tạo vật liệu phục vụ chọn dòng chịu hạn ở giống đậu xanh vn93 - 1 và vc1973a bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM BÙI HỒNG XUYẾN TẠO VẬT LIỆU PHỤC VỤ CHỌN DÒNG CHỊU HẠN Ở GIỐNG ĐẬU XANH VN93 – VÀ VC1973A BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 8/2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Chu Hoàng Mậu tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Thị Tâm, TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh anh chị Nguyễn Thị Thủy (Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Tế bào), CN Hồng Văn Mạnh (Viện khoa học Sự sống – ĐH Thái Nguyên) giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp thầy cô giáo, cán khoa Tôi xin cảm ơn Bộ môn hệ thống canh tác – Viện Ngô Trung ương cung cấp giống đậu xanh làm vật liệu nghiên cứu luận văn Tôi xin cảm ơn động viên, khích lệ gia đình, bạn bè suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn Tác giả Bùi Hống Xuyến Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4D Axit 2,4 – Dichlorphenoxyacetic ADN Axit deoxyribonucleic AVRDC Trung tõm Nghiờn cứu Phỏt triển rau chõu Á Cs Cộng Hecta NAA Axit naphthyl acetic (Naphthyl acetic acid) NSG Ngày sau gieo Kb Kilobase MS Murashige and Skoog (Môi trường theo Murashige Skoog) PCR Polymerase Chain Reaction RADP Random Amplified polymorphic ADN ( Đa hỡnh cỏc phõn đoạn ADN nhân ngẫu nhiên) TAE Tris acetate EDTA SDS Sodium Dodecyl Sulphat Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Đặc điểm nông học suất hai giống đậu xanh nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Trình tự nucleotit 10 mồi RADP sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 3.1 Độ nước mô sẹo phôi đậu xanh sau sử lý thổi khô (% khối lượng tươi) 26 Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót (%) mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô tuần nuôi phục hồi 28 Bảng 3.3 Khả tái sinh từ mơ sẹo phơi đậu xanh sống sót sau xử lý thổi khô 30 Bảng 3.4 Mức biến động di truyền quần thể R 0, R1 giống đậu xanh VC1973A 33 Bảng 3.5 Thời gian sinh trưởng phát dục (ngày) 34 Bảng 3.6 Các dòng chọn lọc từ R1 37 Bảng 3.7 Độ tinh hàm lượng ADN mẫu đậu xanh 40 Bảng 3.8 Tổng số phân đoạn ADN nhân mẫu đậu xanh phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên 42 Bảng Phân tích đa hình phân đoạn ADN nhân với 10 mồi ngẫu nhiên 43 Bảng 3.10 Hệ số sai khác di truyền dòng chọn lọc giống gốc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Độ nước mô sẹo phôi đậu xanh sau xử lý thổi khô 27 Hình 3.2 Tỷ lệ sống sót (%) mơ sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô nuôi phục hồi môi trường tái sinh 28 Hình 3.3 Khả tái sinh mơ sẹo phơi đậu xanh sống sót sau xử lý thổi khô Hình 3.4 Ảnh mơ sẹo xử lý thổi khơ (Giống VC1973A) 30 35 Hình Một số hình ảnh tái sinh sau xử lý thổi khô (Giống VC1973A) 35 Hình 3.6 Một số hình ảnh quần thể R0, R1 đồng ruộng 38 Hình 3.7 Một số hình ảnh dịng tái sinh Quần thể VC1973A đối chứng 38 Hình 3.8 Kết điện di ADN tổng số tách từ mẫu đậu xanh 40 Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP mẫu đậu xanh với Mồi M1 44 Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP mẫu đậu xanh với Mồi M2 45 Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP mẫu đậu xanh với Mồi M3 45 Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP mẫu đậu xanh với Mồi M5 46 Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP mẫu đậu xanh với Mồi M6 46 Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP mẫu đậu xanh với Mồi M7 47 Hình 3.15 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP mẫu đậu xanh với Mồi M8 48 Hình 3.16 Sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền dòng chọn lọc giống gốc 49 Hình 3.17 Các dòng đậu xanh ưu việt R1 53 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Mở đầu 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sinh học đậu xanh, tình hình sản xuất đậu xanh giới Việt Nam 1.1.1 Đặc điểm sinh học đậu xanh 1.1.2 Tình hình sản xuất đậu xanh giới Việt Nam 1.2 Hạn chế chịu hạn thực vật 1.2.1 Tính chịu hạn tác động hạn đến thực vật 1.2.1.1 Tính chịu hạn thực vật 1.2.1.2 Nguyên nhân gây hạn tác động hạn đến thực vật 1.2.2 Cơ sở sinh lý, hoá sinh sinh học phân tử tính chịu hạn 12 1.2.2.1 Cơ sở sinh lý tính chịu hạn 12 1.2.2.2 Cơ sở sinh hố tính chịu hạn 13 1.2.2.3 Cơ chế phân tử tính chịu hạn 16 1.3 Một số thành tựu nuôi cấy mô tế bào thực vật vào việc đánh giá khả chịu hạn chọn dòng biến dị xoma 18 1.4 Sử dụng kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) nghiên cứu đa dạng di truyền mức phân tử 19 1.4.1 RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) 19 1.4.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền RAPD 20 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu nghiên cứu 23 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2 Hóa chất, thiết bị địa điểm nghiên cứu 23 2.2.1 Hóa chất 23 2.2.2 Thiết bị 23 2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 23 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 24 2.3.1.1 Tạo mô sẹo từ hạt đậu xanh 24 2.3.1.2 Phƣơng pháp đánh giá khả chịu nƣớc mô sẹo 26 2.3.1.2.1 Phƣơng pháp xử lý mô sẹo thổi khô 26 2.3.1.2.2 Chọn lọc mơ sẹo sống sót sau xử lý thổi khô tái sinh 26 2.3.1.2.3 Tạo hồn chỉnh từ mơ sẹo chọn lọc 27 2.3.1.2.4 Phƣơng pháp 27 2.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu đồng ruộng 28 2.3.3 Phƣơng pháp xử lý kết tính tốn số liệu 28 2.3.4 Phuơng pháp sinh học phân tử 28 2.3.4.1 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số từ đậu xanh 29 2.3.4.2 Phân tích đa hình ADN kĩ thuật RADP 29 2.3.4.3 Phân tích số liệu RADP 30 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 THĂM DÕ KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO VÀ TÁI SINH CÂY 31 3.2 ĐỘ MẤT NƢỚC VÀ KHẢ NĂNG CHỊU MẤT NƢỚC CỦA MÔ SẸO PHÔI CÁC GIỐNG ĐẬU XANH 31 3.2.1 Mức độ nƣớc mô sẹo sau xử lý thổi khô 32 3.2.2 Khả chịu nƣớc mô sẹo 33 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2.3 Khả tái sinh từ mơ sẹo sống sót sau xử lý thổi khô 34 3.2.4 Nhận xét khả chịu nƣớc xử lý thổi khô giống đậu xanh nghiên cứu 38 3.3 PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ BIẾN ĐỘNG DI TRUYỀN MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM NÔNG HỌC QUẦN THỂ R0, R1 38 3.4 ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI ADN GENOME CỦA MỘT SỐ DÕNG ĐẬU XANH CĨ NGUỒN GƠC TỪ MƠ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC 44 3.4.1 Kết tách chiết ADN tổng số 44 3.4.2 Phân tích đa hình ADN kỹ thuật RAPD 46 3.4.2.1 Số phân đoạn, tần số xuất đa hình phân đoạn ADN đƣợc nhân 46 3.4.2.2 So sánh khác dòng chọn lọc so với giống gốc mức độ phân tử 53 3.4.3 Nhận xét kết phân tích đa hình ADN hệ gen dòng đậu xanh nghiên cứu 55 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57 CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Cây đậu xanh (Mungbean, Green bean) có tên khoa học Vigna radiata (L.) Wilczek đóng vai trị quan trọng thứ ba sau đậu tương lạc (2 loại công nghiệp ngắn ngày) Theo Trung tâm Nghiên cứu Phát triển rau châu Á (AVRDC), phần ăn hạt đậu xanh chứa khoảng 25,98% protein, 1,3% lipit, 4,79% chất xơ, 64,12% hydratcacbon (trong có 51,8% tinh bột), loại vitamin A, B1, B2, C số nguyên tố khống K, Na, Mg, P, Fe, Ca….[9] Vì hạt đậu xanh sử dụng làm bột dinh dưỡng cho người thức ăn bổ sung cho gia súc Ngoài ra, hạt đậu xanh dùng rộng rãi nhân dân để làm thực phẩm loại bánh (bánh tét, bánh đậu xanh, bánh chưng ), chè, xôi, cháo Đặc biệt hạt đậu xanh dùng để ủ giá sử dụng nhiều nhân dân Không coi nguồn thức ăn mà hạt đậu xanh xem thứ dược liệu có tác dụng giải độc, nhiệt, bớt sưng phù, điều hòa ngũ tạng Giá đỗ thường dùng cho người bị viêm quản tiếng, vận động thể thao bị mỏi cơ, người béo phì, đái tháo đường, bệnh tim mạch, cao huyết áp, nhồi máu tim, cholesterol máu cao, muộn, dễ xảy thai … chữa bệnh cho người Ngoài ra, sản phẩm phụ dùng làm thức ăn cho gia súc Trồng đậu xanh cịn có tác dụng chống xói mịn cải tạo đất Chất lượng protein hạt đậu xanh đánh giá dựa tiêu quan trọng thành phần axit amin protein, họ đậu khác, protein hạt đậu xanh chứa đầy đủ loại axit amin không thay Nghiên cứu hàm lượng loại axit amin không thay loại axit amin giới hạn protein đạt tiêu chuẩn dinh dưỡng FAO/WHO hướng chiến lược chọn tạo giống đậu xanh chất lượng cao Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Cây đậu xanh thuộc nhóm trồng chịu hạn trung bình, chịu úng loại trồng có chín khơng tập trung gây khó khăn cho q trình thu hoạch Cùng với nguyên nhân khác nên đậu xanh trồng chưa nhiều nước ta, chủ yếu xen canh, luân canh tăng vụ Chỉ thời gian gần đậu xanh quan tâm phát triển Tuy nhiên, đậu xanh quan tâm trồng chủ yếu tỉnh miền núi, trung du phía Bắc Tây Ngun, nơi có khí hậu khắc nghiệt mà đặc biệt thời gian khô hạn kéo dài nên suất chưa cao Chương trình chọn tạo giống đậu xanh nước ta hướng tới mục tiêu tạo giống đậu xanh khơng có tiềm năng suất cao, ổn định, sinh trưởng mạnh, thời gian sinh trưởng ngắn mà cịn phải chín tập trung, chất lượng hạt cao, có khả chịu hạn, chịu úng, chịu sâu chống bệnh tốt Cho tới nay, việc ứng dụng công nghệ tế bào để nâng cao khả chống chịu trồng tiến hành đạt nhiều thành tựu đáng kể lúa, ngơ, đậu tương nhiên cơng trình tương tự đậu xanh cịn cơng bố Xuất phát từ lý trên, lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ là: "Tạo vật liệu phục vụ chọn dòng chịu hạn giống đậu xanh VN93 VC1973A kĩ thuật nuôi cấy in vitro" MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Tạọ dòng đậu xanh tái sinh từ mô sẹo chịu nước xác định thay đổi hệ gen dịng chọn lọc giống gốc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Mồi M7: Hình ảnh điện di thể rõ đa dình phân đoạn ADN mẫu nghiên cứu Trong phạm vi vùng phân tích từ 0.25 -1kb có băng vạch ADN nhân bản, có băng vạch cho tính đa hình chiếm 50% tổng số phân đoạn Cụ thể vị trí 1kb giống gốc không biểu băng vạch ADN, mẫu cò lại xuất băng vạch rõ nét Vị trí khoảng 0.98kb lại thấy xuất băng vạch mẫu D15 D20 mẫu cịn lại khơng xuất băng vạch Dịng D15 xuất phân đoạn ADN kích thước 0,4kb, khác biệt hoàn toàn so với giống gốc dịng cịn lại Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu đậu xanh với mồi M7 Mồi M8: Trong vùng phân tích từ 0,25 - 0,6kb thấy xuất 29 băng vạch ADN Trong xuất băng vạch ADN khác mẫu Cụ thể vị trí 0,83kb có dòng D2 xuất băng vạch, mẫu lại khơng xuất hiện; vị trí 0,25kb tất mẫu xuất băng vạch rõ nét giống gốc không xuất phân đoạn ADN vị trí này, tương tự vị trí khoảng 0,5kb dòng tạo từ giống gốc biểu phân đoạn ADN, cịn giống gốc khơng thấy xuất 49 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.15 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD mẫu đậu xanh với mồi M8 3.2.2.2 So sánh khác dòng chọn lọc so với giống gốc mức độ phân tử Từ kết phân tích hình ảnh điện di sản phẩm RAPD, thống kê băng điện di (xuất = 1, không xuất = 0) xử lý số liệu phân tích RAPD phần mềm NTSYSpc version 2.0i nhằm xác định khoảng cách di truyền mẫu đậu xanh nghiên cứu thông qua hệ số sai khác di truyền biểu đồ hình Kết xác định hệ số sai khác di truyền thể bảng 3.10 Kết phân tích cho thấy có sai khác di truyền dòng đậu xanh nghiên cứu so với gống gốc dao dộng từ 0,3276 – 0,4138 Dòng D32 có sai khác thấp so với giống gốc 0,3276, dịng D20 có sai khác lớn so với giống gốc 0,4310 Như dòng tạo thể mức độ sai khác so với giống gốc So sánh hệ số sai khác di truyền dòng cho thấy, khác biệt lớn tìm thấy dịng D2 D20, hai dịng D32 D40 có sai khác không lớn (0,1552) Như vậy, mẫu đậu xanh nghiên cứu có phân tách dòng tạo từ giống gốc, đồng thời dịng có 50 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn sai khác định Bảng 3.10 Hệ số sai khác di truyền dòng chọn lọc giống gốc Giống VC1973A VC1973A D2 0.3966 D32 0.3276 0.2413 D40 0.3793 0.2931 0.1552 D15 0.4138 0.3267 0.2241 0.2414 D20 0.4310 0.4138 0.2759 0.2931 0.2241 D2 D32 D40 D15 D20 Hình 3.16 Sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền dịng chọn lọc giống gốc Hình 3.16 cho thấy mức độ sai khác dòng giống gốc Các dịng có hệ số di truyền gần đuợc xếp vào nhóm, liên hệ nhóm thể rõ sơ đồ Sơ đồ hình cho thấy dịng 51 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn chọn lọc giống gốc chia làm hai nhóm - Nhóm thứ có giống gốc, điều chứng tỏ dịng tạo từ giống gốc có sai khác định so với giống gốc - Nhóm thứ hai gồm dòng chọn lọc (D2, D32, D40, D15, D20) có khoảng cách di truyền so với giống gốc 39% Nhóm thứ hai lại chia làm hai nhóm phụ Nhóm phụ I có dịng D20, nhóm phụ hai có dịng D2, D32, D40, D15, có khoảng cách di truyền so với dịng D20 (Nhóm phụ I) (1 – 0,675)= 0,325 (32,5%) Trong nhóm phụ II, dịng D32 D40 có hệ số tương đồng lớn (83%), sai khác với dòng D15 24,5% Ba dịng D32, D40, D15 có khoảng cách di truyền so với giống gốc 29% Từ phân tích trên, cho thấy dịng đậu xanh chọn lọc thể đa dạng di truyền rõ rệt so với giống gốc 3.2.3 Nhận xét kết phân tích đa hình ADN hệ gen dòng đậu xanh giống gốc VC1973A (1) Kết phân tích đa dạng di truyền mẫu đậu xanh thị RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên, có 7/10 mồi cho tính đa hình phân đoạn ADN nhân (2) Trong phạm vi vùng phân tích có 62 băng vạch phân đoạn ADN nhân bản, có 21 băng vạch cho tính đa hình (tương ứng 33,87%) Tổng số phân đoạn ADN thu mẫu đậu xanh phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên 307 Số lượng phân đoạn ADN nhân mồi dao động từ 22 - 41, cao mồi M10 thấp mồi M2 (3) Hệ số sai khác di truyền dịng phát sinh từ mơ sẹo chịu nước so với giống gốc từ 0,3276 đến 0,4310 So sánh hệ số sai khác di truyền 52 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn dòng cho thấy, khác biệt lớn tìm thấy dịng D2 D20 (4) Các dịng đậu xanh tạo từ mơ sẹo chịu nước giống đậu xanh VC1973A có thay đổi mức phân tử gen Khoảng cách di truyền dòng chọn lọc với giống gốc 39% (5) Kết hợp phân tích nơng học R1 phân tích RAPD kết chọn dòng D2, D15, D20, D40 biểu số đặc tính ưu việt để tiếp tục phân tích theo dõi hệ sau 3.3 ĐẶC ĐIỂM CỦA MỘT SỐ DÕNG ƢU VIỆT Dòng D2: Dòng D2 sau đưa từ mơi trường thích nghi khơng nhanh, sau thích nghi với mơi trường có biểu sinh trưởng tốt Những xuất phát từ hạt dịng D2 có thời gian sinh trưởng ngắn (60 ngày) có chiều cao thuộc nhóm đầu, xanh thẫm, to dài, thân mập, có màu xanh đậm Số cành hoa sớm, hoa màu vàng, sau ngày xuất quả, dòng D2 có đặc điểm chín sớm (35 ngày), ưu việt hẳn so với dòng khác giống đối chứng, nhiên ngắn, số lượng hạt/ thấp (6,2 hạt/quả) so với dòng khác Dòng D15: Dịng D15 sau đưa mơi trường thích nghi nhanh dịng khác, sau thích nghi với mơi trường dịng xuất Những xuất phát từ hạt dịng D15 có đặc điểm thân có màu xanh đậm, nhiên kích thước khơng lớn Dòng D15 tỏ ưu việt hẳn, cụ thể dịng D15 có số cành cành, chiều dài rễ 17,5cm, số lượng rễ 16,8, lớn hẳn so với dòng khác, dòng D15 thời gian hoa sớm nhất, chậm dòng khoảng ngày Về số quả/ cây, số chắc/ cây, số hạt/cây dòng D15 cho kết tương đối cao Đây dịng có nhiều đặc điểm trội, cần 53 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn sâu, phân tích để xác định sở di truyền đặc tính ưu việt Dịng D20: Đây dịng có đặc điểm bật thấp cứng hẳn so với dòng khác, nhờ đặc điểm mà dịng D20 có khả chống chịu tốt với mưa, gió, khơng bị giập, gãy đổ Dịng D20 có chiều cao 33,5cm, số cành/cây 7, nhiều Số lượng hạt/quả kích thước mức trung bình Cây sinh trưởng phát triển tốt Thời gian hoa, kết tương tự giống gốc Dòng D40: Dòng D40 R0 dịng có sinh trưởng khơng nhanh, xuất phát từ hạt dòng D40 với dòng D15 tỏ ưu việt hẳn số quả/ cây, số chắc/ cây, số hạt/ cây, cụ thể số quả/cây 42, số chắc/cây 30, số hạt/quả trung bình 13,7 Đặc biệt thời gian hoa, so với dòng khác dịng D40 có thời gian hoa dài dòng khác gần tương đương với giống đối chứng nhiên hoa muộn cho nhỏ với tỷ lệ hạt lép cao Đặc biệt dịng D40 qua quan sát chúng tơi nhận thấy điều kiện khơ hạn có biểu sinh trưởng bình thường Tuy nhiên để khẳng định dịng D40 có khả chịu hạn tốt hay khơng cần theo dõi, đánh giá qua nhiều hệ có nghiên cứu sâu mức sinh học phân tử kết luận 54 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.17 Các dịng đậu xanh ưu việt R1 55 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Cả hai giống đậu xanh nghiên cứu VN 93-1, VC 1973A có khả tạo mơ sẹo tái sinh Các dịng mơ sẹo sống sót sau xử lý kỹ thuật thổi khơ có khả tái sinh cao Ngưỡng chọn dòng chịu hạn giống phụ thuộc vào khả chịu nước mô sẹo giống Xác định đối tượng chọn dòng giống đậu xanh VC1973A với ngưỡng xử lý thối khô 5giờ Kết thu 160 dịng mơ có khả chịu nước 117 xanh hai giống đậu xanh phục vụ cho nghiên cứu Trong giống VC1973A có 47 dịng tái sinh ngưỡng thổi khô Quần thể R0, R1 có mức độ biến động cao nhiều tính trạng nơng học, đặc biệt quần thể R0 Ở hệ R1 chọn dòng (dịng D2, D15, D20, D40) biểu số tính trạng tốt thấp, chắc, chín sớm, thời gian sinh trưởng ngắn, nhiều nhiều hạt chắc/quả Sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên xác định 7/10 mồi cho tính đa hình phân đoạn ADN nhân Hệ số sai khác di truyền dòng chịu nước so với giống gốc từ 0,3276- 0,4310, khác biệt lớn tìm thấy dịng D2 dịng D20 Các dòng chọn lọc (D2, D15, D20, D32, D40) có thay đổi cấu trúc hệ gen so với giống gốc Khoảng cách di truyền dòng chọn lọc so với giống gốc 39% Đề nghị Cần tiếp tục theo dõi, phân tích dịng thu (đặc biệt dòng D2, D15, D20 D40) hệ đặc điểm nơng học, hóa sinh, khả chịu hạn để chọn dòng triển vọng làm vật liệu phục vụ chọn 56 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn giống đậu xanh theo hướng tăng cường khả chịu hạn CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Tạo vật liệu phục vụ chọn dòng chịu hạn hai giống đậu xanh VN93 – VC1973A kỹ thuật ni cấy in vitro Tạp chí khoa học cơng nghệ – Đại học Thái Nguyên, 2010, 68 (6): 76 – 82 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình , Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội Đỗ Thị Dương (2001), Nghiên cưu môt sô đăc điêm hì nh thai , sinh ly va ́ ̣ ́ ̣ ̉ ́ ́ ̀ hóa sinh giơng lua can đị a phương , Luân văn thac sĩ Sinh hoc , Đai ́ ́ ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ học Thái Nguyên Vũ Thị Anh Đào (2009), Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống đậu tương địa phương, Luận văn Thạc sĩ Sinh học Nguyễn Thu Giang (2008), Đánh giá khả chịu hạn tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn từ giống lạc L08, L23, L24, LTB, LCB, LBK ký thuật nuôi cấy In Vitro, Luận văn Thạc sĩ Sinh học Nguyễn Thị Thu Hoài (2005), Nghiên cứu khả chịu hạn mối quan hệ di truyền số giống lúa cạn địa phương, Luận văn Thạc sĩ sinh học Nguyễn Thị Thuý Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “Phát triển hệ thống tái sinh in vitro đậu tương (Glycine max (L.) Merill) phục vụ chuyển gen” Tạp chí Khoa học&Công nghệ-Đại học Thái Nguyên, 52(4): 82-88] Ngô Thị Liêm (2006), Nghiên cứu đa dạng di truyền khả chịu hạn số giống lạc, Luận văn Thạc sĩ Sinh học Nguyễn Hồng Lơc (1992), Chọn dòng chịu muối NaCl chịu nước ̣ thuôc la (Nicotiana Tabacum.L), Luân an tiên sĩ Sinh hoc , Viên Công ́ ́ ̣ ́ ́ ́ ̣ ̣ 58 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn nghê Sinh hoc Ha Nơi ̣ ̣ ̀ ̣ Trần Đình Long, Lê Khả Tường, Cây đậu xanh, Nxb Nông nghiệp, 1998 10 Nguyễn Thị Luyện (2009), Phát triển hệ thống tái sinh đậu xanh phục vụ cho chọn dòng chịu hạn chuyển gen, Luận văn Thạc sĩ sinh học 11 Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học sinh học, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội 12 Chu Hồng Mậu, Ngơ Thị Liêm, Nguyễn Thị Tâm (2006), “ Đánh giá khả chịu hạn số giống lạc kĩ thuật nuôi cấy in vitro”, Hội nghị khoa học Cơng nghệ tồn quốc 2006, Nxb KH&KT, trang 202 – 209 13 Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dịng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án Tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội, trang – 35 14 Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội 15 Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả chịu nóng chọn dịng chịu nóng lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà nội 16 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hóa sinh hạt tính đa dạng di truyền số giống đậu xanh có khả chịu hạn khác nhau, Luận văn Thạc sĩ sinh học 17 Nguyên Vu T hanh Thanh , Chu Hoàng Mậu , Lê Trân Bì nh ̃ ̃ ̀ (2006), 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn “Nghiên cưu đa dang di truyên cua môt sô giông đâu xanh chị u han băng ́ ̣ ̀ ̉ ̣ ́ ́ ̣ ̣ ̀ thị SSR RAPD” , Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 4(1), trang 99- 106 18 Bùi Thị Thu Thủy (2006), Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn số giống lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận văn Thạc sĩ Sinh học 19 Mai Trường, Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Văn Uyển (2001), “Hệ thống tái sinh đậu xanh từ cuống tử điệp ni cấy in vitro” Tạp chí sinh học, (23), trang 33-35 20 Nguyễn Văn Vinh, Lê Duy Thành, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1995), “Nghiên cứu khả chịu nhôm acid giống lúa DDC3, CM10, Pokaly, Cườm, Chiêm Bầu, C202, NN08, OM861 – 20, OM296 Tép lai”, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, (4), trang 23 – 26 Tài liệu tiếng Anh 21 Adkins S M., Shiraishi T., Kunavuvatchaidach R.,Godwin I D (1995), “Somaclonal variation in rice drought – tolerance and other agronomic characters”, Aust J Bot, 4, pp: 201 – 209 22 Afzal M.A., Moynol Hoque M., and Shar mugasun daram S (2004), “Random Amplified Polymorphu DNA (RAPD) Analysis of selected mungbean [Vigna radiata (L) Wilczek] Cultivars”, Asian Journal of sciences, 3(1), : 20 – 24 23 Aral B., Schlinzig J.S., Liu G, Kamoun P (1996), “Dutabase cloning of human deltal1 – pyrroline- 5- cacboxylate synthetase(P5CS) cDNA: a bifuntional enzyme cactalyzing the first steps in proline biosynthesis”, C.R.Acad Sci Paris, 319: 171- 178 24 Dinh Thi Phong, Le Thi Muoi, Le Tran Binh (2001), RAPD variabilityin 60 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn rice (Oryza sativa L.) plánt derived from desiscation - tolerance calli, Euphytica 00, pp : 1- 25 Ignacimuthu S & Franklin G (1999), “Regeneration of plantlets from cotyledon and embryonal axis explants of Vigna mungo L Hepper”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 55: 75–78 26 Jayanti Sen & Spra Guha Mukherjee (1998), “In vitro intoduction of multiple shoots and plant regeneration in Vigna, In vitro Cell.Dev Biol plant, 34: 276 – 280 27 Kaviraj C.P., G Kiran, R.B Venugopan, P.B.Kavi Kishor, Srinath Rao (2006), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from cotyredorary explants of green gram (Vigna radiata (L.) Wilczek)- A recalcitrant grain legume” In vitro Cell.Der Biol plant 42: 134 – 138 28 K Ramakrishnan · R Gnanam ax P Sivakumar A Manickam, “In vitro somatic embryogenesis from cell suspension cultures of cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp)”, Plant Cell Rep (2005) 24: 449–461 29 Lanham PG, Fennell S, Moss JP, Powell W (1992), “Detection of polymorphic loci in Arachis germplasm using radom amplified polymorphic DNAs”, Genome, 35 (5) :885-890 30 Lal G., Kim D., Shanmugasundaram S and T Kalb, (2005) Suggested Cultural Practices Guide for Mungbean Asian Vegetable Research and Development Center, Taiwan http://www.avrdc.org.tw 31 Moretzsohn MC, Hopkins MS, Mitchell SE, Kresovich S, Valls JF, Ferreira ME (2004), “Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L ) and its wild relatives based on the analysis of hypervariable regions of the genome”, Plant Mol Biol, 4(1) :11 61 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 32.Muruganantham M., Amutha S.,Selvaraj N., Vengadesan G., Ganapathi A (2007), “Efficient Agrobacterium- ediated transformation of Vigna mungo using immature cotyledonary-node explants and phosphinothricin as the selection agent” In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant, 43:550–557 33 Mundy J., Chua N H (1988), Abcisis and water stress induce the expression of a novel rice gene”, EMBOJ, 8, pp 2279 – 2286 34 Renato A Avenido & Kazumi Hattori (1999), “Differences in shoot regeneration response from cotyledonary node explants in Asiatic Vigna species support genomic grouping within subgenus Ceratotropis (Piper) Verdc.” Plant Cell, Tissue and Organ Culture 58: 99–110 35 Rudrabhatla Sairam, Siva Chennareddy, Madasamy Parani, Shulu Zhang, Diaa Al-abed, Wissam Abou-Alaiw, and Stephen Goldman (2005), “Obpc symposium: Maize 2004 & beyond – plant regeneration, gene discovery, and genetic engineering of plants for crop improvement” In Vitro Cell Dev Biol.-Plant, 41:411–423 36 Sita L Mahala, T Leela, B Kiran Kumar, B Naresh, Prathibha Devi (2006), “In vitro plant regeneration from the petioles of primary leaves of mungbean (Vigna radiata L.)” Plant Biotechnology, 23: 409–411 37 Sonia, Raman Saini, Rana P Singh, Pawan K Jaiwal (2007), “Agrobacterium tumefaciens mediated transfer of Phaseolusvulgaris amylase inhibitor-1 gene into mungbean (Vigna radiata (L.)Wilczek) using bar as selectable marker” Plant Cell Rep 26:187–198 38 Subramanion V, Gurtu S, Nageswara Rao RC, Nigam SN (2000), “Identification of DNA polymoraphism in cultivated groundnut using random amplified polymoraphic DNA (RAPD) assay”, Genome, 43 (4): 62 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 656 – 660 39 Prem R anand, Ganapathi A., Ramesh V Anbazhagan, Gengadesan G., and Selvaraj N (2001), “High frequency plant regeneration via somatic embryogenesis in cell suspension cultures of cowpea, vigna unguiculata (L.) walp” In Vitro Cell Dev Biol-Plant, 36:475-480 40 Verma D.P.S., Hu C.A.A., Delauney A.J., Miao G.H, Hong (1992), “Deciphering proline biosynthesis pathway in plants by direct, trans-, cocomplementation in bacteria In “Biosynthesis and Molecular Regulation of Amini Acid in Plants (BK Singh, HE Flores, JC Shannon eds)”, American Society of Plant Physiologists, Warely Press, Baltimeore MD, pp 128-138 41 Vierling R., Nguyen H J (1992), “Use of RAPD marker to determine the genetic relationships of diploid wheat genotype”, Theor Appl Genet, 84: 835-838 42 Welsh J., McCleland M (1990), “ Fingeprinting genomic using PCR with arbitrary primer”, Nucleic Acids Res, 18, pp 7213 – 7218 43 Wiliam J G K., Kubelik A E., Levak K J., Rafalski J A., Tingey S V., (1990), “DNA polimorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic merers”, Nucleic Acids Res, 18, pp 6531 – 6535 63 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... tương tự đậu xanh cịn cơng bố Xuất phát từ lý trên, lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ là: "Tạo vật liệu phục vụ chọn dòng chịu hạn giống đậu xanh VN93 VC1973A kĩ thuật nuôi cấy in vitro" MỤC... thực vật 1. 2.2 Cơ sở sinh lý, hoá sinh sinh học phân tử tính chịu hạn 12 1. 2.2 .1 Cơ sở sinh lý tính chịu hạn 12 1. 2.2.2 Cơ sở sinh hố tính chịu hạn 13 1. 2.2.3 Cơ chế... 1. 2 Hạn chế chịu hạn thực vật 1. 2 .1 Tính chịu hạn tác động hạn đến thực vật 1. 2 .1. 1 Tính chịu hạn thực vật 1. 2 .1. 2 Nguyên nhân gây hạn tác động hạn đến thực vật