3. Nội dung nghiên cứu
2.2.1.Phƣơng pháp nuôi cấy invitro
2.2.1.1. Phƣơng pháp pha môi trƣờng nuôi cấy
Nguyên tắc: pha môi trường nuôi cấy có thành phần và nồng độ các chất phù hợp với đối tượng và mục đích nuôi cấy.
Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin...tất cả các hoá chất phải được hoà tan đều không kết tủa. Tuỳ theo đối tượng và mục đích nuôi cấy mà bổ sung vào môi trường MS các chất kích thích sinh trưởng phù hợp. Môi trường có thể được bổ sung thêm các chất độn làm giá đỡ thì không quá rắn hoặc quá mềm để khi nuôi
cấy mẫu vật được dễ dàng. Khử trùng môi trường theo phương pháp Pasteur [27].
Các bước tiến hành pha môi trường
Sau khi xác định được công thức môi trường cần pha, tính thể tích các hoá chất cần sử dụng trong môi trường nuôi cấy.
Ví dụ: pha 1 lit môi trường nhân nhanh Ngưu tất có công thức sau: MS + 30g saccharose + 9g aga + 2g than hoạt tính + 200ml nước dừa + BAP 2,0mg được tiến hành như sau:
- Chuẩn bị: dụng cụ (cốc đong, bình tam giác, pipet...) rửa sạch, sấy khô, dùng ống đong để lấy các hoá chất cần thiết. Thạch aga, đường, than hoạt tính cho vào giấy thấm để cân.
- Đong 0,5 lit nước cất + 200ml nước dừa đặt lên bếp đun
- Khi hỗn hợp gần sôi cho từ từ 9g thạch aga vào, vừa cho vừa khuấy đều cho thạch tan hết. Sau đó bổ sung 2g than hoạt tính, 30g đường
- Khi thạch aga, than hoạt tính, đường tan hết thì bổ sung dung dịch MS và chất kích thích sinh trưởng đã chuẩn bị. Khuấy đều.
- Định lượng hỗn hợp dung dịch trên bằng nước cất cho đủ 1 lit. - Đo pH (pH môi trường nuôi cấy thường là 5,8)
- Chia đều hỗn hợp nuôi cấy vào các bình tam giác, mỗi bình khoảng 50 ml môi trường. Sau đó nút nút bông và nắp giấy (nút bông không nên quá chặt hoặc quá lỏng vì quá lỏng dễ bị nhiễm, nếu quá chặt không khí không được lưu thông sẽ ảnh hưởng đến quá trình hô hấp của cây).
- Hấp khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 1200C, áp suất 1,0 – 1,2 atm, thời gian 22 phút. Khi lấy môi trường ra khỏi nồi hấp thì lắc nhẹ bình tam giác để các chất tan đều trong môi trường nuôi cấy. Để môi trường sau khi hấp khử trùng 2 – 3 ngày để ổn định mới sử dụng để cấy mẫu.
2.2.1.2. Khử trùng hạt
Hạt được bỏ vỏ, loại bỏ những hạt thối, sâu, mốc.
Trước khi tiến hành nuôi cấy cần khử trùng box cấy và buồng cấy bằng đèn UV trong khoảng thời gian 45 – 60 phút, khử trùng bộ đồ cấy bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn.
Hạt được đưa vào trong box cấy để khử trùng. Hạt được tráng sạch 5 lần bằng nước cất khử trùng, sau đó ngâm hạt trong dung dịch ethanol 70% trong khoảng thời gian 45 giây. Tiếp tục cho hạt ngâm trong dung dịch javen 60%, lắc đều trong khoảng thời gian 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 phút. Sau đó rửa sạch hạt 5 lần bằng nước cất khử trùng.
Sau khi khử trùng, hạt được cấy lên môi trường MS cơ bản, 30 hạt/1bình. Đánh giá kết quả sau 1 tuần nuôi cấy. Theo dõi các chỉ số sau:
+ Tỷ lệ bình không bị nhiễm/tổng lượng bình nuôi cấy. + Tỷ lệ hạt nảy mầm/tổng lượng hạt nuôi cấy. + Kích thước, hình thái mầm.
2.2.1.3. Nhân chồi
Các đoạn thân thu được từ bước khử trùng nói trên được cấy lên môi trường nhân chồi có bổ sung BAP có nồng độ từ 0,5mg; 1,0mg; 1,5mg; 2,0mg; 2,5mg; 3,0mg; 3,0mg cho 1 lit môi trường hoặc kinetin với nồng độ 0,5mg; 1,0mg; 1,5mg; 2,0mg, 2,5mg cho 1 lit môi trường hoặc cấy lên môi trường tạo đa chồi (môi trường tổ hợp chất KTST BAP + α-NAA và kinetin + α-NAA). Bình nuôi cấy được đặt trong phòng cây với cường độ ánh sáng đèn 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10giờ/ngày, nhiệt độ 250
C – 270C [27]. Kết quả đánh giá sau 15 ngày, 30 ngày nuôi cấy. Theo dõi các chỉ số sau:
+ Màu sắc, hình dạng chồi + Số lượng chồi/đoạn thân + Kích thước trung bình chồi
2.2.1.4. Tạo cây hoàn chỉnh
Những chồi tạo ra trên môi trường nhân nhanh có kích thước 1 – 1,5cm, được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ có bổ sung chất kích thích sinh trưởng α – NAA với nồng độ 0,1mg; 0,2mg; 0,3mg; 0,4mg; 0,5mg trong 1 lit môi trường. Kết quả nuôi cấy được đánh giá sau 15 ngày, 30 ngày. Theo dõi các chỉ số sau:
+ Tỷ lệ tạo rễ
+ Số rễ trung bình/chồi + Kích thước trung bình rễ
2.2.1.5. Đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên
Các cây được cấy vào môi trường ra rễ 3 – 4 tuần, khi đã có bộ rễ dài, khoẻ, lá xanh, đẹp, đang thời kì sung sức thì đưa ra môi trường tự nhiên.
Các bình cây mở nắp, đổ nước vào ngâm 15 phút, sau đó lắc nhẹ để thạch rời ra khỏi rễ, dùng panh gắp nhẹ các cây ra khỏi bình không để dập nát. Ngâm cây trong chậu nước sạch, sau đó rửa dưới vòi nước cho hết thạch bám vào rễ. Cắt tỉa bớt rễ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ngưu tất là cây ưa đất thịt pha cát, tơi xốp, nhiều mùn. Trồng cây trên giá thể đất trộn chấu hun theo tỷ lệ đất:cát:trấu là 1:1:1. Giá thể được đựng vào khay với bề dày 10cm. Trồng cây con vào khay sau đó tưới nước nhẹ nhàng cho chặt gốc cây.
Trong 2 – 3 ngày đầu tưới nước lã bằng cách phun sương 3 giờ/lần. Trời rét phải che nilon tránh rét và tránh thoát nước nhanh. Nilon phải đục lỗ thoáng khí. Sau 3 ngày có thể bỏ nilon che, để khay nơi đủ ánh sáng, thoáng khí, tránh nắng, mưa trực tiếp. Tưới nước bằng bình phun 2 – 3 lần/ngày. Sau 10 ngày tưới cây bằng dung dịch MS pha loãng với tỷ lệ 1/10, ngày 1 lần. Sau 3 – 4 tuần cây sống, ra rễ mới, lá mới là có thể đưa ra vườn ươm.
Đánh giá kết quả sau khi ra cây 3 – 4 tuần, cho đến khi cây sống được và ra rễ mới, lá mới là ta có thể đánh giá được kết quả ra cây bằng cách tính tỷ lệ % số cây sống [27] .