3. Nội dung nghiên cứu
2.2.3.Phƣơng pháp sinh học phân tử
Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, khi tiến hành nuôi cấy in vitro
trong thời gian dài thường làm giảm khả năng sinh trưởng, phát triển của cây, thậm chí còn tạo nên một số đột biến do sử dụng các chất kích thích sinh
trưởng. Vì vậy, chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD để đánh giá sự ổn định về mặt di truyền của cây nuôi cấy in vitro thông qua sự so sánh về mặt sinh học phân tử giữa cây trồng bằng hạt và cây nuôi cấy in vitro.
2.2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số từ lá Ngƣu tất
Quy trình tách chiết ADN tổng số từ lá Ngưu tất được thực hiện theo phương pháp của Gawel và CS [39].
Nguyên liệu: lấy lá non của cây Ngưu tất trồng bằng hạt (NT1) và lá non của cây nuôi cấy in vitrro ở các lô thí nghiệm bổ sung: BAP 2,5mg/l (NT2); kinetin 1,5 mg/l (NT3); BAP 2,5mg/l + α-NAA 0,4 mg/l (NT4); kinetin 1,5 mg/l + α-NAA 0,4 mg/l (NT5) làm nguyên liệu tách chiết ADN. Mẫu vật được bảo quản ở tủ lạnh sâu -850C hoặc sử dụng ngay.
Đệm tách: 2ml Tris HCl 1M (pH=8); 5,6ml NaCl 5M; 0,8ml EDTA 0,5M (pH=8); 0,8g CTAB (4%); 11,6ml H2O (khử trùng).
Đệm rửa: Tris HCl 1M: 4ml (pH=8); Sorbitol 2M: 7ml; 0,4ml EDTA
0,5M (pH=8); NaH2PO4.H2O: 0,184g (0,4%); 28,6ml H2O (khử trùng). Quy trình tách chiết ADN tổng số được thực hiện theo các bước sau: (1) Cân 200 mg lá Ngưu tất non cho vào ống eppendorf 2ml
(2) Cho nitơ lỏng vào ống có chứa mẫu vật. Nghiền nhanh bằng đũa thuỷ tinh thành dạng bột mịn.
(3) Bổ sung 800µl đệm tách ADN, đảo nhẹ để tạo thành hỗn hợp đồng nhất, ủ trong 180 phút ở 650C (5 phút lắc đều một lần).
(4) Để nguội ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
(5) Bổ sung 700 µl hỗn hợp Chloroform:isoamyl (24:1) trộn đều trong 20 phút (dùng máy trộn càng tốt).
(6) Li tâm 15 phút, 13000vòng/phút trong 10 phút để phân tách thành 2 pha, hút cẩn thận 500 µl dịch nổi cho vào ống eppendorf 1,5ml mới (bỏ tủa).
(7) Thêm 500 µl isopropanol, mix nhẹ, đặt lên đá (để ngăn đá tủ lạnh qua đêm), chờ có tủa trắng.
(8) Li tâm 5 phút, 13000 vòng/phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. (9) Bổ sung 300 µl cồn 70%, búng nhẹ. Li tâm 5 phút, 13000 vòng/phút, loại bỏ cồn. Bước này thực hiện 3 lần.
(10) Làm khô ADN bằng máy speen – vac hoặc để trong box bật quạt. (11) Hoà tan ADN trong 200µl nước khử trùng (hoặc TE), giữ ở tủ - 200C đến khi sử dụng.
2.2.3.2. Xác định độ tinh sạch của ADN bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose
Tạo bản gel agarose 0,8% trong TAE 1X. Tra mẫu và chạy diện di ở hiệu điện thế 80V – 110V trong 30 phút. Sản phẩm điện di được nhuộm bằng Ethidium Bromide 0,5µl/ml trong 10 phút, rửa sạch bằng nước cất, soi gel trên đèn UV và chụp ảnh. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra được nồng độ và độ tinh sạch của ADN trong mẫu vật đã tách chiết.
2.2.3.3. Phản ứng PCR - RAPD
Phản ứng PCR – RAPD được tiến hành dựa theo phương pháp của William và CS (1990) có cải tiến [42]. Sử dụng 5 mồi ngẫu nhiên cho phản ứng RAPD để phân tích hệ gen của giống Ngưu tất được trồng tự nhiên và giống Ngưu tất được nuôi cấy trong ống nghiệm. Các mồi được sử dụng có kí hiệu và trình tự được thể hiện trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Trình tự nucleotit của 5 đoạn mồi ngẫu nhiên STT Tên mồi Trình tự mồi
1 OPF10 5’GGAAGCTTGG3’
2 OPH04 5’GGAAGTCGCC3’
3 OPN05 5’ACTGAACGCC3’
4 OPP15 5’GGAAGCCAAC3’
5 OPP19 5’GGGAAGGACA3’
- Mỗi ống phản ứng PCR có 25 l dung dịch chứa 1X đệm PCR; 2,5 mM MgCl2; 100 l 4dNTPs; 200 nM đoạn mồi; 0,125 đơn vị Taq polymeraza và 10 ng ADN khuôn.
- Phản ứng PCR-RAPD thực hiện trong máy PCR - Thermal Cycler PTC 100 theo chu trình nhiệt:
+ Bước 1: 940C trong 3 phút + Bước 2: 920C trong 1 phút + Bước 3: 350C trong 1 phút + Bước 4: 720C trong 1 phút + Bước 5: 720C trong 10 phút + Bước 6: Lưu giữ ở nhiệt độ 40C
Chu kì nhiệt từ bước 2 đến bước 4 được lặp lại 45 chu kì. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sản phẩm PCR – RAPD được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,8%. Nhuộm gel bằng Ethidium Bromide 0,5µg/ml trong 15 phút, rửa sạch bằng nước cất, soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.
2.2.3.4. Phân tích số liệu RAPD
Dựa trên ảnh điện di sản phẩm PCR – RAPD 5 mẫu cây Ngưu tất với 5 mồi ngẫu nhiên, ta thống kê các băng vạch điện di theo quy ước:
Số 1: xuất hiện phân đoạn ADN
Số 0: không xuất hiện phân đoạn ADN
Số liệu được mã hoá và phân tích bằng phần mềm NTSYSpc Version 2.02i (Applied Biostatistisc Inc., USA., 1998).
Hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content =PIC) của mỗi cặp mồi xác định theo công thức (1). Trong đó Pij là tần số allen thứ j của gen i được kiểm tra.