốc độ sinh trƣởng giữa BAP và kinetin… 41 Hình 3.5. Ảnh hƣởng riêng rẽ của BAP và kinetin đến khả năng nhân chồi và tốc độ sinh trƣởng của chồi Ngƣu tất trong ống nghiệm 41 Hình 3.6. Hình ảnh rễ Ngƣu tất trong môi trƣờng có α-NAA 43 Hình 3.7. Biểu đồ ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến khả năng nhân chồi của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm……… 45 Hình 3.8. Biểu đồ ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến tốc độ sinh trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm………… 47 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến khả năng nhân chồi và tốc độ sinh trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm 48 Hình 3.10. Một số hình ảnh đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên…… 51 Hình 3.11. Một số phản ứng định tính hợp chất saponin……… 53 Hình 3.12. Hình ảnh một số giai đoạn tách chiết hợp chất saponin 53 Hình 3.13. Hình ảnh điện di kiểm tra độ tinh sạch ADN………… 54 Hình 3.14. Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% mồi OPP15 và OPP19……………………………………………. 57 Hình 3.15. Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% mồi OPH04 và OPN05…………………………………………… 57 Hình 3.16. Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% mồi OPF10 58 [...]... liệu trong nước Mặc dù đã dùng cây cỏ xước để thay thế nhưng nhu cầu về Ngưu tất vẫn rất lớn Xuất phát từ giá trị to lớn đó của cây Ngưu tất, nhằm bảo vệ nguồn gen và tạo ra được một số lượng lớn giống cây Ngưu tất cung cấp cho gieo trồng Chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu bảo tồn vốn gen cây Ngưu tất (Achyranthes Bidentata Blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Số hóa bởi Trung tâm Học... tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu quy trình nhân giống cây Ngưu tất trong ống nghiệm nhằm bảo tồn nguồn gen và tạo ra số lượng nhất định cây con đồng đều cung cấp cho sản xuất và trồng thử ngoài đồng ruộng - Khẳng định tính ổn định của cây nuôi cấy in vitro thông qua đánh giá sự ổn định về hàm lượng hợp chất saponin và genome cây Ngưu tất trồng tự nhiên và cây nuôi cấy trong ống nghiệm 3 Nội dung nghiên cứu. .. rễ cây Ngưu tất trồng tự nhiên và cây nuôi cấy in vitro 3 Sử dụng kĩ thuật RAPD để đánh giá sự ổn định di truyền giữa cây Ngưu tất trồng tự nhiên và cây Ngưu tất nuôi cấy in vitro Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây Ngƣu tất 1.1.1 Đặc điểm phân loại Ngưu tất có tên khoa học là (Radix Achyranthis Bidentatae).Tên... Nội dung nghiên cứu 1 Nghiên cứu quy trình nhân giống cây Ngưu tất trong ống nghiệm - Nghiên cứu khử trùng hạt để có mẫu sạch ban đầu trong ống nghiệm - Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng lên sự phát sinh hình thái cây Ngưu tất trong ống nghiệm - Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh thông qua thăm dò ảnh hưởng của nồng độ NAA hoặc IBA - Nghiên cứu đưa cây ra môi trường tự nhiên 2... nhân nhanh và bảo tồn cây màng tang (Litsea verticiliata) được tìm thấy ở vườn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 18 Quốc gia Cúc Phương bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật [6] Năm 2006, Nguyễn Phú Lịch, Nguyễn Thị Tâm, Lê Ngọc Công đã tiến hành đề tài "Bước đầu nghiên cứu nhân giống Thanh hao hoa vàng (Artemisia annual L.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro"... đũa [12] 1.1.3 Kĩ thuật trồng, chăm sóc, thu hái và bảo quản sau thu hoạch Kỹ thuật trồng cây Ngưu tất Chọn đất và làm đất: Ngưu tất ưa đất thịt pha cát, tơi xốp, nhiều mùn Đất phù sa, cao ráo, thoát nước rất hợp với Ngưu tất Đất nhiều cát sỏi, bạc màu, đất chua mặn không trồng được Ngưu tất Ruộng trồng Ngưu tất phải được cày bừa, đập đất kỹ Cày hoặc cuốc sâu có tác dụng làm cho rễ Ngưu tất dài, ăn sâu,... dụng kĩ thuật RAPD để phân biệt các loài phụ và thiết lập sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ giữa các đối tượng nghiên cứu đối với lúa và các loại cây trồng như ngô, đu đủ, hành tây, xoài, cỏ đinh lăng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 22 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Vật liệu thực vật Sử dụng hạt giống cây Ngưu tất (Achyranthes. .. thấy, môi trường WPM là khoáng cơ bản thích hợp nhất cho nuôi cấy chồi đỉnh; tỷ lệ phát sinh chồi cao nhất ở môi trường WPM bổ sung tổ hợp BAP 0,1mg/l + IBA 0,3mg/l [2] Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm mục tiêu bảo tồn và phát triển cây thông đỏ, tác giả Trần Văn Định, Trần Văn Minh (2007) đã sử dụng chồi đỉnh và chồi bên làm vật liệu nuôi cấy Chồi non sau khi được vô trùng bằng natri... hành nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đối với những đối tượng khó tái sinh cây trực tiếp Thông qua giai đoạn mô sẹo có thể thu được những cây sạch virus [27] 1.4.3 Một số thành tựu trong nhân giống cây trồng bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro Nhân giống bằng nuôi cấy mô đã trở thành một trong những phương thức quan trọng nhất để nhân nhanh, đặc biệt với những cây trồng khó nhân bằng các phương thức truyền... kinh tế như cây gia vị (sa nhân, gừng, hạt tiêu), cây công nghiệp (cà phê, chè, mía), cây lâm nghiệp (tếch, bạch đàn), cây lương thực (khoai tây, lúa mì, lúa lai) [18] Ngày nay, ở Việt Nam, các sở khoa học công nghệ của hầu hết các tỉnh đều đã có phòng nuôi cấy mô tế bào để sản xuất cây trồng có lợi ích kinh tế cao, đáp ứng nhu cầu sản xuất của địa phương Hầu hết các trường Đại học, Viện nghiên cứu . PHÓ THỊ THUÝ HẰNG NGHIÊN CỨU BẢO TỒN VỐN GEN CÂY NGƯU TẤT (ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH. PHẠM PHÓ THỊ THUÝ HẰNG NGHIÊN CỨU BẢO TỒN VỐN GEN CÂY NGƯU TẤT (ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã. gieo trồng. Chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu bảo tồn vốn gen cây Ngưu tất (Achyranthes Bidentata Blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu