3. Nội dung nghiên cứu
1.4.2.Các phƣơng thức nhân giống invitro
* Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng
Theo Đỗ Năng Vịnh (2005), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu vật nuôi cấy được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước 0,1mm tính từ chóp của chóp đỉnh sinh trưởng. Nhưng trong thực tế việc nuôi cấy các mẫu vật như vậy rất khó thành công, người ta chỉ tiến hành nuôi cấy đỉnh sinh trưởng với mục đích làm sạch virus cho cây trồng. Trong thực tế đỉnh sinh trưởng thường được tách với kích thước từ 5mm – 10mm [27].
Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng cần chú ý tới tương quan giữa độ lớn chồi, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi. Thông thường khi độ lớn của chồi tăng thì tỷ lệ sống của chồi tăng và tính ổn định tăng và ngược lại. Nhưng xét hiệu quả kinh tế nuôi cấy thì khi độ lớn của chồi tăng hiệu quả kinh tế sẽ giảm và khi độ lớn của chồi giảm, hiệu quả kinh tế sẽ tăng. Do vậy phải kết hợp các yếu tố để tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu.
Căn cứ về nguồn gốc của các cây tái sinh từ mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng thì có ba khả năng: cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn), cây phát triển từ chồi nách phá ngủ, cây phát triển từ chồi nách mới phát sinh. Tuy nhiên trong thực tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh. Có hai phương thức hình thành cây tái sinh từ nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng.
Cây tái sinh trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách phá ngủ. Phương thức này chủ yếu gặp ở các đối tượng 2 lá mầm như khoai tây, thuốc lá, chanh, cam, hoa cúc, và một số cây 1 lá mầm như dứa, sợi, mía...Cây tái sinh qua giai đoạn hình thành dẻ hành (protocom), chủ yếu gặp ở các đối tượng 1 lá mầm như phong lan, hoa huệ...Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo thành hàng loạt protocom và các protocom này có thể tiếp tục phân chia thành các
protocom mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bằng phương pháp này, trong một thời gian ngắn có thể thu được hàng triệu cá thể, do đó đem lại hiệu quả nuôi cấy lớn. Gần đây phương thức này đã bắt đầu được áp dụng có kết quả ở các cây ăn quả và cây lâm nghiệp, trong đó có các loại cây quý như cà phê, táo, lê, thông, bồ đề...Tổng số có trên 30 chi khác nhau đã được nuôi cấy thành công [27].
* Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây
Tế bào thực vật có tính toàn năng nên ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng các bộ phận còn lại của cây đều có thể được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy in vitro. Ở thuốc lá, cam, chanh...người ta thường sử dụng đoạn thân, mảnh lá của thuốc lá, cà chua, bắp cải..., cuống lá ở Nacissus, các bộ phận của hoa như súp lơ, lúa mì...và nhánh củ ở hành, tỏi...
* Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo
Phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ mẫu vật ban đầu không những nhanh chóng thu được cây mà khá đồng đều về mặt di truyền. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh ngay mà phát triển thành khối mô sẹo. Tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Do đó nhất thiết phải sử dụng mô sẹo vừa mới phát sinh (mô sẹo sơ cấp) thì mới thu được cây đồng nhất. Vì vậy, người ta chỉ tiến hành nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đối với những đối tượng khó tái sinh cây trực tiếp. Thông qua giai đoạn mô sẹo có thể thu được những cây sạch virus [27].
1.4.3. Một số thành tựu trong nhân giống cây trồng bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro
Nhân giống bằng nuôi cấy mô đã trở thành một trong những phương thức quan trọng nhất để nhân nhanh, đặc biệt với những cây trồng khó nhân bằng các phương thức truyền thống. Năm 1960, Cooking (Anh) đã dùng men
cellulase để phân hủy cellulose của tế bào thực vật và đã thu được các tế bào trần (protoplast). Đến năm 1971 Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast thuốc lá giống xanthi. Do các protoplast có khả năng dung hợp với nhau trong các điều kiện nhất định và hấp thụ các phân tử lớn hoặc thậm chí các cơ quan tử bên ngoài, nên các nhà nuôi cấy mô thực vật đặt hy vọng lớn vào kĩ thuật protoplast để chọn giống có hiệu quả hơn. Hy vọng này hoàn toàn được thực tế xác nhận khi Melchers (1977) lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây [27].
Nuôi cấy mô tế bào được xem là phương pháp hiệu quả nhất để tạo củ giống chất lượng cao với số lượng lớn, ổn định, đồng nhất về mặt di truyền, đáp ứng mục đích sản xuất củ trên quy mô thương mại ở nhiều giống lilium. Năm 2001, Nhut và CS đã tiến hành nhân giống tạo củ nhỏ Lily từ lát cắt mỏng mẫu ban đầu, có thể là củ, lá, đoạn thân non, chồi và các thành phần của hoa. Nuôi cấy mô mía đã được thực hiện từ năm 1961 ở Hawai (Nickell, 1961; Nickell, 1967) đã xây dựng quy trình nhân nhanh chồi mía in vitro. Nghiên cứu tạo mô sẹo từ mô lá non và mô rễ non của cây mía kết quả cho thấy mô lá non và thân non có khả năng tạo mô sẹo và tái sinh thành cụm chồi tốt hơn so với mô rễ (Sauvaire và Galzy, 1980) [27].
Theo Murashige (1974), có khoảng 300 loại cây có thể nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Khoảng 600 công ty trên thế giới áp dụng công nghệ này để nhân trên 500 triệu cây con trồng 1 năm. Chủ yếu là các giống hoa, cây cảnh, cây ăn quả, cây công nghiệp, cây lâm nghiệp và một số rau. Trung Quốc là nước có công nghệ nuôi cấy mô phát triển rất nhanh ở thập kỉ 70 – 80 của thế kỷ XX. Hàng năm nhân nhanh khoảng 100 loài cây trồng quan trọng như đào, lê, mận, táo...Tạo các giống cây tam bội không hạt bằng cách nuôi cấy nội nhũ như dưa hấu tam bội, hồng không hạt... [27].
Ở Ấn Độ, năm 1989 cả nước chỉ có 4 cơ sở nuôi cấy mô với công suất 5 triệu cây con/năm, đến năm 1996 đã tăng lên 75 công ty và sản xuất khoảng 190 triệu cây giống/năm. Nhiều công ty đã chuyên môn hoá trong việc sản xuất giống cây trồng có giá trị kinh tế như cây gia vị (sa nhân, gừng, hạt tiêu), cây công nghiệp (cà phê, chè, mía), cây lâm nghiệp (tếch, bạch đàn), cây lương thực (khoai tây, lúa mì, lúa lai)...[18].
Ngày nay, ở Việt Nam, các sở khoa học công nghệ của hầu hết các tỉnh đều đã có phòng nuôi cấy mô tế bào để sản xuất cây trồng có lợi ích kinh tế cao, đáp ứng nhu cầu sản xuất của địa phương. Hầu hết các trường Đại học, Viện nghiên cứu Sinh học đều có phòng thí nghiệm nuôi cấy mô với mục đích xây dựng và phát triển các phương pháp nghiên cứu phù hợp với điều kiện trang thiết bị ở Việt Nam. Tuy ngành nuôi cấy mô tế bào ở nước ta còn non trẻ song cũng đã thu được nhiều kết quả quan trọng như vi nhân giống dứa, chuối, phong lan, hoa hồng, cúc, cẩm chướng...và nhiều thành công khác trong chọn dòng tế bào, nuôi cấy bao phấn để tạo dòng thuần. Thành công đầu tiên là nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá của Lê Thị Muội và CS (thập niên 80 của thế kỷ XX). Sau đó, tại Phân viện khoa học Việt Nam ở thành phố Hồ Chí Minh, Đại học Nông Nghiệp I - Hà Nội, Viện Khoa học kĩ thuật Nông nghiệp Việt Nam...sử dụng phương pháp vi nhân giống đã tạo ra giống khoai tây củ bi. Phương pháp vi nhân giống này đã khắc phục được khó khăn về giống trong sản xuất, làm giảm chi phí sản xuất khoai tây [18].
Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn nhưng hiện đang bị chặt phá do nhiều nguyên nhân khác nhau. Góp phần cung cấp nguồn giống cây rừng phục vụ cho công tác phủ xanh đất trống, đồi núi trọc của nước ta, hàng loạt quy trình nhân giống in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu nhằm tạo số lượng lớn cây giống có chất lượng tốt. Nguyễn Thế Anh, Trần Văn Minh (2007) sử dụng chồi đỉnh lấy từ cây 1,0 – 1,5 tuổi nuôi cấy trên môi trường
WPM, ½ WPM, ½ MS bổ sung BAP, IAA, IBA, kinetin, Rib và nước dừa. Kết quả cho thấy, môi trường WPM là khoáng cơ bản thích hợp nhất cho nuôi cấy chồi đỉnh; tỷ lệ phát sinh chồi cao nhất ở môi trường WPM bổ sung tổ hợp BAP 0,1mg/l + IBA 0,3mg/l [2]. Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm mục tiêu bảo tồn và phát triển cây thông đỏ, tác giả Trần Văn Định, Trần Văn Minh (2007) đã sử dụng chồi đỉnh và chồi bên làm vật liệu nuôi cấy. Chồi non sau khi được vô trùng bằng natri hypochlorit được nuôi cấy trên môi trường MS, WPM, B5, WV3 có bổ sung BAP. Kết quả thu được, chồi thông đỏ phát sinh cao nhất từ ngọn chính, tuổi mẫu 18 tháng. Môi trường bổ sung BAP 5mg/l + kinetin 1mg/l + AgNO3 150mg/l thích hợp cho nhân chồi. Cây thông đỏ ra rễ tốt nhất sau 75 ngày nuôi cấy trên môi trường WPM có bổ sung NAA 1mg/l kết hợp với Rhizopon 50mg/l [7]. Vi nhân giống cây trai Nam Bộ được tác giả Khưu Hoàng Minh, Trần Văn Minh (2007) nghiên cứu nhằm bảo tồn nguồn gen quý và tạo giống cây sạch bệnh phục vụ công tác tái sinh rừng. Khả năng tạo cụm chồi tốt nhất ở môi trường WPM có bổ sung BAP 1mg/l, môi trường WPM bổ sung BAP 0,5mg/l là thích hợp nhất với nhân cụm chồi. Cây ra rễ tốt nhất trên môi trường có bổ sung IBA 0,3mg/l [17]. Năm 2009, Nguyễn Thị Tâm và CS đã nghiên cứu quy trình nhân giống cây dẻ Trùng Khánh bằng kỹ thuật in vitro. Đề tài đã góp phần bảo tồn nguồn gen quý của giống dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng [23].
Việt Nam có hàng ngàn cây thuốc quý hiếm được ghi trong sách đỏ. Nhiều loài cây thuốc đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng do khai thác quá mức. Để bảo tồn nguồn gen những cây thuốc quý, quy trình nhân giống cây dược liệu được nhiều tác giả quan tâm như: nhân giống dòng Kava có hoạt tính sinh học cao của Đinh Đoàn Long và CS (2004) [11]. Lê Xuân Đắc, Lê Thị Xuân, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình và CS (2004) tiến hành nhân nhanh và bảo tồn cây màng tang (Litsea verticiliata) được tìm thấy ở vườn
Quốc gia Cúc Phương bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật [6]. Năm 2006, Nguyễn Phú Lịch, Nguyễn Thị Tâm, Lê Ngọc Công đã tiến hành đề tài "Bước đầu nghiên cứu nhân giống Thanh hao hoa vàng (Artemisia annual L.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro". Đề tài đã xác định có thể sử dụng môi trường MS cơ bản hoặc môi trường MS bổ sung BAP 1,5mg/l hay kinetin 1,5mg/l để nhân giống cây Thanh hao hoa vàng, môi trường bổ sung α-NAA 0,3mg/l là môi trường ra rễ thích hợp nhất [10]. Với công trình dòng hóa cây Thanh hoa
(Artemisia annua L.) in vitro tác giả Nguyễn Thị Kim Uyên, Trần Văn Minh
(2007) đã nhân giống trên môi trường LV. Kết quả cho thấy môi trường LV có bổ sung BAP 0,3mg/l chồi phát triển tốt nhất. Khi bổ sung BAP, NAA và 2,4-D riêng rẽ không kích thích phát sinh phôi soma nhưng khi bổ sung NAA và 2,4-D riêng rẽ lại kích thích tạo rễ. Môi trường LV bổ sung tổ hợp BAP 0,5mg/l + NAA 2,4-D 0,5mg/l là môi trường thích hợp nhất cho nuôi cấy tăng sinh tế bào soma [28]. Hiện nay, Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu và bước đầu hoàn thiện nhiều quy trình nhân giống như : nhân nhanh giống hoa đồng tiền nhập nội từ Thái Lan, Trung quốc; tạo củ trực tiếp từ lát cắt vảy củ in vitro ở giống hoa lilium, nhân nhanh các cây trồng lâm nghiệp, cây ăn quả như: tếch, bạch đàn, mía, cam, quýt...[27].
1.5. Ứng dụng kĩ thuật RAPD trong phân tích sự đa dạng di truyền
RAPD (Random Amplyfied Polymorphysm ADN) là kỹ thuật mới được ứng dụng trong những năm gần đây ở Việt Nam. RAPD có nhiều ưu điểm nổi bật như: có khả năng phát hiện hiện tượng đa hình ADN trên một phạm vi rộng, thao tác đơn giản, nhanh gọn, ít tốn kém, không cần biết trước trình tự gen của đối tượng cần nghiên cứu, chất lượng ADN không cần độ tinh sạch cao…[40]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, RAPD là kỹ thuật đem lại hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và đa dạng di truyền, nghiên cứu nguồn gốc loài và lập bản đồ di truyền thực vật. Vì vậy, kỹ thuật RAPD
thường được sử dụng kết hợp với nhiều kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao.
Kĩ thuật RAPD là kĩ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên do hai nhóm nghiên cứu của Williams và CS (1990) và Welsh và McClelland (1991) đồng thời xây dựng. Đây là một kĩ thuật phát hiện chỉ thị di truyền dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR). [41];[42].
Các yếu tố cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm: ADN khuôn mẫu; đoạn mồi (primer) có chiều dài khoảng 10 base, Taq polymerase (enzyme chịu nhiệt được tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus); Bốn loại deoxyribonucleotit triphotphat (dATP, dTTP, dCTP, dGTP); ion Mg2+ và dung dịch đệm.
Từ khi ra đời, kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rộng rãi cho nhiều đối tượng khác nhau như: đậu xanh, đậu tương, đu đủ, lạc, lúa, chuối…trong việc đánh giá đa dạng di truyền giữa các giống trong phạm vi một loài, phân tích và đánh giá bộ genome thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức phân tử. Để đánh giá sự thay đổi di truyền của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước, Đinh Thị Phòng đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để chỉ ra sự sai khác ở mức độ phân tử giữa các đối tượng này. Nhóm tác giả này cũng đã sử dụng 11 đoạn mồi ngẫu nhiên để đánh giá tính đa dạng của một số giống lạc trong tập đoàn giống ICRISAT chống chịu bệnh gỉ sắt, kết quả thu được 109 phân đoạn ADN trong đó có 66 phân đoạn đa hình, chiếm 60,6% [24].
Việt Nam là nước nông nghiệp với sản lượng xuất khẩu lương thực, thực phẩm cao trên thế giới nên cây lương thực, thực phẩm được nhiều nhà khoa học quan tâm. Với mục đích nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số giống lạc trồng (Archis hypogaea L.), Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Hoa Lan
(2003) đã phân tích sự đa dạng di truyền giữa 12 giống lạc là L02, L03, L05, L08, L12, L15, L16, LVT, Sen Nghệ An, Đỏ Bắc Giang, Phú Thọ. Phân tích hệ gen 12 giống lạc với 5 mồi phản ứng ngẫu nhiên nhận được 32 phân đoạn ADN, trong đó có 15 phân đoạn đa hình chiếm 46,9%, 4 mồi cho kết quả đa hình là RA31, RA36, RA46, RA142. Kết quả phân tích RAPD cho thấy ADN của 12 giống lạc có cấu trúc khác nhau, giữa các giống lạc có sự sai khác di truyền với hệ số từ 0,03 – 0,13 [15]. Với mục đích nghiên cứu sự đa dạng kiểu gen và kiểu hình chịu hạn của một số giống lúa cạn địa phương miền núi, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Vân Anh (2007) đã nghiên cứu trên 12 giống lúa cạn ở 3 tỉnh Sơn La, Bắc Kạn, Cao Bằng. Kết quả phân tích đã chia các giống lúa thành 4 nhóm với khoảng cách di truyền giữa các giống lúa cạn là 7,69 – 34,00% và hệ số đa dạng di truyền của hệ gen lúa cạn Hg – 52,37% [16]. Từ kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn, Lò Thị Mai Thu, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Bình (2008) tiếp tục xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa cạn ở mức phân tử ADN bằng kỹ thuật RAPD. Kết quả đã nhân bản được 182 phân đoạn ADN từ hệ gen của 7 giống lúa cạn. Năm mồi sử dụng đều thể hiện tính đa hình, trong đó mồi M13 cho (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});