3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3.4.1. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số từ lá cây đậu xanh
- Quy trình tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ lá đậu xanh theo phương pháp của Gawel và cs(1991)
- Kiểm tra chất lượng ADN thu được thông qua điện di trên gel agarose 0,8%.
- Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của ADN trên máy quang phổ Biomate3 ở bước sóng 260nm/280nm. Nồng độ ADN trong dung dịch tách chiết được tính theo công thức:
Nồng độ ADN (ng/µl) = OD260 × 50 × HSPL (2.5) Độ sạch ADN = OD260 / OD280 (2.6) HSPL: Hệ số pha loãng
50: Hằng số
OD260: Chỉ số đo được ở bước sóng 260nm OD280 : Chỉ số đo dược ở bước sóng 280nm
2.3.4.2. Phân tích đa hình ADN bằng kĩ thuật RAPD
Phản ứng RAPD được tiến hành với 10 mồi ngẫu nhiên được tổng hợp bởi hãng Invitrogen, các mồi có trình tự dài 10 nucleotit, thông tin về trình tự
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
24
các mồi được trình bày ở bảng 2.1.
Phản ứng RAPD được tiến hành theo phương pháp của William và CS (1990) [55]. Phản ứng RAPD được thực hiện trong 25µl dung dịch chứa 12,5µl đệm PCR matermix + 1µl mồi + 1 µl DNA khuôn (50ng/ µl) +9,05 µl H2O. Phản ứng RAPD được tiến hành trên máy PCR Amplied Bio Systems (USA/ Singpore).
Điện di ADN tổng số và sản phẩm RAPD trên gel agarose 0,8% và 1,5%, nhuộm Ethiđium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel.
2.3.4.3. Phân tích số liệu RAPD
Bảng 2.2. Trình tự các nucleotit của 10 mồi RAPD được sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi M1 5’ AACCGACGGG 3’ M6 5’ GTGTCTCAGG 3’
M2 5’ GGGGGTCGTT 3’ M7 5’ CAGCACCCAC 3’
M3 5’ TACCACCCCG 3’ M8 5’ GGAAGTCGCC 3’
M4 5’ GGCGGACTGT 3’ M9 5’ CCTCAGTGTA 3’
M5 5’ TCGGCGATAG 3’ M10 5’ CTATGCCGAC 3’ Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn ADN khi điện di sản phẩm RAPD của các dòng chọn lọc với các mồi ngẫu nhiên để làm cơ sở cho phân tích số liệu. Tiêu chuẩn hóa sản phẩm RAPD theo qui ước:
Số 1: xuất hiện các phân đoạn ADN Số 0: không xuất hiện phân đoạn ADN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
25
Các số liệu này được xử lý trên máy tính bằng chương trình NTSYpc version 2.0 (Applied Biostatistisc Inc., USA., 1998), để lập ra biểu đồ so sánh sự khác nhau giữa dòng chọn lọc so với giống gốc ở mức độ phân tử.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
26
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ CHỌN DÕNG CHỊU HẠN Ở HAI GIỐNG ĐẬU XANH NGHIÊN CỨU
3.1.1. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của hai giống đậu xanh
Khả năng tạo mô sẹo được đánh giá sau 10 ngày nuôi cấy. Sau 10 ngày nuôi cấy mô sẹo được cắt nhỏ với kích thước 3 mm2
và cấy trên môi trường tái sinh. Khả năng tái sinh được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy.
Kết quả cho thấy, cả 2 giống đậu xanh đều có khả năng tạo mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy và tỷ lệ tạo mô sẹo của các giống khá cao từ 86,36% - 95,67%, trong đó tỷ lệ tạo mô sẹo của giống VN 93-1 là 86,36%; còn giống VC 1973A là 95,67%. Tỷ lệ tái sinh lại thấp hơn rất nhiều, dao động từ 12,54% - 18,32%. Trong đó giống VN 93-1 có tỷ lệ tái sinh cao nhất là 18,32%. Giống VN 93-1 có tỷ lệ tạo mô sẹo thấp hơn nhưng tỷ lệ tái sinh lại cao hơn so với giống VC – 1973A.
Mô sẹo của hai giống đậu xanh có màu vàng trắng, mô sẹo cứng và khô có khả năng tái sinh cao hơn so với những mô có màu nâu đen, mô sẹo mọng nước. Chúng tôi nhận thấy rằng khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo phụ thuộc vào kiểu gen của từng giống [12], [15].
3.1.2. Độ mất nƣớc và khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo phôi các giống đậu xanh
Để xây dựng quy trình chọn dòng chịu hạn, chúng tôi đã xác định ngưỡng chịu hạn của mô sẹo. Khi tiến hành xác định khả năng chịu hạn của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
27
các giống ở mức độ mô sẹo thông qua các chỉ tiêu về mức độ mất nước, khả năng chịu mất nước và tái sinh cây của mô sẹo sau khi xử lý bằng kỹ thuật thổi khô mô sẹo với các ngưỡng 0, 3, 5, 7, 9, 11 giờ liên tục.
3.1.2.1. Mức độ mất nƣớc của mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô
Để chọn ra các dòng tế bào có khả năng chịu mất nước, các nhà khoa học tiến hành cho các tế bào mô sẹo bị mất nước lý học bằng luồng khí vô trùng của buồng cấy. Ở các ngưỡng thời gian là 0, 3, 5, 7, 9, 11 giờ liên tục, lượng nước trong mô giảm dần tới mức không thể bay hơi được nữa.
Kết quả xác định khả năng chịu mất nước của mô sẹo dưới tác động của thổi khô đối với các giống VN93-1; VC1973A ở các ngưỡng thời gian là 0, 3, 5, 7, 9,11 giờ liên tục được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô (% khối lượng tươi)
Giống 0 giờ 3 giờ 5 giờ 7 giờ 9 giờ 11 giờ
VN93-1 0,00 45,84 70,28 82,75 91,79 98,32 VC1973A 0,00 50,62 78,15 85,44 94,19 95,84
Độ mất nước của mô tăng theo thời gian thổi khô ở tất cả các giống. Ở các ngưỡng xử lý từ 3 giờ đến 9 giờ, giống VC1973A đều có mức độ mất nước cao hơn giống VN93-1. Tuy nhiên, ở ngưỡng 11 giờ thổi khô mức độ mất nước của mô sẹo giống VN93-1 là 98,32% cao hơn so với giống VC1973A (95,84%). Sự khác biệt này có thể do mô sẹo giống VC1973A chứa hàm lượng chất khô lớn hơn. Mức độ mất nước cao nhất ở ngưỡng xử lý 3 giờ và 5 giờ. Ở các ngưỡng thổi khô 7 giờ, 9 giờ, 11 giờ, độ mất nước của mô giảm dần. Nhìn chung, tốc độ mất nước giữa các giống không có sự sai khác đáng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
28
kể. Kết quả của chúng tôi phù hợp với nhận xét của các tác giả khi chọn dòng tế bào chịu thổi khô ở lúa, ở lạc [4], [7], [10], [15], [18].
0 20 40 60 80 100 120 0 3 5 7 9 11
Thời gian thổi khô (Giờ)
Tỷ lệ m ất nƣ ớc (%) VN93-1 VC1973A
Hình 3.1. Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau xử lý bằng thổi khô
3.1.2.2. Khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo
Tỷ lệ sống sót của mô sẹo phôi đậu xanh được đánh giá sau khi nuôi phục hồi 1 tuần. Quan sát khả năng phục hồi mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lí bằng thổi khô được cấy lên môi trường tái sinh chúng tôi thấy, sau 2-3 ngày những mô sẹo sống sót đã hút nước và sinh trưởng bình thường. Những mô sống sót có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, sau 1 tuần kích thước mô sẹo đã lớn hơn khối mô trước khi xử lý. Những mô bị chết có màu đen hoặc trắng, kích thước không thay đổi. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo các giống sau khi xử lý bằng thổi khô được thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.2.
Kết quả hình 3.2 và hình 3.2 cho thấy, Tỉ lệ sống sót của mô sẹo tỷ lệ nghịch với thời gian xử lí, thời gian xử lý càng dài tỷ lệ sống sót của mô sẹo càng giảm Sau 3, 5, 7, 9, 11 giờ thổi khô, tỷ lệ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót của giống VN93- 1 lớn hơn giống VC1973A. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau khi xử lý bằng kỹ thuật thổi khô giảm nhanh ở ngưỡng 9 giờ và 11 giờ thổi khô. Ở ngưỡng 11 giờ, khả năng sống sót của giống VN93- 1 là 5,38%
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
29
trong khi giống VC1973A không có khối mô nào sống sót.
Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô 1 tuần nuôi phục hồi
Giống 0 giờ 3 giờ 5 giờ 7 giờ 9 giờ 11 giờ
VN93-1 95,20 80,64 80,12 50,74 23,76 5,38 VC1973A 98,35 70,43 55,27 24,64 10,42 0,00 0 20 40 60 80 100 120 0 3 5 7 9 11
Thời gian thổi khô (Giờ)
T ỷ lệ số n g só t (%) VN93-1 VC1973A
Hình 3.2. Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô và nuôi phục hồi trên môi trường tái sinh
Như vậy cùng một mức độ mất nước như nhau nhưng khả năng chịu đựng của mô sẹo có sự khác nhau rõ rệt giữa các giống nghiên cứu. Ở ngưỡng xử lý 7, 9 giờ thổi khô mức độ mất nước của các giống chỉ dao động chênh lệch nhau khoảng 4 - 5% nhưng tỷ lệ sống sót của mô sẹo dao động từ 10,42% - 23,75% (chênh lệch từ 13% đến 25%).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
30
3.1.2.3. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo sống sót sau thổi khô
Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh cây của các giống đậu xanh nghiên cứu sau 3 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.3. Kết quả ở bảng 3.3 và hình 3.3 cho thấy, các giống đậu xanh nghiên cứu đều có khả năng tái sinh sau 3 tuần nuôi cấy. Ở ngưỡng xử lí bằng thổi khô 3 giờ, các giống đậu xanh đều có khả năng tái sinh cao và thời gian xử lí càng cao thì tỷ lệ tái sinh càng giảm, giống VN93 -1 có tỷ lệ tái sinh cây là 63,40% cao hơn giống VC1973A có tỷ lệ tái sinh thấp là 46,55%. Qua các ngưỡng xử lý, giống VN93 -1 đều có tỷ lệ tái sinh cây cao hơn giống VC1973A. Ở ngưỡng 11 giờ thổi khô, cả hai giống nghiên cứu đều không tái sinh cây. Từ ngưỡng 5 giờ thổi khô đến 11 giờ thổi khô, khả năng tái sinh cây của giống VC1973A giảm nhanh, từ 46,55% ở 3 giờ còn 20,98 sau 5 giờ, đặc biệt sau 9 giờ thổi khô chỉ có 4,32% mô tái sinh. Kết quả cho thấy, hầu hết mô của các giống qua xử lý mất nước khi sống sót, thường có khả năng tái sinh cao hơn so với đối chứng không bị xử lý bằng thổi khô. Theo Lê Trần Bình và đồng tác giả (1998) nguyên nhân là do khi xử lý bằng thổi khô, những tế bào mẫn cảm đã bị giết chết, chọn ra những tế bào có sức sống và khả năng tái sinh cao hơn [1], [8]. Như vậy khả năng tái sinh không chỉ phụ thuộc vào kiểu gen mà còn phụ thuộc vào thời gian xử lý thổi khô mô sẹo. Hiện tượng này cũng được phát hiện khi xử lý mất nước ở một số đối tượng cây khác như ở thuốc lá, lúa, lạc, đậu tương...
Từ các nghiên cứu khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm và đánh giá khả năng chịu hạn của các giống ở mức độ mô sẹo, chúng tôi thấy giống VN93 -1 có khả năng chịu hạn tốt hơn, chịu hạn kém hơn là giống VC1973A, nhưng giống VC1973A lại có chất lượng hạt tốt. Vì vậy cải tạo giống VC1973A theo hướng nâng cao khả năng chịu hạn, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu chọn dòng chịu hạn ở giống đậu xanh VC1973A. Thông qua theo dõi tỷ lệ sống sót và tỷ lệ tái sinh cây của mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
31
thổi khô, chúng tôi đã xác định được ngưỡng chọn dòng tế bào chịu mất nước ở giống đậu xanh VC1973A là xử lý thổi khô 5 giờ với tỷ lệ mô sống sót là 55,27%, tỷ lệ tái sinh cây của mô sẹo sống sót sau khi xử lý là 20,98%.
Bảng 3.3. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 3 5 7 9 11
Thời gian thổi khô (Giờ)
Kh ả n ăn g tá i si n h ( %) VN93-1 VC1973A
Hình 3.3. Khả năng tái sinh cây của các mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô
Từ kết quả thực nghiệm chúng tôi đã thu được 160 dòng mô có khả năng chịu mất nước và 117 cây xanh của hai giống đậu xanh phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Trong đó giống VC1973A có 47 dòng cây tái sinh ở ngưỡng thổi khô 5 giờ.
Giống 0 giờ 3 giờ 5 giờ 7 giờ 9 giờ 11 giờ
VN93-1 70,63 63,40 50,16 21,12 15,75 0
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
32
A B
Hình 3.4. Ảnh mô sẹo khi xử lý bằng thổi khô (giống VC1973A) A. Thổi khô 5 giờ B. Sau 3 ngày cấy tái sinh (thổi khô 5 giờ)
A B C
Hình 3. 5. Một số hình ảnh cây tái sinh sau khi xử lý bằng thổi khô (giống VC1973A)
A. Sau 2 tuần
B. Sau 3 tuần ở môi trường kéo dài chồi C. Sau 7 tuần
3.1.2.4. Nhận xét về khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo xử lý thổi khô của các giống đậu xanh nghiên cứu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
33
(1) Mô sẹo của hai giống đậu xanh nghiên cứu đều có khả năng chịu mất nướckhi xử lý bằng thổi khô và có biểu hiện khác nhau giữa các giống. Những mô sẹo sống sót đều có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
(2) Kết quả chọn dòng mô sẹo đã thu được 160 dòng mô chịu mất nước và 117 cây xanh của hai giống đậu xanh. Trong đó giống VC1973A có 47 dòng cây tái sinh ở ngưỡng thổi khô 5 giờ. Đây là nguồn vật liệu phong phú cho chọn dòng chịu hạn ở cây đậu xanh tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước.
3.1.3. Phân tích mức độ biến động di truyền của một số đặc điểm nông học ở quần thể R0, R1
Cây tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước của giống VC1973A được chuyển vào môi trường tạo rễ, khi rễ dài từ 3 – 4 cm cấy chuyển trồng ngoài đồng ruộng trong vụ xuân 2010. Tiến hành chăm sóc các dòng cây có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước và đối chứng trong điều kiện như nhau về thổ nhưỡng, chế độ chăm sóc, dinh dưỡng. Kết quả nghiên cứu ngoài đồng ruộng cho thấy, có sự sai khác về các đặc điểm nông học giữa các dòng chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước so với giống gốc và giữa các dòng chọn lọc với nhau. Trong đó sự sai khác giữa các dòng chịu hạn với giống gốc là đáng kể, sự biến thiên giữa các dòng chịu hạn là tương đối sát nhau.
Sự sai khác về các đặc điểm như thời gian sinh trưởng và phát dục, số cành/cây, số quả/cây, kích thước quả, kích thước lá, chiều dài rễ, số lượng rễ... được trình bày trong bảng 3.4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
34
Bảng 3.4 Mức biến động di truyền quần thể R0, R1 của giống đậu xanh VC1973A
STT Chỉ tiêu theo dõi
Quần thể R0 Quần thể R1 Quần thể VC1973A đối chứng X CV % X CV % X CV % 1 Số cành/cây 2, 35 58.72 5, 98 13,36 6, 17 10,2 2 Số quả/cây 10, 5 80,12 30,67 6,72 35,12 7,85 3 Số quả chắc/cây 8,53 76,39 22,61 8,37 25,16 6,68 4 Số hạt/quả 8,45 43,28 12, 4 10,31 13,03 11, 62 5 Ch. dài quả (cm) 5,36 20,58 9,76 9,42 9,34 7,83 6 Số lượng rễ 5, 26 56,21 14, 69 7,86 13, 22 6,84 7 Chiều dài rễ (cm) 5,13 60,73 16, 38 3,60 15,84 5,95
Thời gian sinh trƣởng và phát dục
Thời gian sinh trưởng của cây đậu xanh được chia làm 4 thời kỳ: mọc mầm, cây non, ra hoa và kết quả. Các số liệu được trình bày trong bảng 3.5.
Thời gian sinh trưởng và phát dục của cây được tính từ khi gieo hạt (Ngày sau gieo: NSG) trong điều kiện kỹ thuật canh tác như nhau. Số liệu thống kê cho thấy quần thể R1 có thời gian sinh trưởng và phát dục ngắn